58
SENYAWA FITOALEKSIN DARI TUMBUHAN OBAT INDONESIA
“DEKAR”,
Caesalpinia major (FABACEAE)
Partomuan Simanjuntak
Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jakarta
Abstract
Some furan diterpene type compounds have been isolated and elucidated as caesaldekarin a, b, c, d, e and f from Caesalpinia major. Recently, a phytoalexin compound, 12-oxy-7-oxo-sandaracopymaradiene has been isolated and identified from the same plant. The structure was elucidated based on interpretation by infrared, nuclear magnetic resonance (1H-NMR, 13C-NMR) and two-dimensional NMR (1H-1H COSY and 13C-1H COSY) and mass spectroscopy.
Key words: Indonesian medicinal plant; Phytoalexin; 12-oxy-7-oxosandaracopy- maradiene;
Caesalpinia major; Fabaceae PENDAHULUAN
Fitoaleksin “Phytoalexin” didefinisikan sebagai senyawa kimia yang mempunyai berat molekul rendah yang memiliki sifat antimikroba atau antiparasit. Senyawa ini diproduksi oleh tanaman pada waktu mengalami infeksi atau cengkraman (stress) lingkungan.
Senyawa fitoaleksin seperti orizaleksin A, B, dan C telah berhasil diisolasi dan dielusidasi struktur kimianya dari daun Pyricularia oryzae yang terinfeksi (2,6).
Substansi fitoaleksin lainnya dari tumbuhan
P. oryzae yang pernah diteliti adalah momilakton A dan B. Senyawa kimia ini dapat terjadi sebagai fitoaleksin dalam coleoptile beras yang teriradiasi oleh ultra-violet (1).
Fitoaleksin yang merupakan hasil dari metabolisme sekunder, mempunyai struktur kimia yang bermacam-macam tergantung pada species tanaman yang mensintesisnya. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaporkan, senyawa fitoaleksin dapat diidentifikasi menurut penggolongan senyawanya, misalnya Leguminosae membentuk fitoaleksin yang berupa golongan senyawa isoflavonoid, famili terong-terongan menghasilkan senyawa seskuiterpen, sedangkan dari famili Compositae membentuk poliasetilen dan lain-lain.
Dari tumbuhan famili Fabaceae yaitu tanaman Caesalpinia major, yang dalam tulisan ini akan dilaporkan bahwa senyawa fitoaleksin yang terisolasi dan teridentifikasi adalah merupakan senyawa golongan diterpen.
Caesalpinia major Dandy ex Excel (Fabaceae) adalah suatu tumbuhan memanjat yang banyak terdapat di hutan dan di pinggir-pinggir sungai. Tumbuhan ini di Ruteng, Pulau Flores, Nusa Tenggara Timur secara tradisional digunakan sebagai
obat kuat (tonikum), antelmentik dan juga untuk menyembuhkan sakit pinggang (3).
Dari penelitian sebelumnya telah dilaporkan bahwa dari tumbuhan “Dekar” (nama daerah),
Caesalpinia major telah berhasil diisolasi dan dielusidasi enam senyawa kimia diterpen tipe kasan yaitu caesaldekarin a (1), b (2), c (3), d (4), e (5) dan caesaldekarin f (6) (4,5,7). Dalam tulisan ini akan dilaporkan bahwa selain senyawa kimia tersebut di atas, juga mengandung suatu senyawa kimia fitoaleksin yang dinamakan sebagai 12-oksi-7-okso-sandarakopimaradiena (7). Hasil reaksi pengubahan “conversion reaction” senyawa 7 dalam bentuk reaksi asetilasi dan reaksi hidrogenasi juga akan dilaporkan.
BAHAN DAN METODE Bahan.
Simplisia akar “Dekar”, Caesalpinia major dalam penelitian ini dikumpulkan dari Desa Ruteng, Pulau Flores, Nusa Tenggara Timur. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor dan spesimennya disimpan di Herbarium tersebut. Pelarut-pelarut kimia seperti metanol, n-heksan, etil asetat adalah kualitas teknis yang digunakan hanya untuk pelarut dalam mengekstraksi, pelarut pengembang (eluen) pada kromatografi lapis tipis (KLT) dan untuk kromatografi kolom, sedangkan untuk kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) digunakan pelarut kualitas HPLC grade (Lichrosolv).
Bahan kimia seperti dimetilaminopiridin (DMAP) yang digunakan sebagai katalisator dalam reaksi esterifikasi, asam asetat anhidrid yang digunakan untuk reaksi asetilasi, dan natrium boronhidrida (NaBH4) yang digunakan sebagai
reduktor dalam reaksi hidrogenasi yang semuanya merupakan bahan kimia produksi dari Sigma Co.
59
Instrumentasi.
Data-data spektra dalam elusidasi struktur kimia diperoleh dengan menggunakan spektrometer Hitachi 330 untuk pengambilan data spektra ultra
violet, spektrometer JASCO FT/IR untuk
pengambilan data spektra infra merah, spektrometer JMS HX-100 untuk pengambilan data spektra massa (FAB-MS), Spektrometer NMR JEOL EX-270, dan
NMR GX-500 untuk pengambilan data spektra satu dimensi resonansi magnet inti (RMI proton dan
13
Karbon), dan dua dimensi seperti 1H-1H COSY,
13
C-1H COSY. Pemurnian senyawa kimia dilakukan pada alat HPLC Hitachi L-4200 UV/VIS Detektor dengan pompa Shimadzu LC-6A, dan kolom Zorbax Sil (7,5 x 30 mm). O OH H H OR O H3COOC OH H H O OH H H OH O OH OAc AcO O OH H H Caesaldekarin a, R=Ac (1) Caesaldekarin b, R=H (2) Caesaldekarin c (3) Caesaldekarin d (4) Caesaldekarin e (5) Caesaldekarin f (6) H H O OH 1 10 11 20 15 16 12-oksi-7-okso-sandara kopimaradiena (7)
Gambar 1. Senyawa Kimia Hasil Isolasi Dari Tumbuhan “Dekar”, Caesalpinia major
(Fabaceae)
Isolasi.
Simplisia akar “Dekar”, Caesalpinia major yang telah dikeringkan pada sinar matahari, dipotong kecil-kecil sebanyak 2,5 kg dan diekstraksi dengan metanol panas sebanyak tiga kali hingga Uji KLT tidak memberikan spot atau noda. Hasil ekstraksi disaring dan diuapkan dengan penguap berputar bertekanan rendah hingga diperoleh ekstrak methanol sebanyak 250 g (10%, persentase dihitung dari 1 kg berat kering simplisia). Sebanyak 150 gram ekstrak methanol dipartisikan ke dalam campuran air dan etil asetat = 1 : 1. Lapisan organik etil asetat diuapkan dan ditimbang sehingga diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 15 g (1%). Fraksinasi ekstrak etil asetat sebanyak 50 gram dengan melakukan kromatografi kolom dengan menggunakan adsorben silika gel (4 kg), sistem pelarut n-heksan-etil asetat = 100 : 1 → 1 : 1 memberikan senyawa Caesaldekarin a (1) (6,43 g,
0,64%) dari fraksi I, sedangkan hasil pemurnian fraksi II memberikan senyawa Caesaldekarin b (2) sebanyak 373 mg (0,04%), Caesaldekarin c (3) sebanyak 59 mg, 1,006%, Caesaldekarin d (4), 12 mg, 0,001%, Caesaldekarin e (5) 63 mg, 0,006% dan Caesaldekarin f (6) sebanyak 193 mg (0,02%) (4,5). Fraksi III sebanyak 156 dilakukan pemurnian dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT, Zorbax Sil, sistem pelarut n-heksan -etil asetat = 5 : 1) diperoleh senyawa 7 sebanyak 90 mg (0,009%). Prosedur isolasi dan pemurnian senyawa kimia dari tumbuhan “Dekar”, Caesalpinia major, dapat dilihat pada Gambar 2.
Asetilasi Senyawa 7
Sebanyak 17,1 mg senyawa 7 ditambahkan dengan 0.5 ml piridin, 5 tetes asetat anhidrid dan 10 tetes Dimetilaminopiridin (DMAP). Reaksi dilakukan pada suhu 0 °C selama 30 menit dengan dimonitor
60
oleh uji kromatografi lapis tipis (KLT). Pada hasil reaksi ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil asetat serta diasamkan dengan asam klorida encer, kemudian dinetralkan dengan natrium hidroksida. Lapisan organik yang berisi senyawa campuran, dipisahkan dan dimurnikan dengan kromatografi kolom (SiO2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil
asetat = 8 : 1) dan diperoleh senyawa turunan ester asetat (senyawa 8) sebanyak 5,7 mg.
Hidrogenasi senyawa 7
Sebanyak 10,3 mg senyawa 7 ditambahkan 0,5 ml metanol dan 1 mikro spatula penuh Natrium boronhidrida (NaBH4). Reaksi dilakukan pada suhu
kamar selama 20 menit. Pada hasil reaksi ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil asetat. Lapisan organik (etil asetat) diuapkan pada penguap berputar, kemudian dimurnikan dengan kromatografi kolom (SiO2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil
asetat = 4 : 1) dan diperoleh senyawa 9 sebanyak 8,9 mg.
Gambar 2. Isolasi Senyawa Fitoaleksin (12-oksi-7-okso Sandarakopimaradiena) dari Dekar, Caesalpinia major
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa 7 yang diperoleh pada hasil pemurnian KCKT direkristalisasi dengan pelarut n-heksan dan eter. Kristal yang berbentuk padatan dan tidak berwarna “colorless needless” ini mempunyai titik lebur (TL) 119 - 121 °C, [α] D + 19,7 ° (c =
0,34 dalam kloroform). Spektrometri ultra-violet (UV) untuk senyawa 7 tidak menunjukkan adanya serapan maksimum di atas 200 nm, Pemeriksaan spectra dari spektrometri infra-merah (IM) menunjukkan bilangan gelombang pada 3500 dan
1700 cm-1 yang membuktikan adanya gugus karbonil dan hidroksil pada struktur tersebut. Rumus molekul yang diperoleh berdasarkan spektrometri massa resolusi tinggi (HR-MS) ditetapkan sebagai C20H30O2
dengan berat molekul berdasarkan perhitungan (“calculated”) sebesar 302,2243 dan berdasarkan penemuan (“found”) sebesar 302,2225 (M+).
Penyidikan spektra resonansi magnet inti (RMI) proton (500 MHz, CDCl3) untuk senyawa 7
menunjukkan adanya sinyal pada δH 3,95 (1H, d,
J=5,0 Hz, H-12) yang karakteristik untuk proton yang
Akar Dekar (Caesalpinia major) (2,5 kg)
Diekstraksi dengan MeOH 3x, disaring, diuapkan
Ekstrak MeOH (250 g, 10%)* Diambil 150 g)
Dipartisi dalam Etil asetat-air = 1 : 1 *) Dihitung dari 1 kg berat kering
Ekstrak EtOAc (100 g, 6,6%) Ekstrak Air
Kr. Kolom (SiO2, n-heksan-EtOAc =
100 : 1 ~ 1 : 1) Caesaldekarin a (1) (6,43 g, 0,64%) Fr. II Caesaldekarin b (2), 373 mg, 0,04% Caesaldekarin c (3), 59 mg, 0,006% Caesaldekarin d (4), 12 mg, 0,001% Caesaldekarin e (5), 63 mg, 0,006% Caesaldekarin f (6), 193 mg, 0,02% Fr. III (156 mg) Fr. VIII KCKT (Zorbax Sil, n-heksan-EtOAc= 5 : 1) 12-oksi-7-okso-sandarakopimaradiena (7) (90 mg, 0,009%)
61 visinal dengan gugus hidroksil. Adanya ikatan
rangkap dua pada posisi atom C-14, C-15 dan C-16 ditunjukkan pada δH 5,31 (1H, s, 14-H); 5,75 (1H, dd, J= 11,0; 18,0 Hz, H-15) dan 4,91 (2H, dd, J
=11,0; 18,0 Hz, H-16a, H-16b).
Dari spektrum RMI 13Karbon (125 MHz, CDCl3) dan analisa DEPT (Distortionless
Enhancement by Polarization Transfer) menunjukkan bahwa semua atom karbon yang terdapat pada struktur kimia tersebut terdiri dari dua puluh sinyal. Lima sinyal berada pada daerah medan rendah (“Low
field”) yang karakteristik untuk karbon-karbon dari ikatan rangkap dua dan karbonil yaitu pada δC 153,3 (s, C-8) ; 130,2 (d, C-14); 148,3 (d, C-15); 110,6 (t,
C-16) dan 210,7 (s, C-7, gugus karbonil). Karbon teroksigenasi pada δC 82,6 (d) adalah menunjukkan adanya gugus hidroksil yang berada pada atom C-12 dengan dibuktikan adanya korelasi proton-proton antara H-12 dan H-11 pada spektrum dua dimensi RMI (1H-1H COSY). Keberadaan gugus hidroksil pada C-12 dibuktikan dengan melakukan reaksi asetilasi pada senyawa 7 yang menghasilkan senyawa turunan ester asetat (senyawa 8). Penyidikan spektra RMI proton senyawa 8 menunjukkan adanya muncul gugus asetoksi pada δH 2,19 (s) dan 4,99 (s, melebar, H-12) (Lihat Tabel 1).
Tabel 1. Pergeseran Kimia Senyawa 7 (Karbon dan Proton), Senyawa 8, 9 (Proton), (J dalam Hertz)
No Senyawa 3 Senyawa 4 Senyawa 5
Karbon Proton Proton proton
1 51,3 1,42 (m) 1,27 (dd,broad) 1,26 (m) 2 18,9 2,34 (m) 2,14(ddd,J=5,0;8,5;13, 5 2,32 (m) 2,14 (m) 2,35 (m) 2,15 (m) 3 22,2 1,74 (m) 1,67 (m) 1,57 (m) 4 45,6 - - - 5 53,5 2,0 (t,J=9,0) 2,11 (d,broad) 2,00 (t,J=8) 6 34,2 1,54 (m) 1,57 (m) 1,55 (m) 7 210,7 - 4,14 (s, broad) 4,99 (s,broad) 8 153,3 - - - 9 44,9 - - - 10 50,5 1,68 (dd,J=3,0;12,0) 1,64 (dd,J=3,0;12,0) 1,75 (d,J=11) 11 35,3 2,29 (dd,J=13,0;13,0) 2,52 (dd,J=13,0;13,0) 2,11 (dd,J=13;13) 2,30 (dd,J=13;13) 2,39 (d,J=12) 2,47 (d,J=12) 12 82,6 3,95 (d,J=5,0) 3,24 (s, broad) 4,91 (s) 13 37,4 - - - 14 130,2 5,31 (s) 5,27 (s) 5,33 (s) 15 148,3 5,75 (dd,J=11,0;18,0) 5,77 (dd,J=11;18) 5,76 (dd,J=11;18) 16 110,6 4,91 (dd,J=11,0;18,0) 4,91 (dd,J=11;18) 4,94 (dd,J=11;18) 17 16,6*) 0,70 (s)*) 1,03 (s)*) 0,83 (s)*) 18 15,4*) 080 (s)*) 1,04 (s)*) 0,88 (s)*) 19 26,2*) 1.04 (s)*) 1,05 (s)*) 1,05 (s)*) 20 29,3*) 1,19 (s)*) 1,06 (s)*) 1,12 (s)*) OAc - - 2,19 (s)
*) : Mungkin saling bertukar
Pengamatan sinyal pada daerah medan tinggi (high field) menunjukkan adanya empat sinyal yang ditetapkan sebagai gugus metil masing-masing pada δH 0,70 (s, H-17); 0,80 (s, H-18); 1,04 (s, H-19) dan 1,19 (s, H-20), dan RMI 13Karbon ditunjukkan pada δC 16,6 (C-17); 15,4 (C-18); 26,2 (C-19) dan 29,3 (C-20) yang semuanya berbentuk kuartener. Dari analisis spektrum 2D-RMI 13C-1H COSY menunjukkan bahwa semua karbon memperlihatkan korelasi dengan protonnya.
Kemudian pengamatan spektra 2D-RMI (1
H-1
H COSY ) memberikan hubungan antara proton-proton dari 1 dengan 2 dan 10; proton-proton dari H-2 dengan H-3; H-5 dengan H-6; H-11 dengan H-1H-2, dan H-15 dengan H-16. Adanya gugus karbonil pada atom C-7 dibuktikan dengan tidak adanya korelasi
antara H-6 dengan H-7. Hal ini juga dibuktikan dengan melakukan reaksi hidrogenasi senyawa 7 dengan Natrium boronhidrida (NaBH4) menjadi
senyawa dihidroksil (9). Spektra RMI proton pada senyawa 9 menunjukkan adanya perubahan gugus karbonil menjadi gugus hidroksil yaitu munculnya sinyal baru pada δH 3,24 (s, melebar, H-7) selain pada δH 4,14 (H-12) (Lihat Tabel 1). Sehingga dari hasil analisis spektrum RMI (proton dan 13Karbon) dan data kimia fisik lainnya untuk senyawa 7 dapat ditetapkan struktur kimianya sebagai senyawa fitoaleksin yaitu 12-oksi-7-okso-sandarakopimaradi-ena (1,2). Data pergeseran kimia proton dan karbon untuk senyawa 7, dan pergeseran kimia proton untuk senyawa 8 dan 9 dapat dilihat pada Tabel 1.
62
Gambar 3. Transformasi Kimia Senyawa 7 Dengan Cara Asetilasi Dan Hidrogenasi KESIMPULAN
1. Hasil isolasi dan elusidasi struktur kimia pada tumbuhan obat tradisional “Dekar”, Caesalpinia
major (Fabaceae) memberikan enam senyawa diterpen tipe kasan yaitu Caesaldekarin a, b, c, d, e, f dan satu senyawa diterpen tipe damaran yaitu dengan nama fitoaleksin yaitu 12-oksi- 7-okso-sandarakopimaradiena.
2. Senyawa Fitoaleksin yang terbentuk pada tumbuhan Caesalpinia major ada kemungkinan pada saat pengumpulan material telah terinfeksi oleh mikroorganisme, dan pada saat melakukan isolasi dan ekstraksi bahan material tersebut belum kering sekali.
Ucapan terima kasih
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Prof. I. Kitagawa dan Prof. M. Kobayashi di laboratorium Natural Product Chemistry, Fac. of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, Japan dan juga kepada Prof. H. Shibuya di Fukuyama University, Japan atas bantuan saran-saran dan pengambilan data-data spektra RMI (proton dan
13
Karbon).
DAFTAR PUSTAKA
1. Akatsuka, T., O. Kodama, H. Kato and S.
Takeuchi, 1983
3-hydroxy-7-oxo-sandaracopimaradiene (Oryzalexin A), A New phytoalexin isolated from rice blast leaves, Agric.
Biol. Chem., 47, 445-447
2. Akatsuka, T., O. Kodoma, H. Sekido, Y. Kono and S. Takeuchi, 1985 Novel Phytoalexin
(Oryzalexins A, B and C) Isolated from rice blast leaves infected with Pyricularia oryzae, Agric.
Biol. Chem., 49, 1689-1694
3. Kitagawa, I., 1987 Research Report of Naturally Occuring Drug Materials in Indonesia I, Osaka University Press, Osaka, Japan, 127 p.
4. Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Watano, H. Shibuya, S. Fujii, Y. Yamagata dan M. Kobayashi, 1994a Indonesian Medicinal Plants XI. Chemical Structures of Caesaldekarin a dan b, Two New Cassane-type Furanoditerpenoid from the roots of Caesalpinia major (Fabaceae), Chem.
Pharm. Bull. 42, 1798-1802
5. Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Mahmud, M. Kobayashi, S. Fujii, T. Uji and H. Shibuya, 1994b Indonesian medicinal Plants XIII : Chemical Structures of Caesaldekarins c, d, and e, three Additional Cassane-Type Furanoditerpenes from The Roots of Caesalpinia major (Fabaceae).
Chem. Pharm. Bull. 44, 1157-1161
6. Kono, Y., S. Takeuchi, O. Kodama, and T. Akatsuka 1984 Absolute configuration of Oryzalexin A and structures of its related phytoalexins isolated from rice blast leaves infected with Pyricularia oryzae Agric. Biol.
Chem., 48, 253-255
