Metode Molekular untuk Menentukan Genotip Bakteri dan Daerah Gen yang Dianalisis
DNA Profiling (juga disebut DNA testing, DNA typing, atau genetic fingerprinting) adalah suatu teknik yang digunakan oleh para ilmuwan forensik untuk membantu dalam identifikasi individu dengan profil DNA masing-masing. Profil DNA mengenkripsi suatu set angka yang mencerminkan tampilan DNA seseorang, yang juga dapat digunakan sebagai identifier orang tersebut. Profil DNA kemudian dibandingkan dengan sampel lain untuk menentukan apakah terdapat genetic match. DNA profiling juga dapat digunakan untuk memprofilkan strain bakteri contohnya bakteri dalam rongga mulut manusia. Profil strain bakteri pada bitemark kemudian dapat dicocokkan dengan profil strain bakteri pada tersangka (Genetic Home Reference, 2013).
Memprofilkan strain bakteri adalah proses penting untuk diagnosis, pengobatan dan epidemiologi investigasi. Metode membuat profil strain bakteri saat ini dapat diklasifikasikan ke dalam dua kategori utama: fenotip dan genotip. Karakter fenotipik adalah cerminan dari isi genetik. Genotip, yang mengacu pada diskriminasi jenis bakteri berdasarkan konten genetik mereka, baru-baru ini menjadi banyak digunakan untuk membuat profil strain bakteri. Metode yang sudah digunakan dalam membuat genotip bakteri yang sangat berbeda satu sama lain (Yıldırım et al, 2011).
Memprofilkan bakteri pada level strain sangat penting karena beberapa fitur dari bakteri yang juga menantang bagi kesehatan manusia, termasuk peningkatan virulensi dan transmisibilitas, resistensi terhadap antibiotik, memperluas spektrum host dan kemungkinan penggunaan untuk bioterorisme setelah manipulasi genetik. Hal ini juga berguna dalam bidang forensik, seperti mengidentifikasi bakteri pada bitemark yang dapat dicocokkan dengan bakteri pada gigi pelaku yang bertanggung jawab. Ada dua metode yang berbeda yang digunakan dalam identifikasi bakteri: fenotip dan genotip. Dalam metode fenotip, mengidentifikasi strain didasarkan pada karakter fenotipik termasuk morfologi koloni di berbagai media kultur, tes biokimia, serologi, patogenisitas dan kerentanan antibiotik. Diskriminasi dari strain yang terkait erat dengan metode ini
tidak cukup dan karakterisasi sel morfologi, pewarnaan dan sifat-sifat metabolisme untuk identifikasi yang jelas membutuhkan banyak hari sampai minggu. Karakter fenotipik seperti patogenisitas, spesifisitas inang, resistensi antibiotik, virulensi dan distribusi geografis dari bakteri berkaitan erat dengan keanekaragaman genetik mereka. Berbagai metode genetik telah dikembangkan untuk genotip bakteri, sejak tahun 1980-an. Metode ini telah sering menjadi digunakan dalam identifikasi bakteri karena resolusi tinggi. Profil genetik bakteri yang diidentifikasi apapun oleh metode genotip tertentu dapat seunik sidik jari (Yıldırım et al, 2011).
Metode genotip bakteri saat ini dapat dikategorikan ke dalam tiga kategori: pola pita DNA, sekuensing DNA, dan hibridisasi DNA. Dalam metode pita DNA, pita DNA dapat langsung dihasilkan oleh digesti Restriction Endonucleases (REs) atau dengan amplifikasi daerah dikenal atau tidak dikenal dari genom atau dengan kombinasi amplifikasi dan pencernaan dengan enzim pembatas. Dalam metode berdasarkan sekuensing DNA, diskriminasi di antara strain bakteri dilakukan setelah penetapan dan membandingkan dari urutan gen yang dikenal. Dalam metode berbasis hibridisasi DNA, diskriminasi bakteri dilakukan dengan menganalisis hibridisasi probes yang diketahui. DNA macroarray dan sistem microarray juga telah dikembangkan untuk mendapatkan hasil yang akurat dan cepat dalam deskripsi bakteri (Yıldırım et al, 2011).
Metode Berbasis Pita DNA
Metode berbasis pola pita DNA mengklasifikasikan bakteri sesuai dengan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh PCR amplifikasi atau digesti DNA genom dengan restriksi endonuklease atau kombinasi antara digesti dan amplifikasi. Mengidentifikasi band yang dihasilkan dapat ditentukan dengan elektroforesis gel agarosa konvensional atau sistem elektroforesis kapiler otomatis (Yıldırım et al, 2011).
METODE BERBASIS RESTRIKSI ENZIM Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Molekul DNA dapat dipisahkan dalam medan listrik konstan konvensional tergantung pada ukuran DNA. Fragmen DNA yang lebih besar dari 20 kb menunjukkan mobilitas yang sama melalui gel dan bergerak bersama berdasarkan ukuran di bawah arus listrik konstan. Memisahkan molekul DNA yang lebih besar dapat dicapai dengan menerapkan medan listrik pada sudut yang berbeda. Metode ini dijelaskan pada tahun 1984 terlebih dahulu dan kemudian dikenal sebagai Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). PFGE adalah metode alternatif restriksi digesti melibatkan penggunaan REs dengan motif uncommon recognition untuk menghasilkan fragmen DNA yang besar. Pola pita yang diperoleh dari sekelompok strain mencerminkan polimorfisme DNA pada situs pengenalan RE. Meskipun PFGE banyak digunakan dalam epidemiologi dan studi lingkungan, ia juga memiliki beberapa keterbatasan, termasuk kepadatan DNA, jumlah agarosa dalam gel, penerapan tegangan dan suhu gel. Oleh karena itu, mengidentifikasi kriteria bakteri dengan PFGE dan protokol PFGE perlu dibakukan. Tenover dan rekan mengusulkan bakteri yang memiliki profil PFGE yang sama harus dianggap sebagai milik strain yang sama. Mereka juga mengusulkan, isolat yang berbeda dengan peristiwa genetik tunggal, yang tercermin sebagai perbedaan satu sampai tiga band maka dipertimbangkan 'terkait erat', dan mengisolasi berbeda empat sampai enam band, mungkin mewakili dua peristiwa genetik independen, maka harus dianggap 'mungkin terkait', isolat bakteri yang mengandung enam atau lebih perbedaan band maka harus dipertimbangkan 'berhubungan' (Yıldırım et al, 2011).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Analisis RFLP didasarkan pada pengukuran fragmen yang dihasilkan dari digesti DNA genom. Berbeda dengan PGFE, ratusan fragmen restriksi singkat dapat dihasilkan akibat pencernaan DNA genom dengan sering memotong Res. Karena kesulitan dalam menganalisis banyak band, hibridisasi dengan probs DNA yang dikenal sering digunakan dalam teknik ini (Yıldırım et al, 2011).
Probe rRNA juga dapat digunakan untuk analisis RFLP. Dalam metode ini, yang disebut ribotyping, conserved regions gen 16S dan 23S rRNA digunakan
untuk menyelidiki pola pita RFLP yang berbeda. Metode ini memungkinkan untuk menentukan urutan DNA fragmen, karena operon rRNA bersifat universal (Yıldırım et al, 2011).
POST POLIMERASE-CHAIN REACTION (PCR) BANDING METHODS Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD)
Metode RAPD, juga dikenal sebagai AP-PCR, berdasarkan amplifikasi acak daerah genom yang tidak diketahui dengan menggunakan primer tunggal pendek. Tidak seperti analisis PCR klasik, wilayah genom yang akan diamplifikasi tidak diketahui dan amplifikasi tergantung pada posisi yang melengkapi urutan primer. Jika primer anil terlalu jauh atau mutasi telah terjadi pada situs yang sebelumnya melengkapi primer identik 10-mer, amplifikasi mungkin tidak dapat dilakukan. Para amplikon berukuran berbeda diproduksi di beberapa lokus oleh RAPD-PCR dapat diamati pada pola pita yang berbeda pada gel agarosa dan bakteri dapat ditentukan genotipenya tergantung pada pola-pola pita (Yıldırım et al, 2011).
Metode PCR-RFLP
Metode ini didasarkan pada digesti dan pemisahan fragmen dalam elektroforesis agarosa gel setelah amplifikasi lokus tertentu dengan primer yang spesifik. Perbedaan metode ini dari metode RFLP langsung adalah membatasi wilayah DNA yang tertarik. Metode ini telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi berbagai bakteri dan kekuatan diskriminatif dari teknik ini dapat ditingkatkan dengan analisis berbasis multilocus (Yıldırım et al, 2011).
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Teknik ini didasarkan pada digesti DNA genom dengan dua enzim restriksi dan ligasi fragmen restriksi dengan adapter akhir tertentu dan kemudian amplifikasi fragmen oleh primer melengkapi urutan adaptor. Seperti dalam metode berbasis pola pita DNA lainnya, mengidentifikasi pola pita dapat dideteksi dengan elektroforesis gel konvensional. Selain itu, urutan DNA fragmen dapat
ditentukan dengan menggunakan primer yang dirancang terhadap urutan adaptor. Sisi pembatas metode ini sensitif dan diskriminatif tingkat tinggi adalah bahwa template DNA tidak boleh terkontaminasi oleh berbagai DNA (Yıldırım et al, 2011).
PCR and Bands of Repetetive DNA Regions REP-PCR
Ada serangkaian sekuens DNA berulang yang tersebar di beberapa salinan seluruh genom bakteri. Fungsi ini diselingi unsur DNA berulang yang masih belum diketahui. Sekuens berulang dapat dikategorikan menjadi tiga keluarga: 35-40 bp urutan Repetitive Extragenic Palindromic (REP). yang 124-127 bp urutan Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) dan urutan elemen BOX 154 bp. Urutan konsensus dari elemen-elemen dapat digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA antara elemen-elemen berulang. Pola pita yang diperoleh dari amplifikasi ini berguna untuk sidik jari DNA bakteri. Deteksi band dapat dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa atau elektroforesis kapiler. Reproduksibilitas REP-PCR jauh lebih tinggi daripada RAPD-PCR karena primer spesifik digunakan untuk amplifikasi (Yıldırım et al, 2011).
Multiple Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis
MLVA adalah alat penentu genotip yang menyediakan data berdasarkan jumlah sekuens berulang yang ditemukan pada kromosom bakteri. Variable Numbers of Tandem Repeats (VNTR) adalah pengulangan berturut-turut yang tersebar dalam multi eksemplar pada genom bakteri. VNTRs dapat ditemukan di daerah noncoding serta gen dan jumlah tandem repeats dapat bervariasi antar strain. Jumlah pengulangan dapat ditentukan dengan menggunakan primer yang melengkapi daerah well conserved pada tandem repeat yang diapit. Diskriminasi yang dilakukan dengan membandingkan produk PCR untuk menentukan tingkat relatif dari bakteri (Yıldırım et al, 2011).
Metode Sanger
Metode Sanger juga dikenal sebagai dideoksi atau metode terminasi rantai, berdasarkan proses sintesis rantai DNA melalui penggunaan dideoksi yang mengganggu langkah pemanjangan amplifikasi DNA. Bila enzim polimerase DNA terpasang nukleotida tanpa 3 'gugus hidroksil pada rantai, perpanjangan akan dihentikan. Dideoksi nukleotida dihentikan maka rantai dapat ditentukan dengan memisahkan produk PCR dalam elektroforesis acryl amida gel(Yıldırım et al, 2011) .
Pyrosequencing
Tidak seperti metode Sanger, pyrosequencing bukanlah metode elecrophoretic. Metode ini didasarkan pada deteksi real time pyrophospates yang dilepaskan selama perpanjangan rantai DNA. Seperti PCR klasik, metode pyrosequencing juga memerlukan primer untuk perpanjangan rantai. Tidak seperti PCR standar, pyrosequencing memerlukan ATP sulfurylase, Luciferase, Apyrase dan Adenosin phosphosulfate. Keempat enzim dalam sistem pyrosequencing adalah fragmen Klenow DNA Polymerase I, Luciferase, ATP sulfurylase dan Apyrase. Campuran reaksi juga mengandung phosphosulfate adenosin, D-luciferin, DNA template dan primer anil untuk digunakan sebagai bahan awal. Klenow Polymerase menggabungkan dNTP ditambahkan ke dalam untai DNA tumbuh dan pyrophospate dilepaskan. ATP sulfurylase mengubah pirofosfat ke ATP dan Luciferase cahaya menghasilkan dengan menggunakan dihasilkan ATP. Keempat nukleotida ditambahkan satu per satu dan kamera mendeteksi cahaya yang dihasilkan sebagai bukti dimasukkannya nukleotida (Yıldırım et al, 2011).
Metode berbasis Hibridisasi DNA
Metode berdasarkan hibridisasi ini, memerlukan DNA sasaran dan fragmen DNA fluorescently berlabel yang melengkapi DNA target, disebut sebagai prob. Teknik hibridisasi dapat diterapkan ke ratusan atau puluhan ribu fragmen DNA atau oligonucletides yang tersusun pada substrat. Array dapat diklasifikasikan ke microarray dan macroarray sesuai dengan ukuran dan
bintik-bintik pada pendukung. Teknik-teknik hibridisasi berbasis array sering digunakan dalam skrining mutasi dan studi genotip bakteri (Yıldırım et al, 2011).
Daerah Gen yang Digunakan untuk Menentukan Genotipe Bakteri
Dalam konteks genom, lokus (jamak = loki) mengacu pada posisi pada kromosom. Karena itu, mengacu pada penanda, gen, atau landmark lainnya yang dapat digambarkan (National Center for Biotechnology Information, 2002). Lokus yang digunakan untuk menentukan genotipe bakteri (Yıldırım et al, 2011):
a. Gen 16S rRNA
Gen rRNA adalah gen penting untuk kelangsungan hidup semua organisme karena peran mereka dalam sintesis protein. Gen 16S rRNA memiliki panjang 1500 bp dan itu terdiri dari well conserved 10 daerah dan 10 daerah berbeda. Ada tingkat mutasi konstan sekitar 1% per 50 tahun di daerah berbeda dari gen 16S rRNA. Karena situasi polimorfik ini, urutan gen rRNA digunakan selama lebih dari 20 tahun dalam pemeriksaan filogenetik. Dalam beberapa kasus, urutan DNA asing, yang diberi nama intervensi urutan dari sekitar panjang 140 bp dapat ditemukan dalam gen 16S rRNA jadi, jika gen 16S rRNA lebih besar dari ukuran biasa sekitar 1500 bp, harus diidentifikasi kemungkinan urutan IVS dalam gen 16S rRNA (Yıldırım et al, 2011).
b. 16S-23S rRNA ITS region
Gen 16S, 23S dan 5S rRNA mikroorganisme prokariotik ditemukan dalam lokus genetik yang sama dan mereka dipisahkan oleh daerah noncoding yang disebut Internal Transcribed Spacer (ITS). ITS adalah daerah istimewa yang memperlihatkan polimorfisme tingkat tinggi dan derajat yang besar variasi panjang pada genus dan spesies dan karena itu mereka berguna untuk mengidentifikasi dan subtyping bakteri. Daerah ITS dapat dengan mudah diperkuat dengan primer yang dirancang untuk melengkapi daerah served gen 16S dan 23S rRNA. Daerah ITS lebih informatif daripada analisis 16S rRNA terutama pada strain typing (Yıldırım et al, 2011).
Gen housekeeping adalah gen yang diperlukan untuk fungsi dasar sel atau organisme dan mereka sangat penting untuk survival. Gen ini dapat digunakan untuk diskriminasi strain terkait erat yang tidak dapat dipisahkan dengan analisis 16S rRNA. Gen rpoB yang merupakan subunit polimerase enzim RNA banyak digunakan dalam menentukan genotip bakteri. Beberapa gen housekeeping lainnya seperti hsp65, gyrB, gen SLPA yang sering digunakan dalam menentukan genotip bakteri (Yıldırım et al, 2011).
Manusia merupakan kumpulan beberapa strain dari spesies Streptococcus sama dengan banyak strain yang tampaknya unik untuk individu. Keragaman antar spesies ini memberikan premis bahwa streptococci oral yang diisolasi dari bite mark yang terjadi pada kulit manusia dapat cocok secara genotip, dengan jaminan tingkat tinggi, dibandingkan dengan streptococci dari gigi pelaku yang bertanggung jawab. Observasi ini ditegaskan dalam suatu studi yang mendayakan kebutuhan untuk kultur sebelumnya dengan mengamplifikasi DNA bakteri secara langsung dari gigi dan gigitan eksperimental. Dalam penelitian tersebut, DNA streptokokus, diamplifikasi dengan primer spesifik untuk region hypervariable 9 dari gen 16S rRNA streptokokus, diselesaikan dengan denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), dan perbandingan profil amplikon dari bitemark dan gigi cocok antara bitemark dengan gigi bertanggung jawab. Namun, ada risiko seiring positif palsu dengan menggunakan satu-satunya lokus yang diawetkan secara relatif (Kennedy et al, 2012).
Analisis filogenetik dan identifikasi spesies bakteri secara konvensional didasarkan pada perbandingan urutan gen 16S rRNA, namun daerah variabel yang terkandung dalam lokus ini umumnya tidak cukup untuk membedakan spesies streptokokus yang terkait erat. Target gen alternatif yang membedakan antara streptokokus yang terkait erat termasuk ITS (bentangan noncoding DNA yang terletak di antara gen 16S dan 23S rRNA), rnpB (encoding endoribonuclease P) dan rpoB (encoding subunit beta dari RNA polimerase bakteri). Variabilitas yang ditawarkan oleh daerah tersebut sudah cukup untuk membedakan antara spesies
streptokokus dengan urutan gen 16S rRNA yang hampir identik (Kennedy et al, 2012).
Penelitian yang dilakukan di Universitas Otago pada tahun 2012 menilai kelayakan pencocokan urutan DNA bakteri yang diamplifikasi dari gigitan eksperimental dengan yang diperoleh dari gigi pelaku yang bertanggung jawab, dengan tujuan mengevaluasi kemampuan tiga daerah genom DNA streptokokus untuk membedakan antara sampel peserta. Bite mark dan gigi penyeka dikumpulkan dari 16 peserta. DNA bakteri diekstraksi untuk menyediakan template untuk primer PCR spesifik untuk gen 16S ribosom RNA streptokokus (16S rRNA), intergenik spacer 16S-23S (ITS) dan RNA polimerase subunit beta (rpoB). Dengan menggunakan alat high throughput sequencing (GS FLX 454), diikuti oleh penyaringan kualitas yang ketat, bacaan yang dihasilkan dari gigitan untuk dibandingkan dengan yang dihasilkan dari sampel gigi. Untuk semua tiga wilayah, overlaps terbesar dibaca identik antara sampel bitemark dan sampel gigi yang sesuai. Proporsi rata-rata bacaan identik antara bitemark dan sampel gigi yang sesuai adalah 0,31, 0,41 dan 0,31, dan untuk sampel non-sesuai adalah 0,11, 0,20 dan 0,016, untuk 16S rRNA, ITS dan rpoB secara berturut-turut. Probabilitas kecocokan dan ketidakcocokan dengan benar membedakan sampel gigi adalah 0,92 untuk ITS, 0,99 untuk 16S rRNA dan 1.0 untuk rpoB. Temuan ini sangat mendukung prinsip bahwa DNA bakteri yang diamplifikasi dari bitemark dan gigi dapat memberikan informasi pendukung dalam identifikasi penyerang (Kennedy et al, 2012).
DAFTAR PUSTAKA
Yıldırım, I., Yıldırım, S., & Koçak, N. 2011. Molecular Methods for Bacterial Genotyping and Analyzed Gene Regions. Journal of Microbiology and Infectious Diseases / JMID 2011; 1 (1): 42-46.
Kennedy, Stanton, Garcı´a, Mason, Rand, Kieser, & Tompkins. 2012. Microbial Analysis of Bite Marks by Sequence Comparison of Streptococcal DNA. PLOS ONE | www.plosone.org, December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e51757.
Genetics Home Reference. 2013. DNA Fingerprinting. ghr.nlm.nih.gov/glossary=dnafingerprinting.
National Center for Biotechnology Information. 2002. The NCBI Handbook. www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21106
