Kuliah 14 UJI POTENSI ANTIMIKROBA

(1)

FARMASI – UHAMKA

2013

Priyo Wahyudi

Kuliah 14

(2)

UJI POTENSI ANTIMIKROBA

• Metode Difusi Agar

• Metode Dilusi

(3)

Mengapa Antimikroba perlu

ditentukan Potensinya ?

• Penggunaan antimikroba yg meningkat kadarnya, menyebabkan meningkat pula resistensi berbagai mikroba patogen terhadapnya

• Efektivitas antimikroba sangat tergantung pada kadar dan kekuatan zat aktifnya

• Kadar  jumlah per satuan berat/volume

• Potensi  ukuran kekuatan atau daya bunuh zat aktif terhadap mikroba

• Respons mikroba thd antimikroba berbeda-beda, umumnya bersifat SPESIFIK dan SENSITIF

(4)

Prinsip Uji Potensi Antimikroba

(berdasar FI IV 1995)

• Estimasi potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan

penggunaannya, terkalibrasi dengan baik dan umum digunakan sebagai rujukan

• Tujuan: sebagai standar utk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi) antibiotik terhadap mikroba

(5)

Potensi Antimikroba

• Potensi Antimikroba adalah kekuatan suatu

antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg

• Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan pada sistem hayati (mikroorganisme)

• Dilakukan pada :

– HILIR : Pemantauan Potensi Antibiotik terhadap mikroba Uji / Terjadinya Resistensi antibiotik pada mikroba

(6)

Potensi Antimikroba

• Prinsip : membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji • Baku standar : zat/senyawa yg sudah diketahui

kemurnian dan kekuatan / potensinya

• Mikroba yang digunakan adalah mikroorganisme yang diketahui kemurnian dan susceptibilitasnya

(7)

Potensi Antimikroba

• Cara analisis :

– Metode difusi agar (lempeng) – Metode dilusi (Turbidimetri)

• Respon yang diamati :

– Efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang ditentukan oleh daerah bening (inhibition zone) di

sekeliling zat uji (cara difusi)

– Kekeruhan (turbiditas) yg ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba dalam medium cair (cara turbidimetri)

(8)

METODE DIFUSI AGAR &

TURBIDIMETRI

1. DIFUSI AGAR

• Prinsip : zat antimikroba yang akan diuji berdifusi dari reservoir ke dalam medium agar yg telah

diinokulasi dengan mikroba uji.

• Inkubasi selama waktu tertentu, kemudian diamati adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter hambatannya

• Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan dengan diameter baku standar

(9)

2. CARA TURBIDIMETRI

• Digunakan media cair, hambatan pertumbuhan

mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan dengan spektrofotometer

(10)

Bahan untuk Uji Potensi Antimikroba

Bahan-bahan yang diperlukan dalam uji potensi antibiotik:

• Mikroba uji

• Baku pembanding biologis • Media pertumbuhan

(11)

Mikroba / Inokula Uji

• Mikroba uji harus berasal dari galur murni, dapat memberikan respon yg bertingkat antara

peningkatan konsentrasi dgn peningkatan daerah hambatannya.

• Mikroba uji utk jenis antibiotik tertera pada Tabel FI IV, dipelihara pada agar miring dan diremajakan

setiap minggu

• Untuk cara difusi, daerah hambatan yg terbentuk harus jelas dan mudah diukur.

• Untuk penetapan cara tabung, perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas

(12)

(13)

(14)

(15)

Penyiapan Inokula

• Inokula diperbanyak dalam media cair, inkubasi

dilakukan selama 24 jam hingga transmitan suspensi inokula 25% blanko

• Ukuran inokula juga dapat dinyatakan sesuai dengan prosedur uji potensi antibiotika untuk jenis bakteri tertentu berdasar skala McFarland

• Skala McFarland adalah standard yang digunakan sebagai referensi utk menentukan kekeruhan

suspensi inokula uji, sehingga jumlah inokula sesuai dengan kisaran yang dipersyaratkan

(16)

Skala McFarland

• Standard McFarland awalnya dibuat dengan

mencampurkan jumlah tertentu BaCl dengan H2SO4. campuran keduanya akan menyebentuk barium sulfat yang tersuspensi, sehingga menyebabkan kekeruhan • Saat ini standard McFarland dibuat dari suspensi

partikel latex yg lebih awet dan stabil.

• Standard diperbandingkan secara visual dengan suspensi inokula yang ditumbuhkan pada nutrient broth. Jika suspensi inokula terlalu keruh, maka

dilakukan penambahan larutan media. Jika suspensi inokula kurang keruh, maka dapat ditambahkan

(17)

Skala McFarland

McFarland Standard No. 0.5 1 2 3 4

1.0% Barium chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

1.0% Sulfuric acid (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6

Approx. cell density (1X10^8 CFU/mL) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0

% Transmittance* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5

Absorbance* 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669

(18)

MacFarland 0.5 & Suspensi Inokula

(19)

Baku Pembanding (Biological Reference)

• Baku pembanding (biological reference) ;

Digunakan antibiotik yg telah diketahui kemurnian dan potensinya secara pasti. Baku pembanding ini

direkomendasikan oleh WHO dan di Indonesia seperti BPOM, SPI, SPN, SBL (S=standar, B=baku, P=pembanding, L=lab,

(20)

(21)

Media Pertumbuhan

Media yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji dgn baik, tidak boleh mengandung zat yg bersifat antagonis ataupun yg mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotik yg diperiksa

(22)

Larutan Dapar

Digunakan untuk melarutkan antibiotik yang akan

diperiksa baik baku pembanding maupun sampel uji. Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yabg akan diuji.

(23)

Metode difusi agar

• Metode analisis potensi antibiotik secara difusi agar merupakan cara yang sederhana dan hasil yg diperoleh cukup teliti.

• Cara ini mrp cara terpilih dan direkomendasikan oleh International Collabotrative Study di Swedia dan FDA di AS untuk pengujian mutu antibiotik

• Prinsip penetapannya yaitu mengukur luas hambatan pertumbuhan mikroba uji yg disebabkan oleh zat baku standar dan zat yg di uji

• Dlm range konsentrasi tt terdapat hub yg linear antara peningkatan konsentarsi dgn luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji

(24)

Faktor yang mempengaruhi luas daerah

hambatan dengan cara difusi agar

• Ingredien / komposisi medium pertumbuhan • Pemilihan medium pertumbuhan

• Pengaruh pH

• Ukuran inokulum

• Stabilitas mikroba uji • Aktivitas antibiotika • Waktu inkubasi

(25)

Ingredien medium pertumbuhan

• Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo adalh ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)

• NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol

aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin • KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas

(26)

Pemilihan medium

• Diperlukan persiapan medium yg cocok bagi pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada medium agar

• Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan

disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa

• Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi

diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N

(27)

Ukuran inokulum

• Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.

• Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar kandungan

mikroorganismenya.

• Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganismenya homogen, misal 1-10%

• Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan terjadinya penumpukan pada tempat tt

(28)

Stabilitas mikroba uji

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh

sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan

(29)

Aktivitas antibiotik

Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan

kadar hambat minimum (KHM) dari antibiotik yang

diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi

dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam medium agar

(30)

Waktu Inkubasi

Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk

pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara 18-24 jam

(31)

Reservoir

• Resevoir pada Teknik difusi agar dapat berupa: – Silinder gelas / logam

– Cakram kertas (paper disc)

– Cetak lobang (punched holes)

• Cakram : tempat meletakkan sampel antimikroba yang akan diuji potensinya pada medium agar yang telah memadat

(32)

(33)

The standard procedure that assesses antimicrobial activity is called the Kirby–Bauer method (Figure 24.8).

(34)

(35)

(36)

• Agar media are inoculated by evenly spreading a

defined density of a suspension of the pure

culture on the agar surface. Filter paper disks

containing a defined quantity of the antimicrobial

agents are then placed on the inoculated agar.

• After a specified period of incubation, the

diameter of the inhibition zone around each disk

is measured. Table 24.4 presents zone sizes for

several antibiotics.

(37)

(38)

• Antibiograms are periodic reports that

indicate the susceptibility of clinically isolated

organisms to the antibiotics in current local

use.

(39)

Select colonies

Prepare inoculum suspension

(40)

Mix well

Standardize inoculum suspension

(41)

Swab plate

(42)

Add disks

(43)

Measure Zones

(44)

(45)

Tube dilution tests

• A series of culture tubes are prepared, each containing a liquid medium and a different concentration of a

chemotherapeutic agent. The tubes are then inoculated with the test organism and incubated for 16-20 hours at 35C.

After incubation, the tubes are examined for turbidity (growth).

• Minimum Inhibitory Concentration (MIC): Is the lowest

concentration of chemotherapeutic agent capable of preventing growth of the test organism.

• Minimum Bactericidal Concentration (MBC): Is the lowest

concentration of the chemotherapeutic agent that results in no growth (turbidity) of the subcultures.

(46)

MIC

• Minimal inhibitory concentration

• The lowest concentration of antimicrobial

agent that inhibits the growth of a bacterium

• Interpret:

– Susceptible – Intermediate – Resistant

(47)

Penentuan Konsentrasi Hambat

Minimal (KHM) Antimikroba

• Metode Dilusi Cair

• Medium cair ditambahkan zat antimikroba dengan konsentrasi separuhnya (2 fold serially diluted

antibiotic solutions) yang diinokulasi mikroba uji

• Setelah inkubasi, KHM diperoleh dari medium pertama yg menunjukkan terjadinya penghambatan pertumbuhan mikroba uji

(48)

(49)

• If the bacteria removed from the drug can grow on drug free medium at highest concentrations, the drug is known to have bacteristatic action

• If the bacteria removed from the drug can not grow on drug

free medium at most concentrations, the drug is known to have bactericidal action. One tube difference is allowed in this test

(50)

Microdilution MIC tray

Prepare inoculum suspension

(51)

(52)

Pour inoculum into reservoir and inoculate MIC tray

(53)

Inoculate purity plate

(54)

(55)

Reflected light Transmitted light

(56)

Optimal Use of Purity Plates

• Sub final test suspension to non-selective

medium (after inoculating MIC test)

• Streak for isolation (avoid several specimens

per plate - may not reveal contaminants if no

isolated colonies)

• Examine before reading MIC (usually at 16-20

h)

(57)

Microbroth Dilution Method

– Microdilution plates:

• “Microdilution/ Microbroth

dilutions”

• 96 wells/ plate: simultaneously performed with many tests

organisms/ specimens, less reagent required

(58)

(59)

- +

64 32 16 8 4 2 1 >64 0.5 >64

(60)

Epsilo-meter test

• It’s a new technique for direct detection of MIC, a graduated increasing concentration of the antibiotic is fixed along a rectangular plastic test strip which is applied to the surface of an inoculated agar plate, after over night incubation a tear drop shaped

inhibition zone is seen.

• The zone edge intersect the graded test strip at the MIC of the antimicrobial.

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

S. pneumoniae

(66)

Uji Antifungi Filamentous

• Teknik Gores Silang

Cawan Petri Kertas filter mengandung antibiotik uji Goresan silang Fungi Uji Zona hambat pertumbuhan fungi Koloni Fungi Uji