KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI DENITRIFIKASI PEREDUKSI DINITROGEN OKSIDA (N 2 O) YANG DIISOLASI DARI TANAH SAWAH RATNA SETYANINGSIH

OKSIDA (N

₂

O) YANG DIISOLASI DARI TANAH SAWAH

RATNA SETYANINGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi Dinitrogen Oksida (N₂O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi.

Bogor, April 2011 Ratna Setyaningsih NIM G361060041

ABSTRACT

RATNA SETYANINGSIH. Characterization and Activity Assay of Nitrous Oxide (N2O) Reducing Denitrifier Isolated from Rice Soils. Under direction of IMAN RUSMANA, PRIHASTO SETYANTO and ANTONIUS SUWANTO.

Nitrous oxide (N2O) is one of the main greenhouse gases and rice fields are among major contributors of this ozone depleting agent. Soil denitrifiers possessing high N₂O reduction activity are important for controlling N₂O emission. Nitrous oxide reduction is the last step of denitrification process. The aim of this study was to isolate denitrifying bacteria from rice soils possessing high ability of N₂O reduction and potential in reducing N₂O emission.

Soil samples were collected from 6 locations of rice fields in Bogor (West Java) and Tangerang (Banten), Indonesia. Bacteria were isolated through enrichment culture supplemented with NO₃^-. Measurement of growth and N₂O reduction activity were conducted by growing bacterial isolates in medium with N2O as a sole terminal electron acceptor. Physiological characterization and identification were performed using API 20NE while molecular identification was conducted based on 16S rRNA gene sequence. nosZ gene was analyzed by cloning and sequencing. N2O emission activity was carried out using rice soil slurry experiment.

It was found that 10 isolates of denitrifying bacteria could grow on N₂O.

The bacterial growth indicated by optical density (OD) increased up to 0.12-0.47.

During 5 days incubation, isolate BL1, BL2 and BLN1 reduced N2O up to 4.09, 5.41 and 3.91 µmol mL^-1 bacterial cultures respectively. BL1, BL2 and BLN1 grew well in medium supplemented with 900, 1380 and 1979 µM N2O but did not grow well with 88 µM N2O in medium during 10 hours, this facts indicated that the isolates consumed N₂O during their growth. Maximum growth rate (µ_max) using N₂O and Monod constant (K_s) of BL1, BL2 and BLN1 were 0.21 h^-1 and 102.3 µM h^-1, 0.23 h^-1 and 213.3 µM h^-1, 0.18 h^-1 and 172.4 µM h^-1 respectively.

N2O reduction rate of BL1, BL2 and BLN1 were 0.26, 0.28 and 0.43 µmol mL^-1 h^-1 respectively. N₂O reduction proceeded along with growth. Based on the API 20NE assay, 3 isolates showed different physiological characteristics on hydrolysis of esculine and P-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside and also for the assimilation of potassium gluconate and trisodium citrate. From its physiological characteristics, BLN1 was identified as Ochrobactrum anthropi with 99.9%

similarity, while BL1 and BL2 were not identified. Based on their 16S rRNA sequence, BL1, BL2 and BLN1 were closely related to Ochrobactrum anthropi ATCC 49188 with similarity of 99, 95 and 98% respectively. Analysis of nosZ gene did not give the expected result. BLN1 isolate reduced the dissolved N2O concentration in surface water from 32.12 to 12.94 nmol L^-1 after 6 hours supplementation of 0.6 mmol NO₃^-.

Keyword: denitrifier, N2O reduction, rice soil

RINGKASAN

RATNA SETYANINGSIH. Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah. Di bawah bimbingan IMAN RUSMANA, PRIHASTO SETYANTO dan ANTONIUS SUWANTO.

Perubahan iklim yang disebabkan oleh gas-gas rumah kaca merupakan masalah global yang penting selama beberapa dekade terakhir ini. Pengurangan emisi gas-gas rumah kaca menjadi kajian pokok dalam banyak pertemuan tingkat internasional yang berkaitan dengan perubahan iklim. Pengurangan emisi dilakukan di berbagai sektor termasuk pertanian. Lahan pertanian termasuk sawah merupakan salah satu sumber emisi gas-gas rumah kaca seperti metana (CH4) dan dinitrogen oksida (N2O). Sebagai negara agraris dengan sebagian besar penduduk mengkonsumsi beras sebagai bahan makanan pokok, masalah emisi gas-gas rumah kaca dari lahan sawah di Indonesia menjadi penting terutama upaya pencegahannya.

Gas dinitrogen oksida (N₂O) merupakan salah satu gas rumah kaca yang juga dapat menyebabkan kerusakan lapisan ozon di stratosfer. Gas ini memiliki potensi pemanasan global 298 kali lebih besar dibandingkan dengan CO2. Masa tinggal N2O di atmosfer selama 114 tahun, jauh lebih tinggi dari pada CH4 dengan masa tinggal selama 12 tahun. Konsentrasi N₂O di atmosfer meningkat dari 314 ppb pada tahun 1998 menjadi 319 ppb pada tahun 2005.

Lebih dari sepertiga emisi total N2O berasal dari aktivitas manusia (antropogenik). Lahan pertanian termasuk sawah merupakan sumber N₂O antropogenik terbesar. Emisi N2O dari lahan pertanian sebesar 2.8 TgN per tahun atau 15.82% dari total emisi N2O. Emisi N2O dari lahan pertanian meningkat dengan adanya peningkatan penggunaan pupuk nitrogen, fiksasi gas dinitrogen dari udara dan pengendapan senyawa-senyawa nitrogen.

Emisi N2O dari tanah berasal dari N2O yang diproduksi dalam tanah.

Produksi N2O dalam tanah terutama melalui dua proses mikrobiologis yaitu denitrifikasi dan nitrifikasi. Beberapa faktor lingkungan seperti ketersediaan oksigen (O2) dan N serta kandungan bahan organik dan air tanah mempengaruhi produksi N2O yang berakibat berpengaruh pula terhadap emisi N2O. Selain faktor lingkungan, komunitas mikroba dalam tanah mempengaruhi pula produksi dan emisi N2O.

Komunitas bakteri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap tingkat emisi N₂O dari suatu ekosistem. Oleh karena itu, salah satu usaha yang dapat dilakukan untuk menurunkan emisi N₂O adalah dengan memodifikasi komposisi komunitas atau dominansi bakteri di lingkungan tersebut. Penambahan isolat bakteri yang memiliki aktivitas mereduksi N₂O tinggi diharapkan dapat menurunkan tingkat emisi N₂O.

Reduksi N2O merupakan tahap akhir proses denitrifikasi. Meskipun demikian tidak semua bakteri denitrifikasi dapat mereduksi N2O dan tidak semua bakteri pereduksi N₂O dapat mereduksi N₂O yang ada di luar selnya (eksogen).

Beberapa galur bakteri pereduksi N2O lebih efisien menggunakan N2O yang dihasilkannya sendiri (endogen) untuk pertumbuhan dibandingkan dengan menggunakan N₂O eksogen. Ketahanan dan tingkat kemampuan bakteri

mereduksi N₂O juga berbeda-beda dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan terutama O2.

Meskipun penelitian tentang bakteri denitrifikasi yang memiliki kemampuan mereduksi N₂O telah banyak dilakukan, namun belum ada penelitian yang mengarah kepada pemanfaatan bakteri denitrifikasi untuk menurunkan produksi dan emisi N2O. Bakteri yang memiliki aktivitas tinggi mereduksi N2O eksogen berpotensi untuk mengurangi N₂O di lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk pengembangan isolat bakteri denitrifikasi asal tanah sawah di Indonesia yang memiliki aktivitas tinggi dalam mereduksi N2O untuk menurunkan emisi N₂O dari lahan sawah.

Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat-isolat bakteri denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N2O dan berpotensi menurunkan emisi N2O. Tujuan tersebut dicapai melalui beberapa tahap kegiatan penelitian yaitu: 1) mengisolasi bakteri denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O 2) mengukur pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O 3) mengidentifikasi isolat-isolat 4) menganalisis gen nosZ penyandi enzim N₂O reduktase dan 5) menguji kemampuan isolat terpilih dalam menurunkan emisi N2O di tanah sawah.

Penelitian berlangsung mulai September 2007 sampai dengan Juli 2010.

Sampel tanah sawah diambil dari enam lokasi yang berada di Kabupaten Bogor, Kota Bogor dan Kota Tangerang. Penelitian sebagian besar dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor. Sebagian penelitian dilaksanakan di Microbial Ecology Laboratories, Department of Biological Sciences, University of Essex, United Kingdom. Gas N2O diukur menggunakan kromatografi gas di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah dan Sumber Daya Lahan IPB dan Laboratorium Balai Penelitian Lingkungan Pertanian, Jakenan, Pati. Sekuensing dilakukan di Research and Development Center Biotechnology Department PT Charoen Pokphand Indonesia dan 1st BASE Pte Ltd Singapura.

Sampel tanah sawah digunakan sebagai sumber isolat. Bakteri diisolasi dari biakan pengkayaan mengandung NO3-

selanjutnya dilakukan uji oksidatif/fermentatif. Isolat yang bersifat oksidatif digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya yaitu uji reduksi NO₃^- dan akumulasi NO₂^- untuk memastikan bahwa bakteri yang diisolasi adalah bakteri denitrifikasi. Selanjutnya bakteri diseleksi berdasarkan pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O. Bakteri yang memiliki aktivitas tinggi mereduksi N₂O selanjutnya diukur kinetika pertumbuhannya menggunakan N2O dan kecepatannya mereduksi N2O. Tahap berikutnya adalah karakterisasi dan identifikasi bakteri secara morfologis, fisiologis dan molekuler serta analisis molekuler gen nosZ penyandi enzim N₂O reduktase. Tahap terakhir adalah uji penurunan emisi N₂O menggunakan tanah sawah.

Sepuluh isolat bakteri denitrifikasi yang didapatkan dari enam lokasi sawah mampu mereduksi NO3-

berkisar 883.7-1164.5 µM dengan akumulasi NO2-

sebesar 3.2-11.7 µM jika ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang (28-30°C).

Sepuluh isolat tersebut semuanya dapat tumbuh dalam biakan dengan N₂O sebagai satu-satunya penerima elektron. Tiga isolat yang mereduksi N₂O paling

banyak selama 5 hari adalah BL2, BL1 dan BLN1 yang masing-masing mereduksi N2O sebesar 5.41, 4.09 dan 3.91 µmol mL^-1 biakan.

Tiga isolat yang diuji lebih lanjut yaitu BL1, BL2 dan BLN1 tumbuh baik dalam biakan dengan konsentrasi N₂O terlarut dalam medium sebesar 900, 1380 dan 1979 µM tetapi tidak tumbuh baik dalam biakan dengan konsentrasi N2O 88 µM yang menunjukkan bahwa bakteri tumbuh menggunakan N2O. Kecepatan pertumbuhan maksimum menggunakan N₂O (µ_max) dan konstanta Monod (K_s) dari isolat BL1 sebesar 0.21 jam^-1 dan 102.3 µM jam^-1, BL2 0.23 jam^-1 dan 213.3 µM jam^-1, BLN1 0.18 jam^-1 dan 172.4 µM jam^-1. Isolat BL1, BL2 dan BLN1 memiliki kecepatan reduksi N₂O masing-masing sebesar 0.26, 0.28 dan 0.43 µmol mL^-1 jam^-1. Reduksi N₂O berlangsung seiring dengan pertumbuhan.

Isolat BL2 memiliki perbedaan bentuk koloni dengan BL1 dan BLN1.

Berdasarkan uji menggunakan API 20NE, di antara ketiga isolat terdapat perbedaan sifat fisiologis dalam hal hidrolisis eskulin dan P-nitrofenil-β-D- galaktopiranosida serta asimilasi potasium glukonat dan trisodium sitrat.

Identifikasi berdasarkan sifat-sifat fisiologis memberikan hasil bahwa isolat BLN1 memiliki kemiripan 99.9% dengan Ochrobactrum anthropi sedangkan isolat BL1 dan BL2 tidak teridentifikasi. Berdasarkan analisis 16S rRNA, isolat BL1, BL2 dan BLN1 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 99, 95 dan 98% dengan Ochrobactrum anthropi ATCC 49188. Dengan demikian tiga isolat yang ditemukan dapat disebut sebagai bakteri O. anthropi BL1, Ochrobactrum sp. BL2 dan O. anthropi BLN1. Analisis terhadap gen nosZ belum memberikan hasil yang diharapkan.

Penambahan isolat BLN1 dapat mengurangi konsentrasi N₂O yang terlarut dalam air permukaan dari 31.12 menjadi 12.94 nmol L^-1 pada jam ke-6 setelah penambahan 0.6 mmol NO3-

. Emisi N2O ke udara tidak dipengaruhi penambahan isolat BLN1.

Kata kunci: bakteri denitrifikasi, reduksi N2O, tanah sawah

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI DENITRIFIKASI PEREDUKSI DINITROGEN

OKSIDA (N

₂

O) YANG DIISOLASI DARI TANAH SAWAH

RATNA SETYANINGSIH

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Departemen Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

Judul Disertasi : Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah

Nama : Ratna Setyaningsih

NIM : G361060041

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si Ketua

Dr. Ir. Prihasto Setyanto, M.Sc. Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto M.Sc.

Anggota Anggota

Mengetahui

Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr Tanggal Ujian: 5 April 2011 Tanggal Lulus:

Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si Dr. Rahayu Widyastuti, M.Sc

Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. rer. nat. Sarjiya Antonius Dr. Ibnul Qayim

PRAKATA

Puji Tuhan atas kasih dan pertolonganNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan dari September 2007 sampai Juli 2010 ini berjudul Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi Dinitrogen Oksida (N₂O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si., Bapak Dr. Ir. Prihasto Setyanto, M.Sc dan Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. selaku pembimbing yang telah memberikan banyak bimbingan dan arahan.

Selain itu juga terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si. dan Dr.

Rahayu Widyastuti M.Sc. sebagai penguji pada ujian tertutup serta Dr. rer. nat.

Sarjiya Antonius dan Dr. Ibnul Qayim sebagai penguji pada ujian terbuka.

Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan tugas belajar serta Institut Pertanian Bogor (IPB) yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menempuh studi di Program Doktor Sekolah Pascasarjana. Juga ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional atas biaya pendidikan dan penelitian melalui Beasiswa Bantuan Program Pascasarjana dan Program Sandwich. Selain itu penulis menyampaikan penghargaan kepada Prof. David B. Nedwell yang telah memberikan bimbingan dan ijin penelitian selama penulis melaksanakan penelitian yang merupakan bagian dari disertasi melalui Program Sandwich di Microbial Ecology Laboratories, Department of Biological Sciences, University of Essex, Colchester, United Kingdom. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang tua serta kakak-kakak dan adik yang telah memberikan dukungan doa, serta teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB atas kerjasamanya.

Bogor, April 2011 Ratna Setyaningsih

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Surakarta pada tanggal 14 Juli 1966 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara pasangan Bapak Sihiman dan Ibu Koesmarsini.

Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi Lingkungan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, lulus tahun 1992. Selanjutnya dari universitas yang sama penulis mendapatkan gelar Magister Sains Program Studi Biologi pada tahun 2001. Penulis melanjutkan pendidikan Program Doktor di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor sejak tahun 2006.

Penulis bekerja sebagai dosen di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta sejak tahun 1999.

Penulis menekuni bidang Mikrobiologi dengan spesialisasi Mikrobiologi Lingkungan. Selama mengikuti Program Doktor penulis telah menulis artikel pada jurnal Microbiology Indonesia Volume 4 Nomor 2 dengan judul Physiologycal Characterization and Molecular Identification of Denitrifying Bacteria Possesing Nitrous Oxide High Reduction Activity Isolated from Rice Soils dan menyampaikan makalah berjudul The Growth and Nitrous Oxide Reduction Ability of Denitrifying Bacterium Isolated From Rice Field pada International Seminar of Indonesian Society for Microbiology, 4-7 Oktober 2010 di Bogor dan makalah berjudul Reduksi Dinitrogen Oksida (N₂O) oleh Isolat-isolat Bakteri Ochrobactrum yang Diisolasi dari Tanah Sawah pada Seminar Nasional Sains III, 13 November 2010 di Bogor.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL... 15

DAFTAR GAMBAR... 16

DAFTAR LAMPIRAN... 17

PENDAHULUAN Latar Belakang... 18

Tujuan... 20

Hipotesis... 21

Manfaat Penelitian... 21

TINJAUAN PUSTAKA Gas Rumah Kaca... 22

N₂O di Atmosfer... 22

Jalur-jalur Pembentukan N2O... 23

Denitrifikasi pada Bakteri... 25

Enzim-enzim dan Gen-gen yang Berperan dalam Proses Denitrifikasi... 26

Reduksi N2O... 30

Keanekaragaman dan Penyebaran Bakteri Denitrifikasi... 32

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Emisi N2O dari Tanah... 34

Emisi N2O di Sawah... 35

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian... 37

Bahan... 38

Isolasi Bakteri... 38

Pembuatan Inokulum... 39

Uji Oksidatif/Fermentatif... 39

Pengukuran Reduksi NO₃^-... 40

Pengukuran Akumulasi NO2- ... 41

Seleksi Berdasarkan Pertumbuhan dan Kemampuan Mereduksi N₂O... 41

Pengukuran Kinetika Pertumbuhan Menggunakan N₂O... 42

Pengukuran Kecepatan Reduksi N2O dan Pertumbuhan... 43

Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri... 44

Analisis Molekuler Gen nosZ... 46

Uji Penurunan Emisi N2O... 48

HASIL Isolat-isolat yang Didapatkan... 50

Kemampuan Bakteri Mereduksi NO3- dan Mengakumulasi NO2- .... 51

Pertumbuhan Bakteri dan Kemampuan Mereduksi N₂O... 52

Kinetika Pertumbuhan Bakteri Menggunakan N₂O... 53

Kecepatan Reduksi N2O dan Pertumbuhan... 57

Karakter dan Identitas Bakteri... 59

Gen nosZ... 62

N2O di Udara... 64

N2O di Air Permukaan... 65

PEMBAHASAN... 67

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan... 78

Saran... 78

DAFTAR PUSTAKA... 80

LAMPIRAN... 93

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Jumlah isolat bakteri yang didapatkan dari tanah sawah di daerah

Bogor dan Tangerang ... 51 2 Kemampuan isolat-isolat bakteri mereduksi NO3-

dan mengakumulasi

NO₂pada inkubasi selama 3 hari ... 52 3 Pertumbuhan isolat-isolat bakteri dan reduksi N₂O setelah diinkubasi

selama 5 hari... 53 4 Kecepatan pertumbuhan maksimum (µmax) dan konstanta Monod (Ks)

isolat BL1, BL2 dan BLN1 ... 55 5 Kecepatan reduksi N2O (vred), kecepatan pertumbuhan spesifik (µ) dan

waktu generasi (g) isolat BL1, BL2 dan BLN1... 57 6 Karakter fisiologis isolat BL1, BL2 dan BLN1 berdasarkan API 20NE. 60 7 Perbandingan hasil identifikasi menggunakan API 20NE dan sekuen

16S rRNA dari isolat BL1, BL2 dan BLN1 ... 61 8 Emisi N₂O tanpa dan dengan penambahan isolat BLN1 setelah

penambahan 0.6 mmol NO₃^-... 65 9 Peningkatan konsentrasi N2O di air permukaan tanpa dan dengan

penambahan isolat BLN1 setelah penambahan 0.6 mmol NO3-

... 66

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Transformasi N yang menghasilkan N₂O yaitu jalur (1) denitrifikasi,

(2) reduksi NO₃^- disimilatif menjadi NH₄⁺ (DNRA) dan (3) nitrifikasi. 25 2 Transformasi nitrogen oleh mikroba ... 26 3 Organisasi dan tempat terjadinya rantai pemindahan elektron pada

P. stutzeri ... 27 4 Bagan alir penelitian ... 37 5 Uji penurunan emisi N2O menggunakan sedimen tanah sawah... 49 6 Pola pertumbuhan isolat BL1, BL2 dan BLN1 dalam biakan dengan

konsentrasi N2O terlarut 88, 900, 1380 dan 1979 µM ... 54 7 Plot Hanes dari isolat BL1, BL2 dan BLN1 yang ditumbuhkan

menggunakan N₂O ... 56 8 Pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O isolat BL1, BL2 dan BLN1... 58 9 Koloni isolat BL1, BL2 dan BLN1 yang ditumbuhkan di permukaan

medium denitrifikasi agar-agar ... 59 10 Gel agarosa yang menunjukkan pita potongan DNA dari gen penyandi

16S rRNA hasil amplifikasi PCR menggunakan primer 63F dan

1387R... 61 11 Pohon filogenetik dari potongan gen penyandi 16S rRNA (700 basa)

isolat BL1, BL2 dan BLN1 serta beberapa bakteri anggota filum

Proteobacteria... 62 12 Gel agarosa yang menunjukkan pita potongan DNA hasil amplifikasi

PCR menggunakan primer nosZ661fF dan nosZ1773R... 63 13 Banyaknya N2O di udara tanpa dan dengan penambahan isolat BLN1

setelah penambahan 0.6 mmol NO₃^-... 65 14 Konsentrasi N₂O di air permukaan tanpa dan dengan penambahan

isolat BLN1 setelah penambahan 0.6 mmol NO3-

... 66

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Sampel tanah, biakan pengkayaan, medium dan tabung untuk seleksi pertumbuhan dan kemampuan mereduksi N₂O, dan uji emisi

N2O menggunakan tanah sawah... 94

2 Bahan kimia untuk analisis, bufer dan medium ... 96

3 Kurva standar.. ... 98

4 Jenis dan tekstur tanah sampel... 100

5 Uji API 20NE... 101

6 Hasil BLASTN sekuen 16S rRNA... 102

7 Urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga sebagai gen nosZ. Pita merupakan hasil PCR dengan suhu penempelan 56 °C... 106

8 Hasil BLASTX urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga sebagai gen nosZ. Pita merupakan hasil PCR dengan suhu penempelan 56 °C... 108

9 Hasil kloning... 110

10 Hasil BLASTX urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga sebagai gen nosZ. Pita merupakan hasil kloning... 111

11 Analisis varian... 113

12 Penempelan primer... 115

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Perubahan iklim yang disebabkan oleh gas-gas rumah kaca merupakan masalah global yang penting selama beberapa dekade terakhir ini. Pengurangan emisi gas-gas rumah kaca menjadi kajian pokok dalam banyak pertemuan tingkat internasional yang berkaitan dengan perubahan iklim. Pengurangan emisi dilakukan di berbagai sektor termasuk pertanian. Lahan pertanian termasuk sawah merupakan salah satu sumber emisi gas-gas rumah kaca seperti metana (CH4) dan dinitrogen oksida (N₂O). Sebagai negara agraris dengan sebagian besar penduduk mengkonsumsi beras sebagai bahan makanan pokok, masalah emisi gas-gas rumah kaca dari lahan sawah di Indonesia menjadi penting terutama upaya pencegahannya.

Selain merupakan gas rumah kaca, N₂O dapat merusak lapisan ozon di stratosfer (Conrad 1996). Gas ini memiliki potensi pemanasan global 298 kali lebih besar dibandingkan dengan CO₂. Masa tinggal N₂O di atmosfer selama 114 tahun, jauh lebih tinggi dari pada CH₄ dengan masa tinggal selama 12 tahun.

Konsentrasi N₂O di atmosfer meningkat dari 314 ppb pada tahun 1998 menjadi 319 ppb pada tahun 2005 (Forster dan Ramaswamy 2007).

Lebih dari sepertiga emisi total N2O berasal dari aktivitas manusia (antropogenik) (IPCC 2007). Lahan pertanian merupakan sumber N2O antropogenik terbesar. Emisi N2O dari lahan pertanian sebesar 2.8 TgN per tahun atau 15.82 % dari total emisi N2O (Denman dan Brasseur 2007). Emisi N2O dari lahan pertanian meningkat dengan adanya peningkatan penggunaan pupuk nitrogen (N) (Freney 1997).

Emisi N2O dari tanah berasal dari N2O yang diproduksi dalam tanah.

Produksi N2O dalam tanah terutama melalui dua proses mikrobiologis yaitu denitrifikasi dan nitrifikasi. Jika tanah dalam keadaan kering atau teraerasi, N2O dihasilkan terutama melalui proses nitrifikasi. Sebaliknya jika tanah dalam kondisi basah atau kurang aerasi, denitrifikasi merupakan proses utama yang menghasilkan N2O (Davidson et al. 1986; Skiba et al. 1993). Denitrifikasi berperan sebesar 85-90% mengemisikan N2O pada kondisi tanah jenuh oleh air

(Mathieu et al. 2006). Jika pori tanah 35-60% terisi air, emisi N₂O terutama dihasilkan melalui proses nitrifikasi. Emisi N₂O melalui proses nitrifikasi dapat mencapai 81% pada tanah dengan 60% pori terisi air (Bateman dan Baggs 2005).

Di sawah, kondisi tergenang dan kering secara bergantian memacu terbentuknya N2O melalui denitrifikasi (Garcia dan Tiedje 1981) maupun nitrifikasi (Byrnes et al. 1993).

Beberapa faktor lingkungan seperti ketersediaan oksigen (O2), nitrogen, bahan organik dan kandungan air tanah mempengaruhi produksi N2O yang berakibat berpengaruh pula terhadap emisi N2O (Dobbie dan Smith 2001;

Włodarczyk et al. 2004; Zhao et al. 2009). Selain faktor lingkungan, komunitas mikroba dalam tanah mempengaruhi pula produksi dan emisi N2O (Chèneby 1998; Holtan-Hartwig et al. 2000)

Holtan-Hartwig et al. (2000) membandingkan emisi N2O dari tiga tempat yang ada di Jerman, Swedia dan Finlandia. Secara in situ, emisi N2O dari lahan di Swedia lebih rendah (4.0 kg N2O-N ha^-1 th^-1) dibandingkan dengan Jerman (14.6 kg N2O-N ha^-1 th^-1) dan Finlandia (8.3 kg N2O-N ha^-1 th^-1). Hasil pengukuran terhadap tanah dari tiga tempat tersebut yang telah diseragamkan kondisinya di laboratorium menunjukkan bahwa tanah yang berasal dari Swedia memiliki rasio V_max reduksi NO₃^- : V_max reduksi N₂O lebih rendah (0.3) dibandingkan sampel tanah dari Jerman (2.0) dan Finlandia (1.0). Tanah yang lebih sedikit mengemisikan N₂O memiliki rasio V_max reduksi NO₃^- : V_max reduksi N₂O lebih kecil. Rasio V_max reduksi NO₃^- : V_max reduksi N₂O di tanah ditentukan oleh komposisi komunitas mikroba terutama bakteri dalam tanah tersebut.

Komunitas bakteri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap besarnya emisi N₂O dari suatu ekosistem. Dengan demikian, memodifikasi komposisi komunitas bakteri merupakan salah satu usaha yang diharapkan dapat menurunkan emisi N2O. Penambahan isolat bakteri yang memiliki aktivitas mereduksi N2O tinggi diharapkan dapat menekan produksi N2O sehingga menurunkan tingkat emisinya.

Reduksi N2O merupakan tahap terakhir proses denitrifikasi. Meskipun demikian tidak semua bakteri denitrifikasi dapat mereduksi N2O. Bakteri denitrifikasi yang telah diketahui dapat mereduksi N2O menjadi N2 di antaranya

adalah Pseudomonas stutzeri (Carlson dan Ingraham 1983), Azospirillum brasilense (Tibelius dan Knowles 1984), Paracoccus denitrificans (Snyder et al.

1987), P. aeruginosa (Snyder et al. 1987), Rhodobacter sphaeroides (Itoh et al.

1989) serta Bradyrhizobium japonicum (Sameshima-Saito et al. 2006). Di antara bakteri yang memiliki kemampuan mereduksi N2O, tidak semuanya dapat mereduksi N₂O yang ada di luar selnya (eksogen) (Zumft 1997). Beberapa galur pereduksi N2O lebih efisien menggunakan N2O yang dihasilkannya sendiri (endogen) untuk pertumbuhan (Bazylinski et al. 1986) dibandingkan menggunakan N2O eksogen. Ketahanan dan tingkat kemampuan bakteri mereduksi N2O juga berbeda di antara galur yang berbeda (Snyder et al. 1987) dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan terutama O2 (Watahiki et al. 1983).

Meskipun penelitian tentang bakteri denitrifikasi yang memiliki kemampuan mereduksi N2O telah banyak dilakukan, namun masih belum ada penelitian yang mengarah kepada pengembangan potensi dan pemanfaatan isolat bakteri denitrifikasi untuk menurunkan emisi N2O. Bakteri yang memiliki aktivitas tinggi mereduksi N2O eksogen berpotensi untuk mengurangi N2O di lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteri denitrifikasi asal tanah sawah yang memiliki aktivitas tinggi dalam mereduksi N₂O sehingga akan dapat dimanfaatkan sebagai inokulum untuk menurunkan emisi N₂O dari lahan sawah.

Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat-isolat bakteri denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N₂O dan berpotensi menurunkan emisi N₂O. Tujuan tersebut dicapai melalui beberapa tahap kegiatan penelitian yaitu: 1) mengisolasi bakteri denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O 2) mengukur pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O 3) mengidentifikasi isolat–isolat 4) menganalisis gen nosZ penyandi enzim N2O reduktase dan 5) menguji kemampuan isolat terpilih dalam menurunkan emisi N2O di tanah sawah.

Hipotesis

Di antara bakteri-bakteri yang hidup di sawah terdapat bakteri denitrifikasi yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N₂O. Bakteri-bakteri tersebut dapat diisolasi dan diidentifikasi serta dapat digunakan sebagai inokulum untuk menurunkan emisi N2O dari tanah sawah.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini memberikan informasi awal tentang isolat-isolat bakteri denitrifikasi asal sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O, karakter dan identitasnya. Isolat-isolat bakteri ini, melalui studi lebih lanjut dapat dimanfaatkan untuk mengurangi emisi N2O dari sawah.

TINJAUAN PUSTAKA

Gas Rumah Kaca

Energi radiasi matahari dipancarkan ke bumi terutama dalam bentuk radiasi dengan panjang gelombang pendek misalnya ultraviolet. Kurang lebih sepertiga energi dipantulkan oleh bagian atas atmosfer sedangkan sekitar dua pertiganya diserap permukaan bumi. Bumi memantulkan energi radiasi yang diterimanya sebagian besar dalam bentuk radiasi infra merah. Radiasi termal yang dipancarkan oleh bumi diserap oleh atmosfer dan dipancarkan kembali ke bumi, sehingga menimbulkan efek rumah kaca. Secara alami tanpa efek rumah kaca suhu bumi akan berada di bawah 0 °C (Le Treut dan Somerville 2007).

Aktivitas manusia menghasilkan emisi empat macam gas-gas rumah kaca utama yaitu CO2, CH4, N2O dan halokarbon yang mengandung fluorin, klorin dan bromin. Gas-gas tersebut terakumulasi di atmosfer sehingga konsentrasinya meningkat sejalan dengan waktu. Peningkatan konsentrasi CO2 disebabkan oleh penggunaan bahan bakar fosil, alat pengatur suhu ruang dan penebangan hutan.

Peningkatan CH₄ antara lain sebagai hasil kegiatan pertanian dan penimbunan bahan organik, sedangkan emisi N₂O meningkat oleh penggunaan pupuk N dan pembakaran bahan bakar fosil. Halokarbon misalnya klorofluorokarbon (chlorofluorocarbon=CFC) yang digunakan sebagai bahan pendingin selain merupakan gas rumah kaca juga dapat merusak ozon (Forster dan Ramaswamy 2007).

Gas-gas rumah kaca memiliki kekuatan radiatif (radiative forcing=RF).

Kekuatan radiatif bernilai positif menyebabkan pemanasan bumi (Forster dan Ramaswamy 2007). Peningkatan kekuatan radiatif atmosfer bumi menyebabkan perubahan iklim secara cepat sehingga dapat mengganggu aktivitas manusia dan ekosistem alami (Schlesinger 2003).

N₂O di Atmosfer

Pada satu abad terakhir ini, aktivitas manusia secara dramatis meningkatkan emisi dan pelepasan N reaktif ke atmosfer bumi, yaitu sebanyak tiga sampai lima kali. Gangguan terhadap siklus N mempengaruhi sistem iklim di

atmosfer oleh adanya tiga gas N utama yaitu N₂O, amonia (NH₃) dan NO_x (nitrik oksida (NO) + nitrogen dioksida (NO₂)). Aktivitas manusia meningkatkan pasokan N ke pantai dan laut lepas, menurunkan ketersedian O₂ dan emisi N₂O.

Meskipun demikian pertanian merupakan sumber N₂O antropogenik terbesar (Denman dan Brasseur 2007).

Dinitrogen oksida memiliki nilai RF positif di urutan keempat terbesar di antara gas-gas rumah kaca yang memiliki masa tinggal lama (longlife greenhouse gases=LLGHGs) setelah CO2, CH4 dan CFC-12. Nilai RF N2O sebesar +0,16 Watt m^-2 sedangkan nilai total RF dari LLGHGs sebesar +2,63 Watt m^-2 (Forster dan Ramaswamy 2007). Selain merupakan gas rumah kaca, N2O memiliki efek merusak lapisan ozon (O3) di stratosfer. Sebagian besar (90%) O3 berada di stratosfer (ketinggian 10-50 km) sedangkan sisanya (10%) di troposfer (0-10 km).

O3 menyerap kuat radiasi ultraviolet terutama pada panjang gelombang antara 200-290 nm. Panas yang diserap oleh O3 menyebabkan suhu maksimum di ketinggian 50 km (Fraser 1997). Kerusakan O3 di stratosfer disebabkan oleh emisi uap air dan N oksida dari pesawat jet supersonik, reaksi-reaksi kimia yang terjadi di stratosfer, difusi klorofluorometan yang digunakan untuk alat pendingin dan difusi N2O dari troposfer (Knowles 1982).

Jalur-jalur Pembentukan N2O

Lebih kurang sebesar 90% gas N₂O secara global dihasilkan dari proses biotik (Paul dan Clark 1996). Mikroba terutama bakteri berperan penting dalam menghasilkan N₂O, salah satunya melalui proses denitrifikasi. Menurut Zumft (1997) transformasi N lengkap pada jalur denitrifikasi adalah NO₃^- → NO₂^- → NO → N₂O → N₂. Denitrifikasi tidak lengkap merupakan proses reduksi NO₃^- yangberakhir pada N₂O. Pada umumnya hal tersebut terjadi jika tidak ada enzim N2O reduktase. Snyder et al. (1987) melaporkan bahwa bakteri yang kehilangan aktivitas enzim N2O reduktase tidak dapat mereduksi N2O sehingga N2O merupakan hasil akhir denitrifikasi.

Gas N2O juga dihasilkan sebagai hasil antara proses nitrifikasi. Nitrifikasi terdiri dari dua tahap proses yang melibatkan dua kelompok mikroba. Kelompok pertama mengoksidasi NH4+

menjadi NO2-

sedangkan kelompok kedua

mengoksidasi NO₂^- menjadi NO₃^- (Paul dan Clark 1996). Penelitian terhadap bakteri nitrifikasi Nitrosomonas sp. memberikan hasil bahwa jika nitrifikasi terjadi pada konsentrasi O₂ lebih rendah dari yang dibutuhkan, produksi NO₂^- sedikit dan akan banyak dihasilkan N₂O. Gejala yang sama ditunjukkan oleh bakteri Nitrosolobus, Nitrospira dan Nitrosococcus. Dalam proses oksidasi NH4+

menjadi NO₂^-, hidroksilamin (NH₂OH) merupakan hasil antara. Pada Nitrosomonas, radikal nitroksil (HNO) dihasilkan sebagai hasil antara oksidasi NH2OH menjadi NO2-

. Diduga, HNO akan terdekomposisi secara spontan menjadi N2O (Goreau et al. 1980; Roswall 1981).

Jalur lain yang dapat menghasilkan N2O adalah reduksi NO3-

disimilatif menghasilkan NH4+

(dissimilatory nitrate reduction to ammonium=DNRA).

Dalam proses DNRA, NO3-

direduksi menjadi NO2-

dan selanjutnya NO2-

direduksi menjadi NH4+

dengan N2O sebagai hasil samping (Kelso 1997) (Gambar 1). Terdapat dua jalur DNRA. Jalur pertama adalah reduksi NO3-

disimilatif yang berpasangan dengan aliran elektron dari bahan organik untuk mereduksi NO3-

melalui reaksi fermentasi dan proses ini pada umumnya terjadi di lingkungan dengan NO₃^- terbatas dan kaya akan C labil (karbon yang bersifat mudah dirombak). Jalur DNRA yang kedua adalah khemolitoautotrofik, reduksi NO₃^- berpasangan dengan oksidasi sulfur (S) dalam bentuk tereduksi (Stark dan Richards 2008). Proses DNRA dapat menjadi sumber emisi N₂O di lingkungan yang berada dalam keadaan tergenang pada waktu yang lama (Włodarczyk et al.

2004). Childs et al. (2002) menyatakan, bakteri DNRA dapat bersaing dengan bakteri denitrifikasi di lingkungan dengan NO₃^- terbatas karena bakteri DNRA memindahkan elektron lebih banyak ke NO₃^- yaitu sebanyak delapan elektron per mol NO₃^-, dibandingkan bakteri denitrifikasi yang memindahkan lima elektron per mol NO₃^-.

Gambar 1 Transformasi N yang menghasilkan N2O yaitu jalur (1) denitrifikasi, (2) reduksi NO₃^- disimilatif menghasilkan NH₄⁺ (DNRA) dan (3) nitrifikasi (dimodifikasi dari Kelso 1997).

Denitrifikasi pada Bakteri

Nitrogen merupakan salah satu unsur utama penyusun sel. Di alam, N berada dalam bentuk-bentuk yang memiliki bilangan oksidasi berbeda.

Denitrifikasi merupakan bagian dari siklus transformasi N di alam (Gambar 2).

Nitrogen masuk ke lingkungan kehidupan (biosfer) melalui fiksasi N2 dan keluar dari biosfer melalui proses denitrifikasi (Zumft 1997).

Pada proses denitrifikasi, bakteri menggunakan N oksida sebagai penerima elektron terakhir untuk bioenergetik seluler dalam keadaan anaerob, mikroaerofil atau bahkan dalam kondisi aerob. Denitrifikasi merupakan proses transformasi secara disimilatif, berhubungan dengan konservasi energi. Pemindahan elektron secara enzimatik berpasangan dengan sintesis adenosine triphosphate (ATP) melalui translokasi proton dan pembentukan potensial membran. Terjadinya denitrifikasi dalam sel dipicu oleh kondisi lingkungan dengan tekanan O2 rendah dan tersedianya N oksida (Zumft 1997).

Meskipun denitrifikasi pada umumnya berlangsung dalam kondisi anaerob dan aktivitas enzim-enzim denitrifikasi dihambat oleh O2, beberapa bakteri dapat melakukan proses denitrifikasi dalam kondisi aerob. Pseudomonas stutzeri SU2

1

NO3 -

NO2 -

N2O

N2

NH2OH 1 2

1

2

2

3 3 3 NO

NH4 +

mereduksi NO₃^- menghasilkan N₂ tanpa akumulasi NO₂^- selama 92 jam pada kondisi konsentrasi O₂ di lingkungan 92% dan NO₃^- yang tereduksi sebanyak 99.24% (Su et al. 2001a). Pada kondisi yang sama Pseudomonas stutzeri NS-2 dan Pseudomonas stutzeri SM-3 mereduksi NO₃^- menghasilkan N₂ hampir tanpa akumulasi NO2-

selama 20 jam (Su et al. 2001b). Thiosphaera pantotropha LMD 82.5 dapat melakukan seluruh proses denitrifikasi dalam kondisi aerob (Van Niel 1992). Pada Thauera mechernichensis DSM12266 reduksi NO3-

terjadi dalam keadaan aerob tetapi N2O terbentuk dalam kondisi anaerob (Scholten et al. 1999).

Gambar 2 Transformasi nitrogen oleh mikroba (Francis et al. 2007). DNRA:

dissimilatory nitrate reduction to ammonium (reduksi NO3-

disimilatif menghasilkan NH4+

), Annamox: anaerobic ammonium oxidation (oksidasi amonium anaerob).

Enzim-enzim dan Gen-gen yang Berperan dalam Proses Denitrifikasi

Selama proses denitrifikasi yang melibatkan empat tahap reduksi secara berurutan, beberapa metaloenzim mengkatalisis reduksi NO₃^- berturut-turut menjadi NO₂^-, NO, N₂O dan N₂. Metaloenzim tersebut adalah NO₃^- reduktase (Nar dan Nap), NO₂^- reduktase (Nir), NO reduktase (Nor) dan N₂O reduktase

Remineralisasi Denitrifikasi

N2 N2

Nitrifikasi

Fiksasi N2 Oksidasi amonium Oksidasi nitrit

N organik NH₄⁺ NH₂OH NO₂^- NO₃^- OKSIK

SUBOKSIK NO2-

NO3-

NO₂^- DNRA

NO N₂O Annamox

NH₄⁺ N₂

D e n i t r i f i k a s i

(Nos) (Lalucat et al. 2006). Enzim-enzim tersebut terdapat di membran sitoplasma atau periplasma (Gambar 3).

Denitrifikasi diawali oleh proses reduksi NO₃^-. Ada dua tipe enzim yang mengkatalisis proses ini, yaitu NO₃^- reduktase respiratif terikat membran (Nar) dan NO3-

reduktase periplasmik (Nap). Nar terekspresi hanya pada kondisi pertumbuhan anaerob dan dapat mereduksi klorat. Sedangkan Nap disintesis dan aktif dalam kondisi ada oksigen dan tidak dapat mereduksi klorat (Zumft 1997).

Gambar 3 Organisasi dan tempat terjadinya rantai pemindahan elektron pada P. stutzeri. Komponen rantai respirasi aerob konstitutif terdiri dari NADH dehidrogenase (DH), siklus quinon (Q, QH2), kompleks sitokrom bc1 (sit bc₁), dan kompleks oksidase terakhir sitokrom cb (sit cb). Sistem denitrifikasi terdiri dari NO3-

reduktase (Nap dan Nar), NO2-

reduktase (Nir), NO reduktase (Nor) dan N2O reduktase (Nos). Singkatan: FeS, pusat besi-belerang; b, heme b; c, heme c;

d, heme d; sit c, sitokrom tipe c menerima elektron dari kompleks bc1; sit551, sitokrom c551 (Zumft 1997).

Nar menghasilkan kekuatan mendorong proton (proton motif force=PMF) yang memungkinkan terjadinya sintesis ATP (Moreno-Vivián 1999). Enzim ini pada Pseudomonas stutzeri terdiri dari tiga subunit yaitu α, β dan γ. Subunit α (NarG) merupakan pusat katalitik, terdiri dari molibdenum dan dua kofaktor pterin (molybdopterin guanine dinucleotide=MGD). Kompleks besi belerang

Nos

NO2^-

NADH+H⁺ NAD⁺ NO3-

NO2

- Sitoplasma

Periplasma

QH2

Q

H⁺

Sit cb Q

QH2

DH H⁺

NO2-

NO3-

d1

d1

Nir C551 c

NO2-

NO

Nap MGD c

Sitc NO2-

NO3-

NO N2O

c Sitc

b Nor

MGD b

FeS Nar

H⁺ Sitc

Sit bc1

FeS CuZ

CuA

Sitc N2O N2

Cu_Z Cu_A

Nos

dalam subunit β (NarH) berperan dalam pemindahan elektron dari kelompokan quinol di membran sel. Subunit γ (NarI) terletak di membran dan merupakan protein sitokrom b yang mengandung dua gugus heme tipe b (Lalucat et al. 2006).

Pada Pseudomonas aeruginosa narG, narH dan narI merupakan bagian dari operon narK1K2GHJI (Schreiber et al. 2007). Pada Pseudomonas stutzeri terdapat tambahan gen narC yang bersama-sama dengan narK menyandi protein yang diduga merupakan pembawa (Lalucat et al. 2006). Selain itu terdapat gen-gen pengendali untuk Nar yaitu anr, dnr dan narXL (Härtig et al. 1999; Schreiber et al. 2007). Aktivitas Nar dihambat oleh azida, klorat, sianida dan tiosianat (Moreno-Vivián 1999).

Nap hanya dimiliki oleh bakteri Gram negatif (Philippot 2005). Peran fisiologis Nap adalah membuang kekuatan pereduksi yang berlebihan dan menghasilkan NO2-

untuk denitrifikasi aerob (Zumft 1997). Nap tersusun dari subunit katalitik NapA yang mengandung kofaktor molibdopterin dan [4Fe-4S]

serta subunit NapB yang mengandung dua heme tipe c. Kompleks NapAB terletak di periplasmik, menerima elektron dari NapC yang terikat membran. NapC mengandung empat heme tipe c dan diduga berperan dalam pemindahan elektron antara quinol dan Nap (Bedmar et al. 2005; Philippot 2005; Lalucat et al. 2006).

Gen-gen penyandi Nap pada beberapa bakteri tergabung dalam operon napEDABC. Produk napD adalah protein yang dapat larut dan diasumsikan berperan dalam pematangan NapB. Sedangkan napE menyandi protein transmembran yang belum diketahui fungsinya (Bedmar et al. 2004). Aktivitas Nar maupun Nap dikendalikan oleh NO₃^- melalui protein sensor narX dan narQ (Stewart 2003).

Reduksi NO₂^- menjadi NO merupakan tahap yang menentukan untuk terjadinya jalur denitrifikasi. NO yang dihasilkan dapat digunakan sebagai substrat hanya oleh NO reduktase dan harus segera dikeluarkan dari sel karena NO bersifat toksik bahkan pada konsentrasi yang sangat rendah (Baker et al.

1998). Enzim NO2-

reduktase (Nir) terletak di periplasma. Aktivitas reduksi NO2-

pada bakteri denitrifikasi terjadi oleh dua metaloenzim. Kedua enzim tersebut berbeda dalam hal struktur dan senyawa-senyawa logam prostetik yang dimilikinya. Enzim-enzim tersebut yang pertama adalah sitokrom cd1 yang

mengandung heme c dan d₁ sebagai kofaktor esensial, disandi oleh nirS. Yang kedua merupakan NO₂^- reduktase yang mengandung tembaga (Cu) pada sisi aktifnya, disandi oleh nirK. Dua jenis enzim tersebut tidak pernah ditemukan dalam sel yang sama (Lalucat et al. 2006). nirS merupakan bagian dari kelompok gen-gen (operon) nirSTBMCFDLGH penyandi NO2-

oksida reduktase sedangkan nirK merupakan gen tunggal (Bedmar et al. 2005). nirT menyandi sitokrom tetraheme, nirB menyandi sitokrom diheme dan nirM menyandi pemberi elektron (sitokrom c551) untuk nirS. Sedangkan nirMCFDLGH merupakan motif yang dikenali untuk regulator FNR di daerah promotor (Lalucat et al. 2006).

Reduksi NO menjadi N2O dikatalisis oleh dua tipe NO reduktase (Nor), enzim yang terikat ke membran sitoplasma. Tipe pertama memiliki rantai lebih pendek, menerima elektron dari sitokrom c, disebut cNor. Sedangkan tipe kedua yang memiliki rantai lebih panjang menerima elektron dari quinol, disebut qNor (Bedmar et al. 2005; Lalucat et al. 2006). Gen-gen norC dan norB masing-masing menyandi subunit II yang mengandung sitokrom c dan subunit I yang mengandung sitokrom b dari cNor. Bradyrhizobium japonicum memiliki gen-gen penyandi Nor yang tergabung dalam norCBQDE. norQ menyandi protein pengikat ATP atau guanosine triphosphate (GTP) sedangkan produk norD belum diketahui fungsinya. norE menghasilkan protein yang memiliki kemiripan 60%

dengan sitokrom c oksidase tipe aa₃ (Bedmar et al. 2005). Gen-gen norCB dari Paracoccus dilengkapi oleh norQDEF untuk pematangan NO reduktase (Baker et al. 1998). Pada denitrifikasi yang bersifat aerob atau mikroaerofil, ekspresi Nor dihambat konsentrasi oksigen tinggi (Zumft 1997).

Enzim yang berperan pada tahap terakhir denitrifikasi adalah N₂O reduktase (Nos). Nos dari P. stutzeri lebih intensif dipelajari dari pada Nos bakteri lain. Enzim ini merupakan enzim dimer yang terletak di periplasma dan ada dalam beberapa bentuk. Bentuk I dapat diisolasi dalam keadaan anaerob, berwarna ungu. Bentuk II berwarna merah muda, didapatkan jika Nos diisolasi dalam kondisi aerob. Bentuk II memiliki aktivitas rendah, juga kandungan Cu rendah, diduga karena oksigen mempengaruhi pusat katalitik. Bentuk I berubah menjadi bentuk III yang berwarna biru jika ditionit ditambahkan. Bentuk IV dapat dibuat dari apoenzim dengan inkubasi menggunakan Cu(II). Bentuk ini tidak aktif

secara katalitik. Bentuk V didapatkan dari Pseudomonas stutzeri mutan MK402 yang tidak dapat membentuk pusat katalitik. Setiap subunit enzim, yang disandi oleh nosZ, mengandung dua pusat Cu. Ion logam yang terkandung paling sedikit enam ion Cu setiap subunit. Kedua pusat tersebut adalah Cu_A yang merupakan sisi masuknya elektron, dan CuZ yaitu sisi untuk mengikat substrat (Lalucat et al.

2006). Demaneche et al. (2009) menemukan ada dua tipe kelompok gen-gen penyandi N2O reduktase yaitu nosRZDFYLX dan nosRZDFYL. nosZ merupakan gen struktural untuk enzim N2O reduktase yang mengandung Cu. nosR menyandi komponen regulator yang penting untuk transkripsi nosZ. nosDFY merupakan gen untuk pematangan, produknya antara lain terlibat dalam perolehan dan proses penggabungan Cu membentuk N2O reduktase yang aktif secara katalitik. Selain itu terdapat nosL penyandi NosL yang merupakan kaperon Cu (Lalucat et al.

2006). Sedangkan nosX menyandi komponen periplasmik (Demaneche et al.

2009). Aktivitas N2O reduktase dihambat oleh asetilen, karbon monoksida (CO), azida dan sianida (Kristjansson dan Hollocher 1980).

Beberapa faktor dapat mempengaruhi ekspresi gen-gen denitrifikasi.

Ekspresi gen-gen penyandi NO₃^- reduktase, NO₂^- reduktase (sitokrom cd₁) dan N2O reduktase dipengaruhi oleh perbedaan tingkat O2 dan ketersediaan N oksida (Körner dan Zumft 1989). Ekspresi gen-gen norB dan nirS dari Pseudomonas mandelii tidak sensitif terhadap perubahan pH pada kisaran 6-8 tetapi menurun pada pH 5. Gen-gen tersebut tertunda induksi dan ekspresi maksimumnya pada suhu di bawah 30 °C (Saleh-Lakha 2009). Aktivitas enzim-enzim denitrifikasi di tanah kering menurun sekitar 16-29% setelah 7 hari inkubasi. Aktivitas enzim- enzim akan kembali ke kondisi semula jika tanah dilembabkan kembali (Smith dan Parsons 1985).

Reduksi N₂O

Konversi N2O menjadi N2 merupakan tahap akhir dari jalur denitrifikasi.

Beberapa bakteri denitrifikasi dapat tumbuh menggunakan N2O sebagai satu- satunya penerima elektron terakhir. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa tidak semua bakteri denitrifikasi dapat tumbuh baik menggunakan N2O eksogen.

Hasil penelitian Bazylinski et al. (1987) menunjukkan bahwa Pseudomonas

aeruginosa galur P2 tumbuh baik menggunakan N₂O eksogen sedangkan galur PAO1 dan P1 hanya menunjukkan sedikit pertumbuhan menggunakan N₂O eksogen.

Bakteri-bakteri yang telah diketahui dapat tumbuh menggunakan dan mereduksi N2O eksogen adalah Pseudomonas stutzeri JM300 dan Paracoccus denitrificans ATCC 19367 (Carlson dan Ingraham 1983). Galur yang berbeda- beda dari Pseudomonas aeruginosa memiliki tanggapan berbeda terhadap N2O eksogen. Galur P2 tumbuh baik menggunakan N2O eksogen jika NO3-

atau NO2-

(2-10 mM) ditambahkan di medium. Untuk galur PAO1 dan P1, N2O eksogen hanya sedikit berpengaruh terhadap hasil sel dan pertumbuhan, dengan penambahan NO3-

di medium. N2O eksogen tidak secara langsung menghambat pertumbuhan tetapi juga tidak secara signifikan digunakan untuk pertumbuhan.

Nampaknya NO3-

, NO2-

atau produk metabolismenya dapat menstimulasi galur P2 (tetapi tidak pada PAO1 dan P1) untuk tumbuh pada N2O eksogen. Ketiga galur tersebut menggunakan N2O endogen secara efisien untuk pertumbuhannya (Bazylinski et al. 1986).

Dalam biakan denitrifikasi Pseudomonas sp.220 terjadi akumulasi N₂O jika O2 ditambahkan dengan tekanan 0.05 atm, karena reduksi N2O dihambat oleh O₂ sebelum terjadinya penghambatan O₂ terhadap reduksi NO₂^- (Watahiki et al.

1983). Meskipun pada umumnya enzim N₂O reduktase memiliki korelasi negatif paling kuat terhadap tingkat konsentrasi O₂ di lingkungannya dibandingkan dengan enzim-enzim denitrifikasi lainnya seperti pada penelitian Morley et al.

(2008), tetapi N₂O reduktase dari Thiosphaera pantotropha (Paracoccus denitrificans GB17) tetap aktif mereduksi N₂O meskipun dalam biakan terdapat O₂. Kedua gas yaitu N₂O dan O₂ direduksi secara bersamaan (Bell dan Ferguson 1991).

Dalam tanah, N2O dapat mengalami reduksi sebelum teremisikan. Reduksi N2O menjadi N2 oleh aktivitas N2O reduktase merupakan proses yang dominan dibandingkan dengan reduksi N2O menjadi NH3 oleh aktivitas nitrogenase.

Potensi reduksi N2O oleh tanah tergantung kepada konsentrasi N2O dan O2, ukuran agregat tanah serta suhu. Agregat yang besar lebih banyak mengkonsumsi N2O karena agregat besar membentuk kondisi anaerob di dalamnya. N2O dapat

menjadi penerima elektron dalam kondisi suboksik, bahkan jika respirasi aerob masih aktif. Respirasi N₂O dan respirasi O₂ terjadi dalam mikrohabitat yang terpisah. Kecepatan respirasi lebih tinggi pada suhu 20 °C dibandingkan pada 5

°C (Vieten 2008). Aktivitas N₂O reduktase mereduksi N₂O juga terjadi di sedimen laut, danau air tawar dan danau salin-alkalin (Miller et al. 1986).

Keanekaragaman dan Penyebaran Bakteri Denitrifikasi

Bakteri yang memiliki kemampuan melakukan proses denitrifikasi memiliki sifat fisiologis beraneka ragam. Sebagian besar bakteri denitrifikasi merupakan organisme heterotrof aerob (Zumft 1997). Bakteri Alcaligenes sp.

yang diisolasi dari tanah merupakan bakteri denitrifikasi heterotrof yang sekaligus memiliki kemampuan nitrifikasi (Castignetti dan Hollocher 1982).

Di antara bakteri denitrifikasi terdapat bakteri penambat N2. Bradyrhizobium japonicum merupakan bakteri penambat N2 yang memiliki enzim-enzim untuk reduksi NO3-

, NO2-

, NO dan N2O. NO3-

reduktase berupa NO3-

reduktase periplasmik (Bedmar et al. 2005). Bradyrhizobium japonicum yang bersimbiosis dengan tanaman kedelai dan membentuk bintil akar dapat mereduksi N2O di sekitar akar kedelai (Sameshima-Saito et al. 2006).

Azospirillum brasilense yang diisolasi dari rizoplen tanaman sorgum memiliki kemampuan menambat N₂, denitrifikasi maupun nitrifikasi (Kundu et al. 1987).

Thioalkalivibrio denitrificans ALJD adalah bakteri denitrifikasi yang bersifat alkalifil, autotrof obligat, pengoksidasi belerang dan dapat tumbuh secara anaerob dengan proses denitrifikasi. Bakteri ini dapat menggunakan NO₂^- dan N₂O, tetapi tidak dapat menggunakan NO₃^- sebagai penerima elektron selama pertumbuhan anaerob pada senyawa belerang tereduksi. NO₃^- hanya digunakan sebagai sumber N. Dalam biakan sekali unduh (batch) pada pH 10, pertumbuhan berlangsung cepat dengan menggunakan N2O sebagai penerima elektron dan tiosulfat sebagai pemberi elektron. Pertumbuhan menggunakan NO2-

hanya dapat berlangsung setelah memperpanjang waktu adaptasi biakan terhadap peningkatan konsentrasi NO2-

(Sorokin et al. 2001).

Bakteri denitrifikasi fototrofik Rhodopseudomonas sphaeroides sp.

denitrificans (Rhodobacter sphaeroides IL106) dapat tumbuh secara anaerobik,

dengan atau tanpa cahaya, menggunakan NO₃^-. Bakteri yang ditumbuhkan pada kondisi denitrifikasi, memiliki kandungan bakterioklorofil dan karotenoid setengah dari kandungan senyawa-senyawa tersebut dalam sel yang ditumbuhkan tanpa NO₃^-. Sintesis polipeptida yang merupakan bagian dari kompleks penerima cahaya mengalami tekanan oleh NO3-

, sedangkan aktivitas enzim-enzim denitrifikasi mengalami peningkatan. Jumlah ATP yang dihasilkan selama denitrifikasi mencukupi kebutuhan sel sehingga ATP yang dihasilkan melalui fotosintesis menjadi kurang efektif (Michalski dan Nicholas 1984).

Bakteri denitrifikasi memiliki penyebaran pertumbuhan di banyak lingkungan. Komposisi komunitas bakteri dipengaruhi oleh beberapa hal misalnya jenis pupuk yang ditambahkan ke tanah (Enwall et al. 2005). Di daerah pantai, komposisi komunitas denitrifikasi dipengaruhi oleh lokasi geografis dan kondisi biokimia sedimen terutama konsentrasi NO3-

dan O2 (Liu et al. 2003a).

Komposisi komunitas bersama dengan faktor lingkungan berpengaruh terhadap aktivitas denitrifikasi (Rich et al. 2003).

Lim et al. (2005) mengisolasi bakteri denitrifikasi dari tempat pengolahan limbah dan banyak mendapatkan bakteri dari anggota filum Proteobacteria terutama dari kelas Gammaproteobacteria (Aeromonas, Klebsiella, Enterobacter) dan Betaproteobacteria (Acidoverax, Burkholderia dan Commamonas). Selain itu juga banyak didapatkan bakteri anggota Firmicute (Bacillus). Dari tanah sawah yang memiliki aktivitas denitrifikasi kuat banyak ditemukan bakteri anggota ordo Burkholderiales dan Rhodocyclales (Ishii et al. 2009). Manucharova et al. (2000) mengamati adanya suksesi bakteri denitrifikasi di tanah yang terjadi antara Myxobacteria dengan Bacillus (B. cereus, B. circulans dan B. polymyxa).

Sekuen nirS yang didapatkan dari sedimen pantai memiliki kemiripan tertinggi dengan nirS dari Alcaligenes faecalis (kemiripan 80-94%) dan P. stutzeri (80-99%), sedangkan nirK memiliki kemiripan tertinggi dengan nirK dari Bradyrhizobium japonicum, Blastobacter denitrificans dan Alcaligenes xylosoxidans (Liu et al. 2003a). Dari tanah sawah, sebagian besar nirK memiliki kemiripan tertinggi dengan nirK dari Rhizobiales (Saito et al. 2008). Mayoritas sekuen dari potongan gen nosZ yang diamati dari tanah padang rumput dan hutan