BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Penelitian Terdahulu
Daun nagasari memiliki kandungan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, terpenoid, tanin, fitosterol, dan saponin (Beena et al., 2014; Sharma and Sharma, 2017; Novanti, 2016). Penelitian sebelumnya melakukan isolasi terhadap daun nagasari menggunakan metode kromatografi kolom dengan berbagai macam fase gerak yang digunakan, yang bertujuan untuk mendapatkan fraksi etanol-air, etil asetat, dan fraksi n-heksan. Fraksinasi etanol-air menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi, dengan panjang kolom 5 mm, 150 x 4,6 mm, dengan fase gerak yaitu asetonitril : air (5 : 95 % v/v ), 55 : 45 % v/v, dan 80 : 20 % v/v. Senyawa yang telah berhasil di isolasi pada fraksi etanol-air yaitu cumarin jenis mammea type A/BB (Lucy et al., 2015). kumarin Type A/BB dibagi menjadi dua macam yaitu type A/BB cyclo D dan F. Cumarin jenis mammea A/BB dilaporkan memiliki aktivitas terhadap antibakteri (Gonçalves et al., 2013).
Berikut profil analisis sidik jari FTIR terhadap kumarin jenis mammea pada type D dan F pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Analisis sidik jari FTIR fraksi etanol-air (Gomathi, 2015)
Nama senyawa Panjang serapan (cm-1) Keterangan Cumarins mammea A/BB cyclo D 1740 α- pyrone
3461 Gugus O-H
Cumarins mammea A/BB cyclo F 3453 Gugus O-H
1732 Gamma lakton
1603 Grup asil
Hasil pemisahan senyawa murni pernah dilakukan pada fraksi etil asetat menggunakan kromatografi kolom dengan fase gerak metanol (10 : 0) dan metanol : kloroform (9,5 : 0,5) dan fase diam silika gel (Daud et al,
Tabel 2.2 Analisis Sidik Jari FTIR Fraksi Etil Asetat (Daud et al., 2016) Nama senyawa murni Panjang serapan (cm-1) Gugus Fungsi
Buxixanthone 3410 Gugus hidroksil
1710 Gugus karbonil
1590 Cincin aromatik
Hasil penelitian sebelumnya menunjukan bahwa ekstrak etanol biji nagasari memiliki aktivitas antibakteri dengan nilai MIC 240-980 µ g/ml (Adewale et al., 2011). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak etanol dari nagasari memiliki aktivitas antimikroba yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak pelarut air dengan nilai diameter zona hambat sebesar 17,25 mm (Phuong dan Nhat, 2015). Perbedaan kedua penelitian ini yaitu pada penelitian uji aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol biji nagasari, ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut n-heksana, etanol, metanol, petroleum eter, dan kloroform, sedangkan pada uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun nagasari dengan diameter zona hambat sebesar 17,25 mm, ekstraksi menggunakan pelarut etanol dan air yaitu pelarut air 10% dan pelarut etanol 30%v/v.
B. Landasan Teori
1. Infeksi
Infeksi merupakan masuknya mikroorganisme ke dalam jaringan tubuh, dengan cara memperbanyak diri sehingga menyebabkan peradangan (Dorland, 2012). Infeksi disebabkan oleh bakteri, virus, jamur, dan parasit. Contoh infeksi yang disebabkan oleh bakteri seperti
2. Antibiotik
Antibiotik berasal dari kata (L.Anti = lawan, bios = hidup) adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri, yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Golongan antibiotik yaitu penisilin, sefalosforin, aminoglikosida, tetrasiklin, makrolida dan linkomisin, polipeptida, sulfonamida, dan antibiotik lainnya (Tjay dan Raharja, 2007).
3. Resistensi antimikroba
Resistensi antimikroba adalah kemampuan mikroba untuk bertahan hidup terhadap efek antimikroba sehingga tidak efektif dalam penggunaan klinis (Depkes RI, 2015). Contoh antimikroba yang mengalami resistensi terhadap E. coli yaitu golongan florokuinolon sebanyak 89% (WHO, 2014), dan 48,8% (Usui et al., 2014), dan sebanyak 567 strain jenis E. coli resisten terhadap golongan florokuinolon (Rath and Padhy, 2015). E. coli juga dilaporkan resisten terhadap ampisilin, trimetropim, sulfametoksazol, kloramfenikol, dan ciprofloxacin (Hadi et al., 2013).
Bakteri B. subtillis, mengalami resistensi terhadap kloramfenikol, eritromycin, kanamisin, penisilin, streptomisin, trimethroprim (Compaoré et al., 2013), tetrasiklin, dan aminoglikosida (Gueimonde et al., 2013). Hasil penelitian Antimicrobial Resistance in Indonesia pada tahun 2000-2004 di RSUD dr. Soetomo Surabaya terdapat kuman multi-resitance seperti MRSA (Methicillin Resistance Staphylococcus aureus) dan bakteri ESBL (Extended Spectrum Beta Laktamase) (Depkes RI, 2017).
4. Deskripsi tanaman dan klasifikasi tanaman nagasari
Gambar 2.1 Pohon nagasari di Kabupaten Banyumas
Nagasari memiliki sinonim yaitu Callophyllum nagassarium Burm. F.M. Nagassarium (Burm.f.) kosterm, atau Mesua ferrea L.,
Calophyllum nagassarium Burm.f., Mesua coromandelina Wight, M. pedunculata Wight, M. roxburghii Wight, M. sclerophylla Thw., M. speciosa Choisy, keluarga dari Guttiferrae. Nagasari merupakan jenis tumbuhan yang terdapat di negara Kamboja, India, Malaysia, Filipina, Singapura, Myanmar, dan Vietnam berupa pohon berukuran sedang, tinggi 36 m, batang lurus, berdiameter 95 m, permukaan batang beralur panjang, daun bersilangan, tunggal, tepi, daun rata, berbentuk lonjong, pangkal daun runcing, berwarna hijau kebiru-biruan, urat daun tidak jelas, panjang tangkai daun 4-8 mm (P, Nurwanto dan Widyani, 2002).
Nagasari memiliki aktivitas sebagai antiseptik, antiinflamasi, dan antialergi (Gomathi, 2015), hepatoprotektif, diuretik, obat cacing, kardiotonik, expektoran, antioksidan, antipiretik, antimikroba, depressan, antispasmodik, dan analgesik (Keawsa-Ard et al., 2015). Daun nagasari memiliki aktivitas terhadap bakteri gram positif, negatif dan yeast
(Chanda et al., 2013).
alkaloid, flavonoid, terpenoid, tanin dan fitosterol (Sharma dan Sharma, 2017; Novanti, 2016).
5. Metode pemisahan
Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
Jenis –jenis ekstraksi (Mukhriani, 2014) terdiri dari: a. Maserasi
Maserasi adalah metode ekstraksi yang paling sederhana, dengan cara memasukan serbuk ke dalam wadah yang bersifat inert
dengan menggunakan pelarut yang cocok.
b. Ultrasonic
Ultrasonic adalah metode maserasi dengan menggunakan bantuan ultrasonic (20 KHz) dimana tekanan yang dihasilkan dapat mengakibatkan peningkatan kelarutan.
c. Perkolasi
Perkolasi adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan alat perkolator (wadah silinder yang dilengkapi dengan kran bagian bawahnya).
d. Soxhletasi
Suatu metode dengan cara menetapkan sampel pada sarung selulosa dalam wadah yang ditempatkan di atas labu dan di bawah kondensor dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
e. Reflux dan destilasi uap
Reflux adalah metode ekstraksi dengan cara memasukan sampel bersama dengan pelarut ke dalam labu yang dihubungkan dengan kondensor, dan uap yang dihasilkan kembali lagi ke dalam labu. Destilasi uap memiliki proses yang sama dan digunakan untuk senyawa yang bersifat mudah menguap (Volatil).
f. Fraksinasi
metode ekstraksi cair–cair. Ekstraksi cair–cair merupakan metode yang sederhana, karena melibatkan pemilihan pelarut atau gabungan pelarut yang akan melarutkan secara sempurna senyawa yang akan dianalisis dan melarutkan sedikit senyawa lain yang akan mengganggu proses analisis (Sudjadi, 2007).
Jenis ekstraksi, waktu ekstraksi, suhu, sifat pelarut, polaritas, dan konsentrasi pelarut merupakan faktor yang mempengaruhi kuantitas dan komponen pengambilan senyawa yang didapat. Pemilihan pelarut merupakan faktor keberhasilan di dalam pengambilan senyawa. Pelarut yang baik memiliki sifat-sifat yaitu toksisitas yang rendah, mudah diuapkan pada suhu rendah, memiliki penyerapan fisiologis yang cepat dari ekstrak, dan sebagai pengawet. Faktor yang mempengaruhi pelarut yaitu jumlah fitokimia yang akan di ekstraksi, tingkat ekstraksi, keanekaragaman senyawa yang akan di ekstraksi, keragaman senyawa penghambat yang akan di ekstraksi, mudah dilakukan penanganan terhadap ekstrak. Prinsip dasar pelarut yaitu pelarut dapat meningkatkan luas permukaan ekstraksi, sehingga dapat meningkatkan ekstraksi (Pandey dan Tripathi, 2014).
6. Skrining Fitokimia
Gambar 2.2 . Reaksi alkaloid dengan pereaksi Mayer (Setyowati et al., 2014)
Identifikasi senyawa yang kedua yaitu saponin. Hasil positif uji saponin yaitu berbentuk buih. Timbulnya buih karena kombinasi rantai sapogenin yang bersifat non polar dan rantai samping polar, sehingga saponin akan terdistribusi ke bagian polar dan rantai sapogenin mengikat udara sehingga menimbulkan buih (Novanti, 2016).
Identfikasi senyawa yang ketiga yaitu fenolat dan tanin. Hasil positif jika tebentuk warna hijau gelap. Mekanisme reaksi tanin dengan ion Fe3+ ditunjukan pada Gambar 2.3.
Gambar 2.3. Mekanisme reaksi tanin dan FeCl3 (Setyowati et al., 2014)
Kelima uji terpenoid ini menggunakan uji salkoweski karena adanya penambahan klorofom dengan asam sulfat pekat, maka akan terbentuk lapisan coklat kemerahan jika hasilnya positif.
7. Spektra FTIR (Fourier Infrared Spectroscopy)
Spektra FTIR yaitu analisis karakterisasi dan identifikasi senyawa yang didasarkan dengan sifat interaksi radiasi Inframerah dengan vibrasi molekul. Spektra FTIR disebabkan oleh perubahan energi getaran yang disertai dengan energi rotasi. Keuntungan menggunakan spektroskopi FTIR yaitu relatif murah, cepat, dapat menentukan gugus fungsional kimia dalam suatu sampel karena kelompok gugus fungsional yang berbeda dapat menyerap karakteristik radiasi IR (Rakesh et al., 2014). FTIR seperti sidik jari atau“ fingerprint” (Rohman, 2013). Analisis FTIR, dapat memberikan informasi tentang senyawa yang belum diketahui, menentukan kualitas sampel dan menentukan komponen senyawa yang ada didalam suatu campuran (Krishna et al., 2013).
Macam-macam daerah FTIR seperti yang terlihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.3 Daerah Spektra FTIR (Rakesh et al., 2014).
Gambar 2.4. Instrument FTIR (Chakraborty, 2016)
Instrumen FTIR (Chakraborty, 2016) terdiri dari: a. Sumber
Menggunakan energi inframerah yang berasal dari black-body source, kemudian sumber cahaya melewati suatu balok yang mengendalikan jumlah energi.
b. Interferometer
Balok memasuki interferometer, sehingga terjadi pengkodean spektral, dimana akan menghasilkan interferogram.
c. Sampel
Balok kemudian melewati suatu sampel, setelah itu sampel mengalami transmisi/dipantulkan dari permukaan sampel, sehingga mengalami penyerapan energi.
d. Detektor
Untuk membaca hasil serapan berupa interferogram khusus yang dihasilkan
e. Komputer
Teknik analisis FTIR (Rakesh et al, 2014) dibedakan menjadi : a. Teknik KBr
Sampel sebanyak 0,5 sampai 10 mg ditumbuk halus dan dicampur dengan campuran 100 mg bubuk kalium bromida kering atau alkali halida lainnya. Tekanan diatur dengan cukup, dan campuran di tekan kedalam campuran transparan. Spektrum IR menunjukan pita 3450 cm-1 dan 1640 cm-1.
b. Teknik ATR (Attenuated Total Reflectance)
Dapat digunakan untuk bahan-bahan padat dan cairan padat yang sangat menyerap, seperti pelapis, bubuk, benang, perekat, polimer dan sampel yang berair. Sampel ditempatkan dalam kontak dekat dengan kristal indeks dengan densitas tinggi yang lebih padat seperti seng selenida, thallium bromide –thallium iodida (KRS-5) atau germanium. Keuntungan ATR yaitu memerlukan sedikit sampel, teknik pengambilan sampel yang serbaguna.
Mekanisme ATR yaitu radiasi yang dilewatkan melalui hasil cerminan kristal pada permukaan. Radiasi terjadi ketika radiasi menyerap bahan yang ditempatkan pada kristal, sinar merah akan menembus lapisan tipis dari permukaan dan kehilangan energi, sehingga terjadi refleksi total inaktivaasi. Penetrasi sinar kedalam suatu sampel dibagi menjadi radiasi sudut pandang, radiasi panjang gelombang, indeks bias kristal, dan sampel. Sinar radiasi ketika melewati ATR yang terdiri dari dua bagian yaitu ZnSe (indeks bias 2,69) dan berlian Krs-5 (indeks bias 2,42) dan indeks bias tertinggi tergantung dari sampel. Kekuatan tekanan pada penggunaan ATR juga harus diatur karena akan mempengaruhi hasil spektroskopi (Sanches et al., 2013).
c. Specular Reflectance
d. Reflectif membaur ( Spektra DRIFT)
Teknik yang digunakan untuk sampel bubuk dan memiliki permukaan kasar, seperti batubara, kertas, dan kain. Teknik ini menggunakan pantulan untuk mengumpulkan dan memfokuskan kembali cahaya yang disebarkan dengan diffusent oleh cermin ellipsoidal besar, specular dihilangkan. Teknik ini dinamakan
Refluctuse Inframerah Fourier Transfom Spectroscopy (DRIFTS). e. Spektroscopi Photoaccoustic (PAS)
Metode ini digunakan untuk memeriksa sampel yang mudah menyerap dan sulit dianalisis dengan teknik IR konvensional. Keuntungan Spektrum PAS membutuhkan preparasi sampel yang mudah, tidak lama dan tanpa kristal tunggal, dan serat tunggal.
Aplikasi analisis FTIR pada tumbuhan seperti pada Digitalis purpurea yaitu untuk melihat profil digoksin, dan mendeteksi senyawa yang terkandung didalamnya, Radix aconitii kusnezoffii merupakan analisis menggunakan spektra FTIR dan 2D-IR untuk melihat perbedaan khas dalam penyerapan puncak yang terdapat pada senyawa yang terkandung, FTIR digunakan pada Angelica sinensis untukmelihat unsur utama senyawa aktif yang digunakan sebagai pengobatan. Buchu oil,
aplikasi FTIR dari spektrofotometri lain yang dibandingkan, ternyata memiliki hasil analisis senyawa yang baik. Chrysanthemum, aplikasi FTIR digunakan untuk mengidentfiikasi senyawa utama dari berbagai macam komponen senyawa yang terkandung didalam krisantin. Gingseng digunakan untuk melihat perbedaan puncak atau profil dari gingseng (Chakraborty, 2016) .
Tabel 2.4 Macam-macam bilangan gelombang pada setiap gugus fungsi (Anam et
Karbonil 1700-2000 Alkena 1640-1680
Aldehida 1726-1740 Alcohol 3200-3600
Ester 1741-1750 Alkane 3020-3000
Amida 1630-1690 Eter 1120-1140
Acyl 1602 Ester 1000-1300
Aromatik 1650-1450 Asam karboksilat 3200-3600
8. Bakteri
Bakteri adalah mikroorganisme prokariotik, yang memiliki ukuran 0,1 -1,0 µm. Bakteri memiliki berbagai macam bentuk seperti bentuk coccus, bacillus, curve, dan spiral (Elliott et al., 2011). Struktur bakteri dibagi menjadi dua yaitu struktur bakteri eksternal dan struktur bakteri internal. Struktur bakteri eksternal terdiri dari glikokaliks, flagela, filamen aksial, fimbria, dan pili. Struktur internal bakteri yaitu struktur yang berada didalam dinding bakteri. Dinding bakteri terdapat sitoplasma. Sitoplasma yaitu substansi yang paling dalam, dan berisi enzim, air (80%), protein, karbohidrat, asam nukleat,dan lipid yang membentuk suatu sistem koloid yang bersifat homogen (Pratiwi, 2008). Fase pertumbuhan bakteri dibagi menjadi 4 (Elliott et al., 2011) yaitu : a. Fase lag
Fase lag merupakan fase dimana ketika bakteri dinokulumkan kedalam suatu media pertumbuhan bakteri.
b. Fase log
Fase log merupakan pertumbuhan yang bersifat exponensial, media pertumbuhan menjadi lebih keruh sekitar 1 x 106 cell/mL. c. Fase stationer
Fase stasioner merupakan suatu fase dimana tingkat pertumbuhan bakteri melambat yang disebabkan habisnya nutrisi, sehingga laju pembagian sel sama dengan laju kematian dan konstan. d. Fase kematian / decline
Bakteri dibagi menjadi dua macam yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif yaitu memiliki dinding bakteri yang tebal dan tersusun dari polipetidoglikan. Contoh : Bacillus, Lactobacillus. Bakteri gram negatif yaitu dinding bakteri tersusun dari lipopolisakarida. Contoh : E. coli, N. gonorrhea.
a. Bakteri Subtilis bakteriosin. B. subtillis dapat menghasilkan spora ketika dalam kondisi yang tidak memungkinkan (Sopyan et al., 2009).
b. Bakteri E. coli
Sistem klasifikasi sebagai berikut : Divisio : Protophyta Subdivisio : Schizomycetea Kelas : Schizomycetes ordo : Eubacteriaceae Familia : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia
Spesies : coli
yang dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada suhu 44°C, bersifat indol positif tidak dapat menggunakan sitrat dan menghasilkan asam dari manitol pada suhu 37°C. E.coli bersifat aerob dan anerob dan tumbuh optimum pada suhu 37°C (Raharjo, 2013).
Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri ada dua yaitu nutrisi dan media kultur. Nutrisi merupakan suatu substansi yang di perlukan untuk biosintesis dan pembentukan energi, sedangkan media kultur yaitu digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme (Pratiwi., 2008). Medium bakteri dibagi menjadi tiga golongan yaitu simple media yang berisi pepton (polipetida dan asam amino, enzim yang dicerna dari daging) dan ekstrak daging (pelarut air dan pelrut lain yang melerutkan mineral, garam dan vitamin). Contohnya yaitu NA/NB. Enriched media yaitu nutrisi yang ditambahkan dan berasal dari isolasi bakteri. Contohnya agar darah, dan selektif media contohnya manitol salt agar. (Elliott et al., 2011).
Ada dua cara metode uji aktivitas antibakteriyaitu : a. Metode Difusi
Uji difusi ini dilakukan dengan cara mengukur zona bening yang merupakan petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh senyawa antibakteri dalam ekstrak (Fadhillah, 2013).
b. Metode dilusi
Pada metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang menurun secara bertahap, baik dengan menggunakan media padat dan media cair.
1) Dilusi cair
mikroba uji yang akan digunakan. Larutan uji antimikroba pada kadar kecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan ditetapkan sebagai konsentrasi hambat minimum (KHM). Larutan yang ditetapkan sebagai KHM selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).
2) Dilusi Padat
Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).
C. Kerangka Konsep
Gambar 2.5. Kerangka Konsep
Ekstrak etanol biji nagasari memiliki aktivitas antibakteri terhadap
B. subtillis dan E. coli dengan MIC 240-980µg/ml (Adewale et al.,2011), dan ekstrak etanol daun nagasari memiliki aktivitas antibakteri terhadap E.coli dan Staphylococcus aureus dengan diameter zona hambat sebesar 17, 25 mm (Phoung dan Nath, 2015)
Fraksi etanol air Fraksi n-heksana
Fraksinasi dengan metode cair-cair dilakukan dengan menggunakan corong pisah. Pelarut yang digunakan yaitu etanol, etil asetat, dan
n-heksana.
Uji aktivitas antibakteri terhadap B. subtillis, dan E. coli
menggunakan metode difusi, dengan variasi konsentrasi 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,3; 7,80; 3,90 µg/ml,
kemudian di ukur diameter zona hambat
Menghitung nilai MIC. MIC adalah konsentrasi terendah penghambatan pertumbuhan bakteri dari fraksi etanol-air dan
etil asetat (Oh et al., 2013).
Fraksi etil asetat
Penapisan fitokimia dan sidik jari FTIR
tidak dilanjutkan
E. Hipotesis
