Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia Amygdalina Del.) Terhadap Sel Hela Dan Sel Vero

(1)

(2)

(3)

60

Lampiran 3. Karakteristik tumbuhan daun Afrika

Tumbuhan Afrika

(4)

61

(5)

62

(6)

63

(7)

64

(8)

65

Lampiran 8. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa (perbesaran 10x10)

setelah pemberian ekstrak

Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml

(9)

66

Lampiran 9. Gambar morfologi sel normal Vero (perbesaran 10x10) setelah

pemberian ekstrak

Konsentrasi ekstrak 500 µg/ml

(10)

67

Lampiran 10. Gambar ELISA Reader, Mikroskop Inverted

Keterangan : Elisa Reader

(11)

68

Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel pada hemositometer

Jumlah Sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel

Jumlah sel/ml

∑sel/ml =

219

4

:

∑

sel/mL =

∑

sel A +

∑

sel B +

∑

sel C +

∑

sel D

4

× 10

4

= 54,75 x 10

4

sel/ml

Volume Panenan Sel HeLa

Volume panenan sel =

Jumlah total sel yang diperlukan

Jumlah sel terhitung/ml

:

Volume panenan sel Hela =

1×10

6

54,75×10

4

= 1,2 ml di tambahkan media kultur hingga

10 ml untuk 1 plate.

Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel

Jumlah sel/ml

∑sel/ml =

357

4

:

∑

sel/mL =

∑

sel A +

∑

sel B +

∑

sel C +

∑

sel D

4

× 10

4

(12)

69

Volume Panenan Sel Vero

Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitung/ml

:

1 ×10

6

89,25 ×104

(13)

70

Lampiran 12. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan

Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)

terhadap Sel Hela

No.

Absorbansi Kontrol Sel

(a)

Absorbansi kontrol

Media (b)

1

0,678

0,078

2

0,678

0,080

3

0,669

0,108

Rata-Rata

0,675

0,089

Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :

% Hidup =

Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media

Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media

×100%

Kadar

Absorbansi

Rata-rata

(c)

c-b

a-b

%

Hidup

%

Mati

1

2

3

(14)

71

Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan

Uji Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.)

terhadap Sel Vero

No.

Absorbansi Kontrol Sel

(a)

Absorbansi kontrol Media

(b)

1

0,914

0,058

2

0,874

0,057

3

0,892

0,056

Rata-Rata

0,893

0,057

Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :

% Hidup =

Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media

Absorbansi kontrol media sel – Absorbansi kontrol media

× 100%

Kadar

Absorbansi

Rata-Rata

(c)

c-b

a-b

%

Hidup

%

Mati

1

2

3

(15)

72

Lampiran 14. Perhitungan nilai IC

50

Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia

amygdalina Del.) Sel HeLa menggunakan analisa Probit SPSS

22.0

Confidence Limits

Probability 5% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b stimate wer Bound Upper Bound Estimate wer Bound per Bound LOGITa

.010 400.132 826.709 294928872902.620 3.869 2.917 14.131 .020 553.677 544.053 0602380241.128 3.551 2.736 12.188 .030 303.433 423.246 766230411.043 3.362 2.627 11.040 .040 688.011 352.629 60812094.903 3.227 2.547 10.219 .050 322.997 305.020 7994947.324 3.122 2.484 9.576 .060 081.889 270.145 1488908.535 3.034 2.432 9.046 .070 10.993 243.164 151497.558 2.960 2.386 8.593 .080 83.673 221.464 711010.173 2.894 2.345 8.198 .090 85.227 203.495 89937.836 2.836 2.309 7.846 .100 06.884 188.274 00634.782 2.783 2.275 7.528 .150 74.593 136.023 5578.026 2.574 2.134 6.271 .200 60.491 103.508 222.112 2.416 2.015 5.337 .250 92.968 79.664 29.914 2.285 1.901 4.581 .300 48.475 60.194 0.746 2.172 1.780 3.944 .350 17.021 43.106 4.764 2.068 1.635 3.399 .400 93.653 27.831 781 1.972 1.445 2.943 .450 75.642 15.268 824 1.879 1.184 2.585 .500 61.357 6.893 974 1.788 .838 2.324 .550 49.771 2.612 798 1.697 .417 2.139 .600 40.199 .862 468 1.604 -.065 2.002 .650 32.171 .252 63 1.507 -.599 1.891 .700 25.356 .064 13 1.404 -1.192 1.794 .750 19.510 .014 33 1.290 -1.858 1.701 .800 14.452 .002 19 1.160 -2.632 1.606 .850 10.050 .000 52 1.002 -3.578 1.499 .900 6.203 .000 50 .793 -4.844 1.366 .910 5.494 .000 81 .740 -5.163 1.334 .920 4.804 .000 93 .682 -5.517 1.299 .930 4.133 .000 72 .616 -5.913 1.259 .940 3.480 .000 04 .542 -6.367 1.215 .950 2.846 .000 69 .454 -6.899 1.163 .960 2.230 .000 36 .348 -7.543 1.102 .970 1.634 .000 57 .213 -8.365 1.024 .980 1.059 .000 6 .025 -9.514 .916 .990 .509 .000 7 -.294 11.459 .735 heterogeneity factor is used.

(16)

73

Lampiran 15. Perhitungan nilai IC

50

Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia

amygdalina Del.) Sel Vero menggunakan analisa Probit SPSS

22.0

Confidence Limits

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b

stimate Lower

Bound Upper Bound stimate

Lower

Bound er Bound GITa

7057.890 756.125 30386537118505080000000000.000 3.849 2.879 25.483

3552.467 517.894 7069538606477302000000.000 3.551 2.714 21.849

2367.534 412.462 50518930414233264000.000 3.374 2.615 19.703

1769.898 349.447 1465848446021061630.000 3.248 2.543 18.166

1409.008 306.247 91608645245120256.000 3.149 2.486 16.962

(17)

74

9.316 .000 33.442 .969 -9.840 1.524 8.316 .000 31.177 .920 0.438 1.494 7.334 .000 28.884 .865 -11.100 1.461 6.370 .000 26.545 .804 -11.843 1.424 5.423 .000 24.138 .734 -12.692 1.383 4.492 .000 21.629 .652 -13.686 1.335 3.576 .000 18.972 .553 -14.890 1.278 2.674 .000 16.088 .427 -16.428 1.207 1.782 .000 12.825 .251 -18.574 1.108 .897 .000 8.794 -.047 -22.208 .944 heterogeneity factor is used.

(18)

75

Lampiran 16. Perhitungan nilai Indeks Selektivitas

Indeks Selektivitas =

IC

50

Sel Vero

IC

₅₀

Sel Hela

=

79,561 µg/mL

61,357 µg/mL

(19)

76

Lampiran 17. Uji Statistik ANOVA Pada Sel HeLa

Descriptives Abdorbansi Zat

N Mean Deviation td. Error

Confidence Interval for

Mean Minimum Maximum wer Bound per Bound

500 3 .15 .015 .009 .11 .19 0.135 0.163

250 3 .15 .056 .032 .01 .29 0.114 0.215

125 3 .28 .037 .021 .19 .37 0.243 0.317

62,25 3 .54 .056 .033 .40 .68 0.493 0.602

31,25 3 .43 .111 .064 .15 .70 0.33 0.548

15,625 3 .51 .001 .001 .50 .51 0.507 0.509

Total 18 .34 .170 .040 .26 .43 0.114 0.602

ANOVA Abdorbansi Zat

Sum of Squares Df Mean Square F Sig.

een Groups .450 5 .090 26.568 .000

n Groups .041 12 .003

.491 17

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable: Abdorbansi Zat

(I) Kadar Daun Afrika

) Kadar Daun Afrika

an Difference

(I-J) d. Error Sig.

Confidence Interval Lower

Bound per Bound

y HSD .002 .048 .000 -.16 .16

-.126 .048 .158 -.29 .03 5 -.387* .048 .000 -.55 -.23 5 -.274* .048 .001 -.43 -.11 25 -.355* .048 .000 -.51 -.20 -.002 .048 .000 -.16 .16 -.128 .048 .148 -.29 .03 5 -.389* .048 .000 -.55 -.23 5 -.276* .048 .001 -.44 -.12 25 -.357* .048 .000 -.52 -.20 .126 .048 .158 -.03 .29 .128 .048 .148 -.03 .29 5 -.261* .048 .002 -.42 -.10 5 -.148 .048 .076 -.31 .01 25 -.229* .048 .004 -.39 -.07

5 .387* .048 .000 .23 .55

.389* .048 .000 .23 .55 .261* _.048 _.002 _.10 _.42 5 .113 .048 .238 -.05 .27 25 .031 .048 .983 -.13 .19

5 .274* .048 .001 .11 .43

.276* .048 .001 .12 .44 .148 .048 .076 -.01 .31 5 -.113 .048 .238 -.27 .05 25 -.082 .048 .546 -.24 .08

25 .355* .048 .000 .20 .51

(20)

77

5 .082 .048 .546 -.08 .24 .002 .048 .967 -.10 .11 -.126* .048 .021 -.23 -.02 5 -.387* .048 .000 -.49 -.28 5 -.274* .048 .000 -.38 -.17 25 -.355* .048 .000 -.46 -.25 -.002 .048 .967 -.11 .10 -.128* .048 .020 -.23 -.02 5 -.389* .048 .000 -.49 -.29 5 -.276* .048 .000 -.38 -.17 25 -.357* .048 .000 -.46 -.25 .126* .048 .021 .02 .23 .128* _.048 _.020 _.02 _.23 5 -.261* .048 .000 -.36 -.16 5 -.148* _.048 _.009 _-.25 _-.04 25 -.229* .048 .000 -.33 -.13

5 .387* .048 .000 .28 .49

.389* .048 .000 .29 .49 .261* _.048 _.000 _.16 _.36 5 .113* .048 .035 .01 .22 25 .031 .048 .522 -.07 .13

5 .274* .048 .000 .17 .38

.276* .048 .000 .17 .38 .148* .048 .009 .04 .25 5 -.113* .048 .035 -.22 -.01 25 -.082 .048 .111 -.19 .02

25 .355* .048 .000 .25 .46

.357* .048 .000 .25 .46 .229* .048 .000 .13 .33 5 -.031 .048 .522 -.13 .07 5 .082 .048 .111 -.02 .19

he mean difference is significant at the 0.05 level.

Homogeneous Subsets

Abdorbansi Zat

Kadar Daun Afrika N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3

y HSDa 250 3 .15

500 3 .15

125 3 .28 .28

31,25 3 .43 .43

15,625 3 .51

62,25 3 .54

.148 .076 .238 ns for groups in homogeneous subsets are displayed.

(21)

78

Lampiran 18. Uji Statistik ANOVA Pada Sel Vero

Descriptives

Abdorbansi Zat

N Mean . Deviation d. Error

Confidence Interval for

Mean Minimum Maximum wer Bound per Bound

500 ₄ ₁₂₃₂₅ _.053307 ₀₂₆₆₅₃ ₀₃₈₄₃ _.20807 _.093 _.203

250 ₄ ₁₂₁₇₅ _.051078 ₀₂₅₅₃₉ ₀₄₀₄₇ _.20303 _.091 _.198

125 ₄ ₅₄₅₅₀ _.221938 ₁₁₀₉₆₉ ₁₉₂₃₅ _.89865 _.215 _.684

62,25 ₄ ₆₅₂₇₅ _.296894 ₁₄₈₄₄₇ ₁₈₀₃₂ _1.12518 _.208 _.822

31,25 ₄ ₆₆₈₅₀ _.301676 ₁₅₀₈₃₈ ₁₈₈₄₇ _1.14853 _.216 _.821

15,625 ₄ ₆₄₂₅₀ _.310879 ₁₅₅₄₃₉ ₁₄₇₈₂ _1.13718 _.208 _.884

Total ₂₄ ₄₅₉₀₄ _.322202 ₀₆₅₇₆₉ ₃₂₂₉₉ _.59510 _.091 _.884

ANOVA

Abdorbansi Zat

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

ween Groups 1.396 5 .279 5.069 .004

in Groups _.992 ₁₈ _.055

l _2.388 ₂₃

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons Dependent Variable: Abdorbansi Zat

adar Daun Afrika

Kadar Daun Afrika

n Difference

(I-J) d. Error Sig.

Confidence Interval

wer Bound er Bound

y HSD .001500 165959 000 .52592 52892

.422250 165959 163 .94967 0517 5 .529500* 165959 049 1.05692 00208 5 .545250* 165959 040 1.07267 01783 25 .519250 165959 055 1.04667 00817

.001500 165959 000 .52892 52592 .423750 165959 160 .95117 0367 5 .531000* 165959 048 1.05842 00358 5 .546750* 165959 040 1.07417 01933 25 .520750 165959 054 1.04817 00667

(22)

79

5 529500* 165959 049 00208 05692

531000* 165959 048 00358 05842 .107250 165959 986 .42017 63467 5 .015750 165959 000 .54317 51167 25 .010250 165959 000 .51717 53767

5 545250* 165959 040 01783 07267

546750* 165959 040 01933 07417 .123000 165959 974 .40442 65042 5 .015750 165959 000 .51167 54317 25 .026000 165959 000 .50142 55342

25 .519250 165959 055 .00817 04667

.520750 165959 054 .00667 04817 .097000 165959 991 .43042 62442 5 .010250 165959 000 .53767 51717 5 .026000 165959 000 .55342 50142 .001500 165959 993 .34717 5017 .422250* 165959 020 .77092 07358 5 .529500* 165959 005 .87817 18083 5 .545250* ₁₆₅₉₅₉ ₀₀₄ _.89392 ₁₉₆₅₈ 25 .519250* 165959 006 .86792 17058 .001500 165959 993 .35017 4717 .423750* 165959 020 .77242 07508 5 .531000* 165959 005 .87967 18233 5 .546750* 165959 004 .89542 19808 25 .520750* 165959 006 .86942 17208 422250* 165959 020 07358 77092 423750* 165959 020 07508 77242 5 .107250 165959 526 .45592 24142 5 .123000 165959 468 .47167 22567 25 .097000 165959 566 .44567 25167

5 529500* 165959 005 18083 87817

531000* 165959 005 18233 87967 .107250 165959 526 .24142 45592 5 .015750 165959 925 .36442 3292 25 .010250 165959 951 .33842 5892

5 545250* ₁₆₅₉₅₉ ₀₀₄ ₁₉₆₅₈ ₈₉₃₉₂

546750* 165959 004 19808 89542 .123000 165959 468 .22567 47167 5 .015750 165959 925 .33292 6442 25 .026000 165959 877 .32267 7467

25 519250* 165959 006 17058 86792

(23)

80

Homogeneous Subsets

Abdorbansi Zat

ar Daun Afrika N

Subset for alpha = 0.05

1 2

y HSDa ₄ _.12175

4 .12325

4 .54550 .54550

25 4 .64250 .64250

5 4 .65275

5 4 .66850

.054 .974 ns for groups in homogeneous subsets are displayed.

(24)

81

Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media RPMI

Dimasukkan kedalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet

Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)

Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 8

0

C

RPMI Sachet

2 g Hepes

2 g

(25)

82

Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media M199

Dimasukkan kedalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet

Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)

Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 8

0

C

M199 Sachet

2 g Hepes

2 g

(26)

83

Lampiran 21. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK RPMI)

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK RPMI

0

C

Fetal Bovine Serum (FBS)

(10%)

Penisilin-

Streptomis

in (1%)

Fungizone

(amphoteri

cin B)

(0,5%)

RPMI ad

100%

(27)

84

Lampiran 22. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK M199)

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK

M199

0

C

Fetal Bovine Serum (FBS)

(10%)

Penisilin-

Streptomis

in (1%)

Fungizone (amphoterici

n B) (0,5%)

M199 ad

100%

(28)

85

Lampiran 23. Bagan Penumbuhan Sel HeLa dan Vero

Diambil dari tangki nitrogen atau freezer

Diambil beberapa tetes

Dimasukkan kedalam konikel yg berisi

RPMI/M199

Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 ml MK RPMI

Di resuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask

Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted

Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO2 5%

Sel HeLa dan

(29)

86

Lampiran 24. Bagan Panen Sel HeLa dan Vero

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80%

Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2x dengan PBS

Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%

Diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit

Ditambahkan 4 ml MK

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol

Ditransfer sel kedalam tabung konikel

Sel HeLa dan Vero,

alat, dan bahan

(30)

87

Lampiran 25. Bagan Penghitungan Sel HeLa dan Vero

Diambil 10µl panenan sel

Dipipetkan kedalam hemositometer

Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop

Kultur Sel

HeLa dan

V

Jumlah Sel

HeLa dan

(31)

88

Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji

Ditimbang sebanyak 5 mg

Dimasukkan kedalam polytube

Dilarutkan dalam 50 µl DMSO

Di vortex

Dibuat pengenceran sampai diperoleh

konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml,

125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml, 15,625 µg/ml

Ekstrak etanol

(32)

89

Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik

Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan

kepadatan 1 x 10

4

Diinkubasi selama 24 jam

Dibuang medium

Ditambahkan medium baru

Ditambahkan larutan uji

Diinkubasi selama 24 jam

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml)

Diinkubasi selama 4-6 jam

Ditambahkan SDS (sebagai stopper)

Dibungkus dengan aluminium foil

Dibiarkan selama 1 malam

Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm

Dihitung % sel hidup

Dihitung IC

50

dengan analisa probit menggunakan

SPSS

Sel HeLa dan

Vero

Absorban