PETUNJUK PRAKTIKUM
ANALISIS KLINIK B
(FAK 2762)
LABORATORIUM KIMIA FARMASI ANALISIS
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
KATA PENGANTAR
Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas tersusunnya Petunjuk Praktikum Analisis Klinik B yang ditujukan untuk membantu mahasiswa semester IV Program Studi Farmasi Klinik dan Komunitas, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Mata praktikum Analisis Klinik B ini bertujuan untuk mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/menerapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Petunjuk ini hanya memuat cara singkat bagaimana melakukan analisis beberapa parameter klinik, sedangkan untuk melengkapi pemahaman metode analisis tersebut mahasiswa diwajibkan membaca literatur aslinya yang tertera pada daftar pustaka buku ini. Aplikasi secara klinik dapat diperkaya melalui referensi lain yang terkait. Untuk melengkapi buku petunjuk yang sederhana ini semoga dapat diterbitkan suplemen yang dapat memperkaya pengetahuan mahasiswa.
Buku petunjuk ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran demi menyempurnakan buku ini di masa mendatang sangat diharapkan. Semoga buku petunjuk yang sangat sederhana ini dapat berguna bagi yang memerlukannya.
Yogyakarta, 2009
Pengampu Praktikum Analisis Klinik B: Prof. Dr. Sudibyo Martono, MS.,Apt. Dr. Edy Meiyanto, MSi., Apt. (koordinator) Dr. Ediati, SE, Apt.
Arief Rahman Hakim, MSi., Apt. Purwantiningsih, MSi.,Apt. Riris Istighfari Jenie, Msi., Apt. Muthi' Ikawati, MSc., Apt.
DAFTAR ISI
Hal KATA PENGANTAR ………... 1 DAFTAR ISI ………. 2
PENDAHULUAN ………. 3
I. PENETAPAN KADAR KREATININ ( sample: plasma dan urin)
(Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi) ………... 5 II. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL (sample: plasma)
(Metode : Liebermann – Burchard) ……… 7 III. PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL (sample: plasma) (Metode: Anilin) .… 9 IV. PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN (sample: urin) (Metode: Berthelot) ……….. 11 V. PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL (sample: urin)
(Metode: Spektrofotometri dan Biuret) ……….. 13 DAFTAR PUSTAKA ……… 17
PENDAHULUAN A. DESKRIPSI DAN TUJUAN
P raktikum Analisis Klinik B mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/merapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawa-seyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Praktikum ini bertujuan memperkenalkan berbagai metode penetapan kadar senyawa endogen dalam tubuh dengan metode enzimatik dan kimiawi untuk penetapan karbohidrat, lipid, protein, urea dan kreatinin. Setelah mengikuti praktikum Analisis Klinik B diharapkan mahasiswa dapat memahami dan mempraktikkan cara-cara penetapan senyawa-senyawa endogen dan mampu mengkaitkan arti senyawa-senyawa tersebut dengan berbagai penyakit. Adapun tujuan pembelajaran khusus setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan mampu :
1. menjelaskan cara-cara menetapkankadar senyawa endogen dalam tubuh
2. menjelaskan reaksi-reaksi kimia yang terjadi selama prakktikum mata acara yang bersangkutan
3. memilih metode yang tepat untuk meneapkan senyawa endogen tertentu 4. menjelaskan arti pentingnya praktikum Analisis Klinik B
5. membekali diri untuk pada waktunya bekerja di laboratorium klinik. B. PELAKSANAAN PEMBELAJARAN
1. Jadual Kegiatan Dua Mingguan (praktikum 2 minggu sekali) Prakt.
ke-
Topik Prakt. Substansi senyawa dalam Metode penetapan Fasilitas I Preparasi sampel Penetapan kadar kreatinin
Plasma darah Urin
Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
II Penetapan kadar karbohidrat Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
III Penetapan kadar kolesterol Plasma darah Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
IV Penetapan kadar urea nitrogen
Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
V Penetapan kadar protein Urin Spektrofotometri Buku Petunjuk, Pustaka
VI Responsi Semua materi
praktikum
Ujian tertulis Soal-soal ujian praktikum
2. Metode Pembelajaran dan Bentuk Kegiatan
Kegiatan setiap acara praktikum di laboratorium dimulai dengan test singkat materi yang akan dipraktikkan (pretest), kemudian mahasiswa melaksanakan acara praktikum dengan dibimbing asisten dan dosen. Setelah selesai melaksanakan praktikum, mahasiswa diwajibkan membuat laporan praktikum (laporan sementara perkelompok) yang memuat data-data praktikum dan perhitungan kadar. Setelah didiskusikan dalam satu golongan, laporan akhir pergolongan dikumpulkan pada akhir praktikum dalam bentuk softcopy. Diskusi lebih lanjut dilakukan secara on-line melalui situs http://analisisklinikfarmasiugm.wordpress.com/ dan terbuka untuk mahasiswa golongan yang bersangkutan dalam rentang waktu 2 x 24 jam setelah praktikum. Mahasiswa diwajibkan aktif dalam forum diskusi tersebut yang akan selalu dipantau dan dibimbing oleh asisten dan dosen pengampu.
Catatan : selama pelaksanaan praktikum, mahasiswa wajib mentaati segala peraturan dan menjaga ketertiban. Mahasiswa yang terlambat > 15 menit dan atau pretest telah selesai dilaksanakan tidak diperkenankan mengikuti praktikum dan wajib melapor pada koordinator praktikum.
C. EVALUASI PEMBELAJARAN Aspek penilaian meliputi : 1. Tes pendahuluan 15%
2. Kinerja praktikum 50%(termasuk kinerja di laboratorium, laporan, serta keaktifan diskusi di laboratorium maupun on-line)
3. Responsi 35%
Nilai akhir ditentukan sebagai berikut: A jika nilai ≥ 75
60 ≤ B < 75 50 ≤ C < 60 40 ≤ D < 50 E ≤ 40
I. PENETAPAN KADAR KREATININ (Sampel: plasma dan urin)
(Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi) Prinsip:
Metode ini sederhana, untuk penentuan kreatinin dengan bantuan larutan pikrat-basa, tanpa deproteinisasi.
Pereaksi:
a. Larutan bufer = 6,26 g NaOH dan 0,89 g Na2HPO4dalam akuades ad 1000.0 mL. b. Asam pikrat = 2,0 g dalam akuades ad 1000,0 mL.
c. Larutan kreatinin baku = 1 mg dalam akuades ad 100,0 mL
d. Asam klorida = 0,83 mL HCL pekat dalam akuades ad 1000,0 mL. (HCl pekat : 36,5 %; bj = 1,18)
Kondisi pengukuran
Larutan bufer dan asam pikrat direaksikan pada suhu 20-37 ºC (bufer dan larutan asam pikrat sebelumnya dibiarkan hingga mencapai suhu kamar).
Suhu analisis untuk sampel dan baku harus mirip. Panjang gelombang (λ) = 492 nm, tebal kurvet 1 cm.
Konsentrasi dalam campuran reaksi akhir adalah sebagai berikut :
Larutan bufer NaOH = 125,2 mmol/L dan Na2HPO4= 5 mmol/L; As. Pikrat = 3,5 mmol/L Prosedur :
Sampel (mL) Baku (mL)
Plasma atau Urin (diencerkan 1 :100)
0,5 - Baku - 0,5
Asam pikrat 1,0 1,0
Campurkan dan biarkan selama 5 menit
Campurkan dan ukur absorban (tidak lebih dari 1 menit) pada λ = 492 nm, tebal kurvet 1 cm . Selanjutnya, ukur absorban larutan tersebut tepat 5 menit sesudah pengukuran pertama ( ). Pada suhu > 30ºC, harus diukur tidak lebih dari 30 detik.
1 A
2
A A1
Metode tersebut menunjukkan linieritas hingga konsentrasi:5 mg/100mL(422 μmol/L)
Untuk konsentrasi > 5 mg/100 mL, plasma dan urin yang telah diencerkan 100 kali tadi, harus diencerkan dalam 1 : 6 larutan NaCl, dan sesudah pengulangan penentuan, hasil dikalikan dengan 6. Perhitungan :
mL
mg
x
Baku
A
baku
A
sampel
A
sampel
A
iKreatinin
Konsentras
L
mol
x
Baku
A
baku
A
sampel
A
sampel
A
iKreatinin
Konsentras
100
1
)
(
)
(
)
(
)
(
4
,
88
)
(
)
(
)
(
)
(
1 2 1 2 1 2 1 2−
−
=
−
−
=
μ
Soal Latihan:1. Apakah kepentingan penetapan kadar kreatinin dalam analisis klinik ? 2. Bagaimanakah metobolisme kreatinin, dan dimana terdapat ? 3. Tuliskan pembentukan kreatinin pikrat ?
4. Gangguan apa saja yang dapat timbul pada penetapan kadar kreatini dalam plasma dengan metode pikrat-alkali ?
5. Apakah kelebihan metode Jaffe yang dimodifikasi tersebut ?
6. Bagaimana cara mengatasi problema yang ada pada nomer 4 tersebut ? 7. Pelajarilah metode – metode lain untuk penetapan kadar kreatinin !
II. PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL (Sampel: plasma)
( Metode : Liebermann – Burchard ) Prinsip :
Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan polimer hidrokarbon tan jenuh.
Pereaksi :
a. Pereaksi kolesterol.
Mula-mula pereaksi cair didinginkan hingga 4ºC, kemudian ditambahkan dalam wadah ( yang didinginkan dalam ice-bath) sambil diaduk (magnetik) dengan urutan penambahan sebagai berikut :
Asam asetat glasial (30mL), asam asetat anhidrid (60 mL), dan terakhir asam sulfat pekat (10 mL).
Ke dalam campuran tersebut, tambahkan natrium sulfat anhidrat (2 g) dan asam 2,5-dimetilbenzensulfonat.
(Catatan : Larutan tersebut dalam botol gelap pada 4ºC stabil hingga 2 bulan. Perubahan warna menjadi sedikit kuning tidak mengganggu reaksi). b. Baku kolesterol.
Timbang 250 mg kolesterol, masukkan ke dalam labu takar 100 mL. Larutkan dengan asam asetat glasial (10 mL), selanjutnya tambahkan asam asetat glasial hingga 100 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
Prosedur :
Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml :
Water-bath 37 ºC Sampel (ml) Blanko pereaksi (ml) Baku (ml)
Plasma atau serum 0,04 - -
Air demineral - 0,04 -
Larutan baku - - 0,04
Campurkan segera dan biarkan dalam water-bath pada 37ºC selama tepat 10 menit. Kemudian campurkan dan baca absorban pada λ = 570 nm terhadap blangko pereaksi dalam waktu tidak lebih dari 5 menit.
Perhitungan :
mL
mg
x
blangko
Absorban
baku
Absorban
blangko
Absorban
sampel
Absorban
l
iKolestero
Konsentras
100
250
)
(
)
(
)
(
)
(
−
−
=
Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali. Soal Latihan:
1. Apakah kepentingan penetapan kadar kolesterol pada analisis klinik ? 2. Bagaimana struktur kolesterol ? Apa yang dimaksud dengan kolesterol total? 3. Apa kelebihan metode Liebermann-Burchard pada penetapan kolesterol ? 4. Tuliskan reaksi yang terjadi pada nomer 3 !
5. Mengapa absorban dibaca pada λ 560 nm ?
6. Apa fungsi masing-masing pereaksi pada metode Liebermann-Burchard ? 7. Apa kelemahan metode Liebermann-Burchard?
III. PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL (Sampel: plasma)
(Metode: Anilin ) Prinsip:
Bila aldose dan ketose dipanaskan dengan anilin dalam asam asetat glasial, akan terjadi reaksi dan menghasilkan senyawa berwarna dengan λ maks. 340 nm.
Pereaksi:
a. Pereaksi asam triklorasetat (10%).
Larutan 10 g asam triklorasetat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil pada suhu kamar.
b. Pereaksi anilin
Larutan 6,0 g anilin (pro analisis) dalam asam asetat glasial hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil untuk beberapa bulan. Perubahan menjadi sedikit kuning tidak menimbulkan gangguan.
c. Baku glukose
Larutan 110 mg glukose monohidrat dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. Prosedur :
Kerjakan dalam tabung reaksi 10 mL:
Water-bath 37ºC Sampel (mL) Blangko pereaksi(mL) Baku (mL)
Asam triklor asetat 1,0 1,0 1,0
Darah, plasma, serum 0,1 - -
Air demineral - 0,1 -
Baku glukose - - 0,1
Biarkan beberapa saat, kemudian lakukan sentrifugasi dengan kuat. Pisahkan supernatan
Pereaksi anilin 5,0 5,0 5,0
Panaskan masing-masing tabung reaksi tepat 10 menit dalam water-bath mendidih. Angkat tabung reaksi, dinginkan dengan air mengalir (air kran) dan baca absorban pada λ 340 - 440 nm, dengan blangko air demineral. Warna tersebut stabil selama 3 jam.
Perhitungan : mL mg x eaksi BlangkoPer Absorban baku Absorban eaksi blangkoPer Absorban sampel Absorban atTotal iKarbohidr Konsentras 100 100 ) ( ) ( ) ( ) ( − − =
Kadar glukose normal dalam plasma = 80 – 120 mg/100 mL. Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar karbohidrat total pada analisis klinik? 2. Pelajarilah metabolisme karbohidrat/glukose dan penyakit yang terkait ?
3. Apakah dasar penetapan kadar karbohidrat total dengan metade Anilin? Tuliskan reaksinya !
4. Apakah guna asam triklorasetat tersebut ? Tuliskan reaksinya ! Bahan lain apakah yang dapat menggantikan fungsi asam triklorasetat tersebut ?
5. Apakah kerugian/ kelemahan metode Anilin untuk penetapan kadar karbohidrat total ? 6. Pelajarilah metode lain untuk penetapan karbohidrat total !
7. Apakah makna hasil penetapan kadar karbohidrat total, terkait dengan penyakit/kepentingan diagnose ?
IV. PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN (Sampel: urin)
(Metode : Berthelot) Prinsip:
Urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida dengan pemberian urease. Amonia yang dibebaskan ditentukan dengan metode Bethelot.
Pereaksi :
a. Larutan nitroprusid-salisilat.
Larutan 3 g natrium salisilat dan 60 mg natrium nitroprusid dalam air demineral hingga 100,0 mL. (Larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4 ºC dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar).
b. Larutan stok hipoklorit (NaOCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Larutan tersebut dapat disimpan selama 1 bulan pada suhu kamar.
c. Larutan natrium hidroksida (12,5 mol/L).
Larutan 50 g NaOH dalam akuades hingga 100,0 mL.
d. Larutan NaOH-hipoklorit (NaOC1 550 mmol/L; NaOH 6,25 mol/L).
Campurkan dengan jumlah yang sama larutan stok hipoklorit (1,1 mol/L) dengan larutan NaOH (12,5 mol/L). (larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4ºC dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar).
e. Larutan urea-nitrogen baku (20 mg/100 mL atau 7,13 mmol/L).
Larutan 42,8 mg urea dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan asam benzoat yang sama. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
f. Bufer EDTA (27 mmol/L, pH 6,5).
Larutan 1 g .2H20 dalam 99 mL air demineral, atur pH larutan hingga tepat 6,5 menggunakan larutan NaOH, encerkan dengan air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas.
O H EDTA Na2 .2 2
g. Larutan 25 mg urease dalam buffer EDTA dan encerkan hingga 50,0 mL denngan buffer tersebut. Larutan stabil selama beberapa minggu pada 4 ºC
Prosedur : Sampel (mL) Blangko sample (mL) Baku (mL) Blangko baku (mL) Larutan urease 0,1 - 0,1 - Serum, plasma 0,02 0,02 - - Larutan baku - - 0,02 0,02
Inkubasi pada 37ºC selama 20 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit
Larutan salisilas 2,5 2,5 2,5 2,5
Larutan urease - 0,1 - 0,1
Larutan hipoklorit 2,5 2,5 2,5 2,5
Biarkan masing-masing larutan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian baca absorban terhadap blangko air demineral pada λ = 546 nm ( 540 – 590 nm).
Perhitungan : mL mg x u BlangkoBak Absorban baku Absorban pel blangkoSam Absorban sampel Absorban iUrea Konsentras mL mg x u BlangkoBak Absorban baku Absorban pel blangkoSam Absorban sampel Absorban gen iUreaNitro Konsentras 100 8 , 42 ) ( ) ( ) ( ) ( 100 20 ) ( ) ( ) ( ) ( − − = − − =
Kondisi normal : Dewasa, n = 347.
Urea nitrogen = 7,8 – 21,4 mg/100 mL. Urea = 16,7 – 45,9 mg/100 mL. Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar urea-nitrogen dalam analisis klinik ? 2. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar urea-nitrogen dengan metode
Betherlot !
3. Apakah kelebihan metode Berthelot pada penetapan kadar urea-nitrogen? 4. Mengapa digunakan air demineral ? Bagaimana cara membuat air demineral? 5. Apakah fungsi EDTA pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut ?
6. Apakah manfaat pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut, terkait dengan kepentingan diagnose ?
V. PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL (Sampel: Urin)
A. METODE : SPEKTROFOTOMETRI Prinsip :
Warburg dan Cristian adalah orang yang pertama kali memperkenalkan bahwa dengan menggunakan persamaan sederhana atau monogram, dapat dieveakuasi konsentrasi protein dan asam nukleat dari absorban larutan sample pada λ = 280 dan 260 nm. Penentuan tersebut menggunakan prinsip pengukuran absolut.
Pereaksi :
Larutan matrium klorida 0,9 %.
Larutan 0,9 g NaCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Prosedur :
Absorban larutan sampel yang ditentukan konsentrasi proteinnya diukur pada λ 260 dan 280 nm terhadap blangko larutan NaCl.
Perhitungan :
Konsentrasi protein = [1,55 x Abs. pada 280 nm] – [0,76 x Abs.pada 260 nm] mg/mL. Selanjutnya hasil tersebut dibaca pada Nomogram.
Soal Latihan :
1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik ? 2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri UV ? 3. Apakah syarat metode tersebut dapat digunakan ?
4. Gangguan apakah yang ada pada metode spektrofotometri UV tersebut ? 5. Pakah kelemahan spektrofotometri UV penetapan kadar protein ? 6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein !
Calculation
According to Layne.8
Concentration = [ 1.55 E(280)] – [0.76E(260)] mg −1
ml
Reading the result straight from the monogram (Fig.105).B. METODE : BIURET Prinsip :
Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam kupri dalam suasana basah akan membentuk warna violet.
Pereaksi :
a. Pereaksi basa.
Larutan 36 g urea dalam larutan NaOH ( 20 g/250mL akuades) dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan NaOH yang sama.
b. Pereaksi Biuret.
Larutkan 4,25 g CuSO4 dalam lebih kurang 25 mL air demineral. Larutkan 1,8 g KI dalam lebih kurang 25 mL air demineral.
Larutkan 43,5 g natrium sitrat dan 25 g dalam lebih kurang 250 mL air demineral. Sambil diaduk/digoyang, tambahkan larutan tersebut di atas, dan terakhir tambahkan larutan KI.
3 2
CO
Na
4
CuSO
Masukkan 180 g urea ke dalam larutan terakhir tersebut dengan pengadukan tetap, selanjutnya encerkan dengan air demineral hingga 500,0 mL.
c. Larutan Biuret.
Untuk penggunaan dalam analisis, campurkan sama banyak volume (1 bagian pereaksi basa dan 1 bagian pereaksi Biuret).
d. Larutan albumin baku (tahan selama beberapa bulan pada suhu 4ºC).
Larutkan 7 g albumin baku dalam larutan KCl (373 mg/250 mL dalam akuades) yang telah diatur pHnya hingga 6,5 – 6,8 menggunakan larutan natrium karbonat, selanjutnya encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan KCl tersebut.
Prosedur : Sampel (mL) Blangko pereaksi (mL) Plasma, serum 0,04 - Air demineral - 0,04 Larutan Biuret 2,0 2,0
Baca absorban terhadap blangko air demineral antara menit ke 30 dan 40 sesudah pencampuran. mL g otein xKons eaksi BlangkoPer Absorban baku Absorban eaksi blangkoPer Absorban sampel Absorban otein i Konsentras 100 Pr . ) ( ) ( ) ( ) ( Pr − − = Soal Latihan ;
1. Apakah kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri UV ?
2. Apakah dasar penetapan kadar protein cara Biuret ?
3. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara Biuret ? Jelaskan mengapa terbentuk warna?
4. Apakah kelebihan penggunaan albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ? 5. Apakah gangguan yang ada pada penetapan kadar protein cara Biuret ?
DAFTAR PUSTAKA
Christian, G.D., 1994, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York.
Lewandrowski, K., (Editor) 2002, Clinical Chemistry, Laboratory management and clinical correlations, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, A Wolters Kluwer Company, Philadelphia.
Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice, and Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester.
Smith, R.V. and Stewart, J.T., 1981, Textbook of Biopharmaceutic Analysis, A description of methods for the determination of drug in biological fluids, Lea & Febiger, Philadelphia. Stryer, L., 1995, Biochemistry, Fourth Edition, W.H. Freeman and Company, New York.
