59 KEMAMPUAN CURCUMINOID EKSTRAK TEMU MANGGA DALAM MENGHAMBAT PROSES OKSIDASI LIPOPROTEIN DENSITAS RENDAH
(LDL) OLEH SEL MAKROFAG
(The Ability of Curcuminoid Temu Mango Extract to Inhibit the Oxidation Process of Low Density Lipoprotein by Macrophage Cells)
Abstrak
Oksidasi lipoprotein densitas rendah (LDL) merupakan penyebab awal timbulnya aterosklerosis. Kurkuminoid adalah metabolit dari temu mangga (Curcuma mangga) famili zingiberacea yang diharapkan dapat menghambat proses oksidasi lipoprotein densitas rendah (LDL). Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek kurkuminoid ekstrak temu mangga terhadap makrofag mencit dan beruk (Macaca nemestrina) yang diinduksi dengan LDL teroksidasi. Kolesterol diisolasi dari plasma darah monyet ekor panjang jantan (Macaca fascicularis) yang diberi pakan aterogenik. Makrofag mencit diisolasi dari cairan peritoneum, sedangkan makrofag beruk diisolasi dari monosit sel darah putih. Pembentukan malonaldehida (MDA) sebagai hasil oksidasi LDL ditentukan dengan metode uji thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) menggunakan spektrofotomoter. Hasil pernelitian menunjukkan bahwa, kurkuminoid 8 ppm mampu menghambat oksidasi LDL yang diinkubasikan selama 4 jam dengan makrofag mencit, ditandai dengan penurunan konsentrasi MDA sebesar 13,07% (P<0.01). Sedangkan pada makrofag beruk, penurunan konsentrasi MDA sebesar 24,28% (P<00) terjadi pada masa inkubasi selama 6 jam. Dari data ini dapat disimpulkan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga mampu menghambat reaksi oksidasi LDL di tingkat seluler baik pada sel makrofag mencit maupun beruk.
Asbtract
The oxidation of low density lipoprotein (LDL) is the original cause of the occurrence of atherosclerosis. The curcuminoids is a metabolite of temu mango (Curcuma mango) from zingiberacea family is expected to inhibit oxidation of low density lipoprotein (LDL). This study aimed to examine the effects of curcuminoids of temu mango extract against macrophage mice and monkey (Macaca nemestrina) that were induced by oxidized LDL. Cholesterol was harvested and isolated from five adult male Macaca fascicularis fed an aterogenic diet for 3 months. Analyses were done by measuring the formation of thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) as malonaldehyde (MDA). LDL oxidation by mice macrophages incubated for four hours were inhibited by curcuminoid extract at concentration of eight ppm. There was a decrease of 13.068% (P<0.01) in the concentration of MDA compared to the control without curcuminoid. Inhibiton of LDL oxidation at macrophages of M. nemestrina were highest by curcuminoid at eight ppm for four hours and six hours incubation. There was 24.282% inhibiton (P<001). These data suggest that curcuminoid of temu mango extract was able to inhibit LDL oxidation at the cellular level, to macrophages of mice and Macaca nemestra
60 PENDAHULUAN
Penyakit jantung sampai saat ini merupakan penyakit yang banyak diderita dan menyebabkan angka kematian yang tinggi di dunia, termasuk Indonesia. Salah satu penyakit yang sangat ditakuti orang di dunia adalah Penyakit Jantung Koroner (PJK), karena gejalanya dapat muncul secara tiba-tiba dan berakibat fatal. Data hasil survei yang dilakukan oleh Wuryastuti (2000) dan Priyana (2004) terhadap Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT), menunjukkan peningkatan kejadian PJK untuk setiap tahunnya. Persentase yang terjadi pada tahun 1992 sebesar 9,9%; tahun 1995 sebesar 19% dan tahun 2001 sebesar 26,4%. Penyakit ini termasuk sering ditemukan pada orang-orang yang mempunyai kebiasaan makan yang banyak mengandung lipid atau kolesterol. Kenaikan konsentrasi kolesterol dalam darah tidak dapat disanggah lagi merupakan faktor risiko terjadinya PJK.
Aterosklerosis merupakan penyebab utama kematian PJK. Lesi aterosklerosis dapat diisolasi dari aorta, arteri koronaria, arteri otak, dan arteri ilio femoral. Dalam proses aterosklerosis, makrofag berperan penting dalam terbentuknya sel busa dan tertimbun di dalam lapisan tunika intima maupun tunika media. Sel-sel busa lalu terakumulasi kemudian berkembang menjadi ateroma. Esterbauer (1993) menyatakan, bahwa lesi aterosklerosis dapat berkembang secara bertahap melalui reaksi selular kompleks yang melibatkan stres oksidatif ikut sebagai faktor penting pada tahap perkembangan lesi.
Semakin berkembangnya ilmu pengetahuan yang didukung oleh banyak penelitian, mengungkapkan bahwa penyebab utama dan mekanisme terbentuknya lesi aterosklerosis berhubungan erat dengan peradangan. Menurut Hansson (2009), selama peradangan, pembuluh darah akan mensekresikan sitokina yang akan merangsang peningkatan permeabilitas permukaan pembuluh darah. Peningkatan permeabilitas ini menyebabkan monosit melekat pada permukaan pembuluh darah, bermigrasi ke intima, dan akhirnya berubah menjadi makrofag. Selama peradangan sel endotel juga akan mensekresikan limfosit sel T dan akan masuk ke intima. Selanjutnya interaksi makrofag dan sel T menyebabkan makrofag mensekresikan sitokina radang, oksigen reaktif dan spesies nitrogen. Semua ini akan menyebabkan LDL teroksidasi dan kerusakan sel,
61 diekspresikannya faktor jaringan (trombogenisitas), protease penyebab terjadinya proliferasi sel otot. Sel busa yang terbentuk akan terakumulasi membentuk plak aterosklerosis sebagai lesi awal yang berisi kumpulan sel-sel imun (Robertson & Hansson 2006; Hansson 2009).
Perkembengan aterosklerosis pada dinding pembuluh darah terutama disebabkan oleh endositosis kolesterol plasma yang berlebihan. Sel-sel dinding pembuluh arterti yaitu: sel endotel, sel otot polos, dan makrofag dapat mengoksidasi LDL secara in vitro dengan kehadiran sejumlah katalitik ion metal transisi. Perkembangan aterosklerosis dapat juga dimodulasi karena berinteraksinya sel-sel arteri yang dimediasi oleh berbagai molekul adhesi, sitokina termasuk faktor pertumbuhan. Argmann et al. (2001) mengemukakan bahwa faktor pertumbuhan akan mengatur protein yang terlibat dalam pengambilan lipoprotein, termasuk menghambat reseptor skavenger dan mencegah terjadinya ekspresi gen.
Makrofag adalah sel hasil diferensiasi dari monosit dan sel ini mempunyai dua reseptor khusus untuk menangkap kolesterol, yaitu reseptor LDL dan reseptor skavenger yang mengikat LDL termodifikasi. Partikel LDL yang termodifikasi tidak akan dikenali oleh reseptor LDL sehingga akan menjadi salah satu ligan reseptor LDL termodifikasi. Menurut Franke et al. (2006), makrofag adalah sel imun utama di dalam jaringan dan gangguan hebat terhadap makrofag dapat menimbulkan respon imun. Adanya kerusakan jaringan akan merangsang makrofag teraktivasi yang telah mengekspresikan mediator radang sehingga mempengaruhi respon peradangan, baik lokal maupun sistemik.
Untuk mencegah proses peradangan yang terjadi pada pembuluh darah, maka diperlukan suatu pengobatan alternatif/tradisional, dimana bahan bakunya mudah didiperoleh, harganya murah dan penggunaannya mudah dimengerti. Penggunaan obat alternatif saat ini semakin memasyarakat dan telah banyak dimanfaatkan. Temu mangga merupakan salah satu jenis tanaman temu-temuan yang sampai saat belum dimanfaatkan sebagai obat. Kandungan zat aktif yang terdapat di dalam temu mangga antara lain kurkuminoid dan turunan kurkuminoid.
62 Gugus fenolik yang terdapat pada kurkuminoid diduga berfungsi sebagai antibakteri, dan gugus fenolik tersebut menjadi dasar bahwa kurkuminoid (kurkumin) mempunyai kemampuan dalam mengeliminasi derivat radikal oksigen bebas yang terdapat pada medium dan bertanggung jawab terhadap peroksidasi sel-sel lipid. Gugus fenolik ini adalah esensial untuk skavenger superoksid dan keberadaan gugus orto metoksi dari molekul fenolik akan meningkatkan aktivitas kurkumin (Rao 1995; Sreejayan et al. 1997).
Penelitian ini dimaksudkan untuk mengkaji mekanisme kerja kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam menghambat proses oksidasi LDL pada sel makrofag peritoneum mencit, dan makrofag sel darah putih beruk (Macaca nemestrina). Selain itu, untuk memperoleh dosis efektif kurkuminoid ekstrak dalam pencegahan proses awal patogenesis aterosklerosis. Diharapkan, dari data yang diperoleh dapat dibuat suatu rekomendasi tentang manfaat kurkuminoid temu mangga yang dapat digunakan sebagai obat alternatif untuk pencegahan aterosklerosis sejak dini.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Penelitian ini mempergunakan 5 ekor monyet ekor panjang (MEP) jantan berumur 3 tahun, bobot badan ±7 kg. Total LDL diisolasi dari plasma darah MEP, makrofag diisolasi dari 20 ekor mencit jantan dan 5 ekor beruk jantan. Seluruh perlakuan yang melibatkan hewan percobaan, dilakukan berdasarkan peraturan yang telah ditentukan dan disetujui Komisi Kesejahteraan Hewan Laboratorium PSSP IPB (ACUC) dengan no: 05-006-IR.
Bahan kimia yang digunakan antara lain DMEM (Gibco, Cat. no. 12100-046), medium RPMI-1640 (Sigma), Pheripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC, Ficoll-Paque Plus Amersham, Biociences), Phosphate Buffer Saline (PBS), Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma), Asam Thiobarbiturat (Sigma), Bovine Serum Albumine (BSA, Sigma), antibiotik (penisilin, streptomisin), asam tiobarbiturat (TBA, Sigma), kupri sulfat (CuSO4.5H2O), kalium tartat, natrium
63 hidroksi, asam trikloro asetat (TCA, merck), natrium klorida, benzidin HCl dan asam 1,1,3,3-tetra metoksi propan (TMP, Sigma).
Alat yang dipergunakan antara lain sentrifugasi berkecepatan rendah Beckman dengan rotor swing Bucket 3750 rpm, ultrasentrifugasi Beckman XL-90 dengan rotor swing-40, tabung polialomer, spektrofotometer UV-Vis DMS 100 (varian), vortex, filter Millipore 0,45, waterbath, hemositometer, mikroskop, cawan kultur sel, flask kultur, pipet mikro dan alat gelas lainnnya.
Metode Penelitian
Pengaruh Konsentrasi Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Tingkat Oksidasi LDL.
Sebanyak 200 µg/ml LDL dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol, LDL hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Kemudian kultur dicuci dengan PBS sebanyak 3x. Masing-masing perlakuan kemudian ditambahkan Cu2+ 5μM/ml, lalu diinkubasi pada 370C dalam inkubator CO2 dengan waktu inkubasi 4 jam dan 6 jam. Jumlah LDL yang teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
Pengaruh Konsentrasi Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Reaksi Oksidasi Lipid dalam Makrofag yang diinduksi dengan Cu2+
Kultur makrofag dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak sebanyak 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml, dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol sel hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Lalu masing-masing kultur perlakuan ditambahkan Cu2+ 5μM/ml, kemudian diinkubasi dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam dan 6 jam. Banyaknya sel teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
64 Pengaruh Pemberian Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Proses LDL Teroksidasi oleh Sel Makrofag
Kultur makrofag dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak sebanyak 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml, dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol sel hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Lalu masing-masing kultur perlakuan ditambahkan LDL 200 µg/ml dan Cu2+ 5 μM/ml, kemudian diinkubasi dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam dan 6 jam. Jumlah LDL yang teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
Prosedur Penelitian
Pengambilan Plasma Darah.
Senyawa LDL plasma diisolasi dari darah MEP yang diberi pakan aterogenik selama 3 bulan, dan sebelumnya telah diadaptasikan selama 2 minggu (Adams et al. 1985). Sebelum pengambilan darah, MEP dipuasakan selama 24 jam. Pada saat pengambilan darah, MEP dibius menggunakan ketamin 10 mg/10 kg bobot badan, darah diambil melalui vena femoralis. Darah tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi EDTA 1 mg/ml dan dijaga pada suhu 40C, lalu darah disentrifus untuk mendapatkan plasma darah.
Isolasi Lipoprotein Densitas Rendah (LDL).
Lipoprotein densitas rendah diisolasi sesuai dengan metode yang dilakukan oleh Sulistiyani dan Clair (1991). Plasma darah dipisahkan dengan cara sentrifugasi selama 30 menit menggunakan Beckman GS-6R ‘low speed centrifuge’ dengan kecepatan 2700 rpm pada suhu 40
C.
Sebanyak 8 ml, plasma darah dimasukan ke dalam tabung polialimer dan ditambahkan 5 ml larutan 0,9% NaCl- 0,01 % EDTA (w/v) secara hati-hati hingga tabung penuh. Larutan NaCl-EDTA ini berfungsi sebagai gradien densitas. Selanjutnya, plasma darah disentrifus dengan menggunakan ultrasentrifus Beckman XL-90 dengan rotor SW 40 pada suhu 4oC selama 20 jam dengan kecepatan 36000 rpm, dari pemusingan diperoleh β-Very Low Density Lipoprotein (β-VLDL) yang terpisah, dengan cara mengambil lapisan bagian
65 bawah (d>1,006 g/ml) adalah plasma dan lapisan atas (d<1,006 g/ml). Lapisan bawah ini kemudian ditambahkan Kalium Bromida (KBr) sebanyak 0,1109 g/ml, kemudian dicampur hingga larut dan merata. Campuran larutan tersebut diambil 9 ml dan dipindah ke dalam tabung sentrifus polialomer yang baru dan ditambahkan 4 ml KBr (d=1,063 g/ml) yang mengandung larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA, lalu disentrifus dengan menggunakan ultrasentrifugasi dengan rotor SW-40 pada kecepatan 36000 rpm pada suhu 40C selama 24 jam, dari pemusingan akan diperoleh LDL pada lapisan atas dan dipisahkan dengan menggunakan alat pemotong tabung. Fraksi LDL yang diperoleh, dilakukan dialisis dengan larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA pH 7,4/40C, dilakukan 3X2 L selama 72 jam. Fraksi LDL yang diperoleh selanjutnya, disaring dengan milipore 0,45 µm dan disimpan pada suhu 40C. Pengujian terhadap kandungan protein dilakukan dengan uji Lowry dengan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar (Lowry 1951).
Sediaan LDL yang telah diukur proteinnya dilakukan dialisis kembali menggunakan larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA pH 7,4/40C, dilakukan 3 x 2 L selama 72 jam. Dialisis ini bertujuan untuk menghilangkan EDTA dari sediaan LDL. Fraksi LDL yang diperoleh akan digunakan untuk penelitian berikutnya. Adapun derajat oksidasi LDL yang terbentuk diukur dengan uji asam tiobarbiturat (Kleinveld et al. 1992; Conti et al. 1991).
Isolasi Makrofag Mencit.
Mencit percobaan diinjeksi secara peritoneal dengan 2,5 ml tioglikolat (24 g/L dalam larutan saline). Setelah 4 hari sel dipanen, lalu dicuci dan disentrifus 3 kali dengan PBS pada 1500 rpm selama 10 menit pada suhu 250C. Sel tersebut kemudian diresuspensikan kembali dan dikonsentrasikan 1 x 109/L dengan DMEM yang mengandung 10 % FBS, 100000 U penisilin/L, 100 mg streptomisin dan 2 mmol glutamin/l. Suspensi sel ditumbuhkan dalam petridish 35 mm dan diinkubasi dalam inkubator dengan kelembaban tertentu (5% CO2, 95% udara) selama 4 jam. Setelah itu, sel dicuci dengan 5 ml DMEM untuk membuang sel yang tidak menempel pada dasar kultur, sedangkan sel monolayer diinkubasi kembali selama 18-24 jam sampai makrofag siap digunakan (Aviram et al. 2000).
66 Isolasi Makrofag Beruk.
Darah diambil dari vena femoralis setelah beruk telah dibius dengan ketamin (10mg/kg boboit badan). Darah-EDTA yang diperoleh selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit dengan menggunakan Beckman GS-6R ‘low speed centrifuge’ dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu 40
C. Buffy coat yang diperoleh lalu dipisahkan dan ditampung dalam tabung yang telah berisi PBS dan dicampur dengan perbandingan 1:1. Campuran tersebut kemudian dilapisi dengan Lymphocyte Separation Medium (LSM) yang mengandung 6,2 g ficoll dan 9,49 g sodium diatrizole, lalu disentrifus kembali selama 30 menit pada 1500 rpm pada suhu 40C. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) dipanen dan dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi PBS lalu disentrifus kembali pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit pada 40C. Pelet yang diperoleh dipisahkan dan dimasukkan ke tabung yang telah berisi RPMI (Gibco, Invitrogen Corp) lalu diresuspensikan untuk dihitung. Jumlah sel dihitung dengan menggunakan 2% asam asetat dengan alat counting chamber. Setelah dihitung, sel dikultur dalam petridish yang berisi RPMI mengandung 10% FBS (Gibco, Invitrogen Corp), 100000 U penisilin/L, 100 mg streptomisin dan 2 mmol glutamin/L. Suspensi sel ditumbuhkan pada petridish 35 mm dan diinkubasi dalam inkubator dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam. Sel dicuci dengan 5 ml RPMI untuk membuang sel yang tidak menempel pada kultur flask, sedangkan sel monolayer diinkubasi kembali dengan RPMI selama 18-24 jam sampai makrofag konfluen, kemudian medium diganti dan makrofag siap digunakan. Pengujian Sampel untuk Uji Asam Tiobarbiturat (TBARS)
Pembuatan Kurva Standar. Standar yang digunakan untuk mengukur asam tiobarbiturat adalah 1,1,3,3 tetra metoksi propan (TMP). Larutan stock pereaksi 1,1,3,3 tetra metoksi propan 600 mM, dibuat menjadi 0,5; 0,8; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 dan 10 μM . Masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setiap tabung reaksi ditambahkan 1,0 ml TCA 20% dan 1,0 ml TBA 1% dalam pelarut asam asetat 20%. Seluruh tabung kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu 950C. Setelah diinkubasi, semua tabung didinginkan lalu disentrifus selama15 menit pada 1000 rpm, absorban
67 diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 532 nm.
Pengujian Sampel. Jumlah LDL yang teroksidasi dari masing-masing sampel, dilakukan proses yang sama seperti standar, yaitu 0,1 ml sampel +1,0 ml TCA 20%+1,0 ml TBA 1% dalam asam asetat 20%. Selanjutnya, diinkubasi selama 45 menit pada suhu 950C, dibiarkan dingin lalu disentrifus pada 1000 rpm selama 15 menit dengan menggunakan Beckman GS-BR low speed centrifuge, kemudian diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang (λ) 532 nm.
Peubah yang Diamati
Dalam penelitian ini, peubah yang diamati antara lain jumlah total protein LDL plasma, konsentrasi Malonaldehida (MDA) dan jumlah hambatan oksidasi LDL.
Analisis Data
Kolesterol total ditentukan dengan kit kolesterol. Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel rerata oksidasi LDL, yaitu MDA dan dilanjutkan uji ragam (ANOVA) dengan menggunakan prosedur General Linear Model (GLM) disain faktor tersarang (nested) menggunakan program Minitab 14.13. Perlakuan yang bermakna akan dilanjutkan dengan uji pembanding rataan nilai tengah Tukey.Uji rerata nilai tengah Tukey ini bertujuan untuk mendapatkan rataan nilai tengah yang bermakna dari penelitian ini yang berbeda (Gaspersz 1991).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Fraksi Lipoprotein Densitas Rendah (LDL) M. fascicularis
Hasil isolasi LDL menunjukkan adanya peningkatan protein LDL setelah monyet ekor panjang (MEP) diberi pakan aterogenik selama 3 bulan. Kondisi ini adalah normal akibat pemberian pakan dengan kolesterol tinggi karena konsentrasi kolesterol darah tergantung dari banyaknya kolesterol yang diperoleh dari makanan maupun dari sintesa de novo. Mekanisme reseptor LDL memegang
68 peranan penting dalam mendegradasi kolesterol di hati. Kolesterol disekresikan ke dalam kantong empedu untuk diubah menjadi empedu. Pembentukan kolesterol de novo di hati diatur oleh aktivitas enzim HMG-SKoA reduktase, dimana diet kolesterol dapat menurunkan aktivitas enzim tersebut (Hortan et al. 1996).
Pengaturan homeostasis plasma kolesterol diatur oleh reseptor LDL yang terdapat di hati dan sel non hepatik. Adapun jumlah reseptor LDL ini bervariasi bergantung pada sel non hepatik (Brown & Goldstein 1986). Jumlah protein LDL (mg/ml) diukur dengan menggunakan uji Lowry dan BSA (1 mg/ml) sebagai standar. Berdasarkan hasil penelitian, terjadi peningkatan konsentrasi total protein kolesterol setelah hewan diberi pakan aterogenik selama 3 bulan. Protein kolesterol yang diperoleh ini digunakan untuk pengukuran aktivitas kolesterol terhadap sel seluler.
Jumlah protein LDL hasil isolasi dari ke 5 MEP sebelum diberi pakan aterogenik diperoleh 2,30 mg /ml sebanyak 7 ml (A). Setelah diberi pakan pakan aterogenik selama 3 bulan diperoleh protein LDL 5,31 mg sebanyak 9 ml (B). Peningkatan total kolesterol dibandingkan dengan konsentrasi awal disebabkan pengaruh pakan aterogenik yang diberikan pada MEP selama 3 bulan. Rerata jumlah protein LDL disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Rerata jumlah lipoprotein (mg/ml) plasma darah monyet ekor panjang (MEP)
No Hasil Isolasi Plasma darah A B 1 2 3 4 5 Kolesterol total Kolesterol LDL Kolesterol HDL Trigliserida Protein LDL 82,00 84,00 23,00 36,00 32,00 41,00 43,00 38,00 2,30 5,31
Keterangan: A: plasma darah diambil sebelum MEP diberi pakan aterogenik; B: plasma darah diambil setelah MEP diberi pakan aterogenik
Monyet ekor panjang biasa digunakan sebagai hewan model untuk penyakit kronis. Aterosklerosis terkait dengan metabolisme lipid, lipoprotein dengan MEP sebagai hewan model, dikarenakan anatomis serta ukuran arteri koronaria yang sama dengan manusia. Keunggulan lainnya adalah ukuran hewan lebih kecil dan lengkap informasinya. Monyet ekor panjang bila diovariektomi dan diberi pakan aterogenik selama tiga bulan akan mengalami peningkatan
69 konsentrasi total kolestrol plasma dan kolesterol densitas tinggi. Bila pemberian pakan diperpanjang sampai satu tahun akan mengalami aterosklerosis pada arteri koronaria (Adam et al 1985; Wiliam & Suparto 2004).
Kultur Primer Makrofag Peritoneal Mencit dan Makrofag Sel Darah Putih Beruk
Metode isolasi sel yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan cara yang berbeda antara makrofag mencit dan beruk. Isolasi makrofag mencit menggunakan asam tioglikolat. Asam tioglikolat digunakan untuk merangsang pembentukkan udema di dalam rongga perut (abdomen) mencit. Sedangkan makrofag yang berasal dari beruk diperoleh dengan cara memisahkan sel darah merah dari sel darah putih menggunakan Lymphocite Separation Medium (LSM) sehingga diperoleh monosit. Berdasarkan pengamatan selama menumbuhkan sel makrofag, ternyata makrofag beruk lebih cepat mati dibandingkan dengan makrofag mencit yang terlihat ketika sel makrofag dikultur. Hal ini diduga disebabkan oleh adanya perbedaan fisiologi sel makrofag sehingga mempengaruhi cara hidup dari sel makrofag(Gambar 14).
Gambar 14 Bentuk sel monolayer makrofag peritoneal mencit (A) dan sel darah putih beruk (B), perbesaran 278 kali.
Hasil isolasi makrofag peritoneum mencit dan beruk memperlihatkan bentuk sel yang berbeda. Monolayer makrofag mencit memiliki komposisi lebih longgar dibandingkan dengan monolayer makrofag sel darah putih beruk pada pasase ke-3. Jumlah makrofag mencit (20 ekor) dan beruk (3 ekor; 100 ml darah) yang diisolasi, berturut-turut diperoleh sebanyak 19,9 x 106 dan 9,2 x 106. Baik makrofag mencit maupun beruk, dapat tumbuh dengan baik dalam medium
70 DMEM/RPMI yang mengandung FBS 10%. Makrofag dapat tumbuh dengan baik setelah setelah 24 jam dan siap digunakan untuk percobaan berikutnya.
Makrofag merupakan turunan dari sel darah putih (monosit) yang berfungsi sebagai pemangsa dan penyaji sel antigen (antigen–presenting cells, APC) yang mensekresikan sitokina, kemokin, molekul pengatur pertumbuhan, metaloproteinase dan enzim hidrolitik lainnya. Kemampuan makrofag dalam menghasilkan sitokina contohnya TNF-IL1 dan Transforming Growth Factors (TGF); enzim proteolitik contohnya metaloproteinase dan faktor pertumbuhan seperti Platlet Derivate Growth Factor (PDGF) dan Insuline-like Growth Factor 1 yang bertanggungjawab pada kerusakan dan perbaikan lesi aterosklerosis (Argmann et al. 2001; Ross 1999).
Efek Perbedaan Sel Makrofag terhadap Tingkat Oksidasi LDL
Data pada percobaan 1 dari gambar 15, menunjukkan sel makrofag mencit dan beruk yang diinkubasi dalam medium pertumbuhan selama 4 jam tanpa ditambahkan apapun ternyata menghasilkan MDA. Konsentrasi MDA pada mencit 3,2 % lebih tinggi dibandingkan dengan beruk. Hal ini menunjukkan bahwa sel makrofag mencit mempunyai reaktivitas lebih tinggi dibandingkan dengan sel makrofag beruk (P<0,01).
Perbedaan konsentrasi MDA ini disebabkan cara mengisolasi makrofag yang berbeda. Sel makrofag beruk diisolasi dari sel darah putih tanpa diberi perlakukan apapun, sedangkan sel makrofag mencit diisolasi dengan cara: mencit diinjeksi dengan asam tioglikolat secara intraperitoneal (Aviram et al. 2000). Kemungkinan yang lain adalah LDL yang digunakan dalam percobaan berasal dari plasma darah yang diisolasi dari monyet ekor panjang. Secara biologis, baik monyet ekor panjang maupun beruk mempunyai kesamaan bentuk anatomi dan fisiologis. Monyet ekor panjang peka terhadap pakan yang dapat menginduksi aterosklerosis pada arteri koronaria. Distribusi, karakter dan keparahan lesi aterosklerosis mirip juga dengan manusia (Clarkson et al. 1996). Dengan demikian LDL monyet yang diinkubasi ke dalam kultur sel makrofag beruk hanya sedikit memicu reaksi oksidasi. Sedangkan pada sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan LDL monyet, reaksi oksidasi yang terjadi menjadi lebih besar.
71 Pada percobaan 2 digunakan untuk menentukan apakah inkubasi LDL dengan sel menyebabkan LDL teroksidasi. Disini terlihat bahwa nilai MDA dari masing-masing perlakuan konsentarsinya berbeda. Pada kontrol, partikel LDL yang diinkubasikan tanpa diberi sel makrofag diperoleh konsentrasi MDA sebesar 2,09 nmol/mg protein LDL. Konsentrasi MDA ini lebih rendah jika dibandingkan dengan LDL yang diinkubasikan dalam sel makrofag mencit sebasar 19, 95 dan 7, 89 untuk sel makrofag beruk. Hasil perhitungan persentase terhadap LDL yang diinkubasi dengan sel makrofag mencit, konsentrasi MDA lebih tinggi 5,8 % dibandingkan dengan sel makrofag beruk. Kondisi ini disebabkan sel makrofag mencit lebih aktif dibandingkan sel makrofag beruk. Disamping itu, sel makrofag yang diinkubasi dengan LDL dapat meningkatkan konsentrasi oksidasi LDL dibandingkan dengan LDL yang hanya diinkubasi dalam medium pertumbuhan (P<0,01)
Menurut Packard & Libby (2008) menyatakan bahwa, monosit yang berada dalam peredaran darah dapat berdiferensisai menjadi makrofag dan berada di intima. Dalam percobaan, makrofag yang berasal dari monosit beruk dapat juga dioksidasi oleh ion Cu2+. Peran penting makrofag adalah memediasi respon peradangan dan sebagai penyaji antigen (antigen-independent/innate).
Percobaan 3 dilakukan untuk melihat efek ion Cu2+ terhadap reaksi oksidasi LDL yang menghasilkan derajad oksidasi. Konsentrasi MDA sebesar 33,15 nmol/mg protein LDL untuk kontrol. Sedangkan untuk sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan LDL dan ion Cu2+ diperoleh konsentrasi MDA sebanyak 36,77 nmol/mg protein LDL, dan sel makrofag beruk sebanyak 27,11 nmol/mg protein LDL. Bila dilihat dari nilai konsentrasi MDA antara sel makrofag mencit dan beruk, maka konsentrasi MDA makrofag mencit nilainya lebih tinggi 2,8 % dibandingkan makrofag beruk. Ion Cu2+ yang diinkubasi dengan LDL dan sel mampu meningkatkan reaksi oksidasi lipid. Bila dilhat dari percobaan 2 dan 3, dapat disimpulkan bahwa makrofag mencit mempunyai reaktivitas terhadap oksidasi LDL dibandingkan dengan makrofag beruk dengan p(<0,01).Namun bila dilihat dari kontrol, maka ion Cu2+ cukup tinggi dalam memberikan andil terejadinya reaksi oksidasi LDL pada sel makrofag.
72 Holvoet et al. (1994) menyatakan bahwa, makrofag dapat memproduksi radikal bebas sebagai efek dari ion Cu2+ yang dapat menimbulkan stres oksidatif terhadap sel yang dikultur secara in vitro. Selanjutnya dikatakan, makrofag berperan penting dalam kejadian aterosklerosis dan metabolisme lipoprotein. Pada aterosklerosis, akumulasi lipid yang teroksidasi akan ditangkap oleh mkrofag melalui reseptor scavenger. Mertens dan Holvoet (2001) menyatakan bahwa makrofag yang teraktivasi akan mensekresi mieloperoksidase untuk menghasilkan spesies reaktif yang nantinya akan mengoksidasi protein maupun lipid.
Keterangan: Percobaan 1 Percobaan 2 Percobaa Kontrol LDL LDL+ Cu2+ Makrofag mencit LDL+ Sel LDL+ Cu2+ Sel Makrofag beruk LDL+ Sel LDL + Cu2+ Sel
Grafik 15 Efek Makrofag dan ion Cu2+ terhadap oksidasi LDL yang diinkubasi selama 4 jam
Menurut Steinberg (1993), Riemersma (1994) dan Swhwenke (1998), proses oksidasi LDL diduga dimulai ketika oksigen reaktif mengambil atom hidrogen dari asam lemak tidak jenuh yang ada di dalam partikel LDL sehingga terbentuk lipid peroksida dan radikal aloksi. Selanjutnya akan menginisiasi oksidasi asam lemak disekitarnya. Apabila antioksidan di dalam LDL tidak mencukupi untuk mengeliminasi lipid peroksida yang terbentuk maka propagasi lipid terjadi, sehingga terbentuk aldehid, keton dan produk lain yang reaktif yang akan mengikat residu lisin dalam apolipoprotein B-100. Perubahan metabolit yang terbentuk ini disebabkan terbentuknya interaksi lipid-lisin dan merubah muatan
73 listrik LDL sehingga akan terbentuk epitop baru. Kondisi ini mempengaruhi fungsi biologis negatif LDL seperti aterogenik.
Partikel LDL dapat dioksidasi oleh ion metal, lipoksigenesis, mieloperoksidase dan spesies nitrogen reaktif. Secara in vitro, proses oksidasi– LDL oleh ion logam (Cu2+) terdapat tiga fase, yaitu inisiasi fase lag (mengambil antioksidan endogen), fase propagasi (dengan cepat terjadi oksidasi dari asam lemak tidak jenuh menjadi lipid hidroksiperoksida) dan fase dekomposisi (hidroksiperoksida diubah menjadi aldehid yang reaktif seperti malodialdehida, 4-hidroksinonenal). Interaksi yang terjadi antara aldehid dengan group ε-amino dari residu lisin yang bermuatan positif akan mengubah LDL menjadi bermuatan negatif. Efek yang ditimbulkan menyebabkan penurunan afinitas reseptor LDL namun afinitas reseptor scavenger makrofag meningkat. Partikel LDL yang teroksidasi dapat meningkatkan kejadian aterosklerosis dan penyakit jantung koroner (PJK).
Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga terhadap tingkat Oksidasi LDL
Pembentukan produk oksidasi MDA sangat dipengaruhi oleh lamanya waktu inkubasi dengan ion Cu2+. Semakin lama waktu inkubasi semakin banyak produk oksidasi LDL akan terbentuk. Data pada Tabel 7 memperlihatkan bahwa oksidasi LDL yang diinduksi oleh ion Cu2+ tanpa ekstrak yang diinkubasiselama 4 jam cenderung nilainya lebih rendah dibandingkan dengan yang inkubasi 6 jam, tetapi tidak signifikan (P>0,05). Pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga sebesar 2 - 8 ppm menyebabkan penurunan konsentrasi MDA dibandingkan dengan kontrol tanpa kurkuminoid, baik yang diinkubasi selama 4 jam maupun 6 jam (P<0,01).
Gambar 16 menunjukkan adanya peningkatan hambatan oksidasi LDL yang seiring dengan meningkatnya konsentrasi kurkuminoid, yakni sebesar 27,07% (inkubasi 4 jam) dan sebesar 21,21% pada inkubasi 6 jam dengan konsentrasi 8 ppm. Hal ini mengindikasikan bahwa kurkuminoid cukup kuat dalam menekan reaksi oksidasi LDL (P<0,01). Kurkuminoid yang ditambahkan dapat berfungsi mencegah ion Cu2+ dalam menginduksi peroksidasi lipid. Sesuai
74 pendapat yang dikemukan oleh Sreejevan & Rao (1997), bahwa LDL yang dioksidasi ion metal (Cu2+) dapat dihambat oleh kurkumin, namun aktivitas bisdemektoksi-kurkumin menjadi menurun.
Holvoet et al. (1994) menyatakan bahwa makrofag yang hanya diinkubasi dengan LDL normal secara in vitro tidak akan memproduksi sel busa, Keadaan ini akan berbeda apabila makrofag terakumulasi dengan LDL yang teroksidasi, sehingga dengan cepat ditangkap oleh reseptor scavenger. Salah satu sifat reseptor scavenger dari makrofag mempunyai spesifikasi ikatan dengan ligan yang luas. Ligan-ligan yang dapat diikat oleh reseptor scavenger dengan afinitas tinggi seperti: LDL terasetilasi, LDL teroksidasi, beberapa polinukleotida, beberapa polisakarida, fosfolipid terterntu dan lipopolisakarida bakteri. Menurut Mahlberg et al. (1990) akumulasi kolesterol dalam makrofag akan menyebabkan pembentukan sel busa. Sel busa ini kemudian akan mensekresikan faktor pertumbuhan dan sitokina sehingga merangsang proliferasi sel otot polos dan pembentukan sel busa oleh sel-sel otot polos (Vijayagoval dan Glancy 1996). Tabel 7 Efek kurkuminoid temu mangga pada oksidasi LDL yang diinduksi
dengan ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL) Inkubasi 4 jam Inkubasi 6 jam LDL 3 2,09 ±0,008 33,15±0,139 A 31,59±0,080 B 27,81±0,216 C 24,18±0,169 D 2,84±0,02 38,29A±0,28 33,53B±0,30 31,07C±0,14 30,18D±0,31 LDL+ Cu2++ E0 3 LDL+Cu2+ + E2 3 LDL+ Cu2++ E6 3 LDL+ Cu2++ E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid
2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 16 Penghambatan oksidasi LDL yang diinduksi ion Cu+2 oleh kurkuminoid pada inkubasi 4 jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm)
75 Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga terhadap Reaksi Oksidasi Lipid dalam Makrofag yang Diinduksi oleh Cu2+
Makrofag Mencit. Analisis malonaldehid (MDA) mengindikasikan terjadinya peningkatan peroksidasi lipid di dalam sel makrofag. Senyawa logam memegang peranan penting dalam pembentukkan oksidan yang dapat menginisiasi peroksidasi. Katalisasi-logam yang dihasilkan oleh radikal bebas merupakan faktor penting dalam progresi suatu penyakit (Halliwell & Gutteridge 1995).
Pengaruh kurkuminoid esktrak temu mangga dan lama waktu inkubasi terhadap reaksi oksidasi oleh sel makrofag mencit yang diinduksi dengan ion Cu2+ disajikan pada Tabel 8. Data menunjukkan bahwa ion Cu2+ dapat meningkatkan proses oksidasi di dalam sel makrofag mencit. Oksidasi lipid yang terbentuk pada sel makrofak tanpa kurkuminoid sebanyak 10,04±0,451 (inkubasi 4 jam) dan 10,64±0,11 (inkubasi 6). Keadaan ini berbeda ketika sel makrofag mencit diinkubasi dengan ion Cu2+5μM yang sebelumnya telah dipra-inkubasi dengan kurkuminoid selama 48 jam. Penambahan ion Cu2+5 μM meningkatkan proses oksidasi di dalam sel hampir 3 kali lipat. Peningkatan konsentrasi MDA menandakan oksidasi lipid yang terjadi di dalam sel makrofag meningkat. Sebagai kontrol dalam percobaan ini, sel makrofag mencit diinkubasi dengan ion Cu2+ tanpa kurkuminoid oksidasi lipid yang terbentuk sebanyak 2,2 % (4 jam) dan 2,3%. Hal ini menunjukkan bahwa waktu inkubasi tidak banyak mempengaruhi proses oksidasi lipid di dalal sel makrofag (P>0,05). Namun kenaikan oksidasi lipid ini dapat dihambat dengan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga sebanyak 2 ppm. Penghambatan oksidasi lipid oleh kurkuminoid meningkat dengan ditingkatkan dosis kurkuminoid, baik pada sel makrofag yang diinkubasi 4 jam maupun 6 jam. Secara statistik, penurunan konsentrasi MDA sangat bermakna (P<0,01).
Pra-inkubasi sel makrofag dengan kurkuminoid kurkuminoid 8 ppm selama 48 jam, ternyata menghambat proses oksidasi selular hingga 23,29 % (P<0,01). Hasil analisis ragam (anova) menunjukkan bahwa lama inkubasi mempengaruhi reaksi oksidasi lipid di dalam sel makrofag terutama pada perlakuan yang diberi kurkuminoid 2 ppm dan 6 ppm (P<0,01). Sedangkan pada
76 percobaan yang diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 8ppm dan di antara 4 jam dan 6 jam tidak ada perbedaan (P>0,05).
Penghambatan oksidasi LDL di dalam sel makrofag mencit yang diinduksi dengan ion Cu2+ akibat pemberian kurkuminoid hingga 23,29% (Gambar 17), yakni pada konsentrasi kurkuminoid 8 ppm (inkubasi 4 jam). Pola yang sama terlihat pada inkubasi 6 jam sebesar 19,82 %, namun penghambatannya tidak sebesar pada inkubasi 4 jam. Dalam percobaan ini, penghambatan oksidasi lipid dalam sel makrofag mencit tertinggi terjadi pada dosis kurkuminoid 8 ppm. Rao (1995) menyatakan bahwa kurkuminoid terutama kurkumin merupakan senyawa aktif yang banyak terkandung dalam temu-temuan berfungsi sebagai antioksidan, dan dapat menghambat proses oksidasi lipid serta menghambat proses degradasi oksidatif DNA.
Tabel 8 Efek kurkuminoid temu mangga terhadap reaksi oksidasi dalam sel makrofag mencit yang diinduksi ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL) Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 jam
Sel 3 10,04±0,451 33,70±2,09 A 28,36±1,15 B 27,78±0,51 B 25,85±0,19 B 10,64±0,11 34,33±0,01 A 33,93±0,71 A 31,82±0,27 AC 27,57±2,64 BC Sel + Cu2+ + E0 3 Sel + Cu2+ + E2 3 Sel + Cu2++ E6 3 Sel + Cu2++ E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid
konsentrasi 2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 17 Penghambatan oksidasi LDL dalam makrofag mencit yang diinduksi ion Cu2+ dan kurkuminoid selama 4jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm).
77 Menurut Quiles et al. (2002), kurkuninoid yang diisolasi dari Curcuma longa dapat menghambat peroksidasi lipoprotein secara invitro pada makrofag dan in vivo pada kelinci. Sedangkan jahe yang mengandung senyawa fenolik bersifat antioksidan, sifat antioksidan ini dapat melindungi sel dari kerusakan oksidatif terhadap sel (Kikuzaki dan Nakatani (1993). Kombinasi kedelai dan vitamin E dapat menurunkan konsentrasi LDL dan meningkatkan konsentrasi HDL secara nyata yang dilakukan pada monyet ekor panjang (Williams et al. 2001). Jadi dapat dikatakan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam percobaan ini telah berfungsi sebagai antioksidan.
Makrofag Beruk. Tabel 9 menunjukkan peningkatan proses oksidasi lipid di dalam sel makrofag beruk dengan adanya ion Cu2+. Sel makrofag yang diinkubasi dengan ion Cu2+ 5 μM dan tanpa diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga, ternyata dapat meningkatkan oksidasi lipid sebanyak 4 kali lipat. Dalam percobaan ini, penambahan kurkuminoid ternyata mampu menghabat proses oksidasi lipid di dalam sel makrofag beruk pada semua tingkat konsentrasi yang ditambahkan secara signifikan (P<0,01).
Konsentrasi MDA yang terbentuk pada sel makrofag tanpa diberi kurkuminoid ekstrak dan ion Cu2+ sebesar 6,78± 0,06 ( inkubasi 4 jam) dan 7,69 ± 0,19 (inkubasi 6). Bila dibandingkan dengan sel makrofag yang diinkubasikan dengan ion Cu2+, terjadi peningkatan oksidasi lipid sebanyak 7,6% (inkubasi 4 jam) dan 5,2 % (inkubasi 6 jam). Namun berbeda hasilnya ketika sel makrofag dipra-inkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga selama 48jam, ternyata kurkuminoid ekstrak mampu menghambat proses oksidasi lipid. Penghambatan oksidasi lipid terbesar terjadi pada konsentrasi kurkuminoid 6 ppm dan 8 ppm yaitu sebesar 23, 26 % (inkubasi 4 jam) dan 23,90 % (inkubasi 6). Sel makrofag yang diinkubasi dengan Cu2+ dalam medium pertumbuhan dapat melakukan proses oksidasi lipid. Sedangkan lama waktu inkubasi tidak berpengaruh terhadap reaksi oksidasi di dalam sel makrofag beruk (Gambar 18).
78 Tabel 9 Efek kurkuminoid temu mangga pada oksidasi dalam sel makrofag beruk,
diinduksi ion Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg protein LDL) Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 Jam Sel 3 6,78± 0,06 26,39 ± 0,04 A 22,47± 0,052 B 20,25± 0,054 C 20,26± 0,081 C 7,69 ± 0,19 26,13± 0,07A 22,68 ± 0,01B 20,13± 0,81C 19,89± 0,07C Sel + Cu2+ + E0 3 Sel + Cu2+ + E2 3 Sel + Cu2+ + E6 3 Sel + Cu2+ + E8 3
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid konsentrasi 2 ppm; E6 : 6 ppm, E8 8 ppm
Gambar 18 Penghambatan oksidasi lipid dalam sel makrofag beruk yang diinduksi ion Cu2+ dan kurkuminoid, inkubasi selama 4jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm)
Ion Cu2+ merupakan katalis yang dapat mengoksidasi lipid (Libby 2002). Makrofag berperan penting dalam peradangan dan sistim imun yang dibawa sejak lahir. Mekanisme ini tergantung pada kemampuan makrofag dalam memproduksi radikal oksigen bebas, protease, faktor komplemen dan sitokina. Makrofag juga menginisiasi respon imun yang menyebabkan kerusakan antigen (sel-T), aktivitas semua ini dapat berperan penting pada aterogenesis (Hansson 2005; Hansson 2009). Aterogenesis ini dapat dipercepat dengan adanya ion Cu2+. Hal ini terlihat dengan adanya peningkatan nilai malonaldehida (MDA) dari masing-masing kultur sel makrofag. Namun reaksi aktivitas ion Cu2+ ternyata dapat dihambat dengan pemberian kurkuminoid ekstrak temu mangga.
79 Inkubasi sel makrofag mencit (4 jam) dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga 8 ppm selama 4 jam, menghasilkan hambatan oksidasi yang lebih besar daripada yang diinkubasi 6 jam, yaitu 23,29% vs 19,82 % (Gambar 17). Namun tidak demikian dengan sel makrofag beruk, hambatan oksidasi LDL yang dihasilkan setelah diinkubasi selama 4 jam dan 6 jam tidak menunjukkan adanya perbedaan (Gambar 18). Adanya perbedaan hambatan oksidasi lipid yang terjadi antara sel makrofag mencit dan beruk diduga karena profil LDL yang dimiliki berbeda. Dalam percobaan ini diperoleh adanya penurunan kadar MDA pada sel makrofag yang diinkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga, jika dibandingkan dengan sel makrofag yang tidak diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga.
Pengaruh Kurkuminoid Ekstrak Temu mangga terhadap Proses Oksidasi LDL oleh Sel Makrofag
Percobaan ini dilakukan untuk mengkaji kemampuan sel makrofag yang telah dipra-inkubasi dengan ekstrak dalam mengoksidasi LDL. Inkubasi LDL dan sel makrofag terjadi peningkatan konsentrasi MDA Tabel 10. Pada kontrol, LDL yang diinkubasi dengan sel makrofag selama 4 dan 6 jam, secara berturut-turut menghasilkan konsentrasi MDA sebesar 19,95 ± 0,01 dan 18,98 ± 0,04. Pada kontrol sel makrofag yang mengoksidasi LDL, menghasilkan konsentrasi MDA 36,77 ± 0,91 dan 36,054 ± 2,02. Bila dilihat dari data ini, konsentrasi MDA yang dihasilkan sel makrofak lebih tinggi dibandingkan kontrol. Disini jelas terjadi peningkatan konsentrasi MDA disebabkan kontrol sel makrofag diinkubasi dengan LDLdan ion Cu2+. Namun pada kontrol tidak ada perbedaan (P>0,005) dengan tingkat persentase oksidasi sebesar 4,15% dan 4,10%.
Pada percobaan terhadap sel makrofag mencit yang diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 2 ppm dan diinkubasi selama 4 jam dan 6 jam terjadi penurunan oksidasi LDL meskipun sangat kecil. Hal yang berbeda terjadi ketika percobaan diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga 6 ppm dan 8 ppm. Proses oksidasi LDL di dalam sel makrofag mencit dapat dihambat sebesar 13,07% yang diinkubasi 4 jam, sedangkan pada inkubasi 6 jam sebesar 4,19%. Hasil uji Tukey pada percobaan yang diinkubasi selama 4 jam, memperlihatkan perbedaab (P<0,01). Kondisi ini menandakan bahwa konsentrasi 6 ppm mampu menekan
80 peningkatan konsentrasi MDA selama proses oksidasi. Hasil yang berbeda ditunjukkan juga pada ditunjukkan pada sel makrofag yang diinkubasi selama 6 jam ada perbedaan nyata (P<0,01). Sebagai kontrol dalam percobaan ini digunakan sel makrofag yang diinkubasikan dengan LDL dan ion Cu2+ tanpa diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga.
Peningkatan hambatan oksidasi LDL terhadap sel makrofag mencit Gambar 19 memperlihatkan yang diinkubasi dengan LDL dan diinduksi oleh ion Cu2+ selama 4 jam, penghambatan oksidasi LDL sebasar 13,07% , dan 4,19% yang diikubasi 6 jam. Bila dibandingkan dengan kontrol selyang diikubasi dengan LDL dan ion Cu2+ tanpa kurkuminoid ekstrak temu mangga, hambatan oksidasi LDL sebanyak 3,73% (inkubasi 4 jam) dan 2,51% ( inkubasi 6 jam). Adanya perbedaan waktu inkubasi antara perlakuan di atas menandakan bahwa LDL yang diinduksi dengan ion Cu+2 memberikan reaksi yang cukup reaktif terhadap LDL teroksidasi. Namun kurkuminoid ekstrak yang dipra-inkubasi dalam percobaan ini, mampu menekan pembentukkan MDA sehingga oksidasi LDL dapat dihambat. Selain itu, ada ketergantungan dosis kurkuminoid ekstrak temu mangga yang diinkubasikan selama 4 jam, dan penghambatan oksidasi LDL dimulai dari 3,73 %, 10,4% dan 13,07% (Gambar 19). Dalam percobaan ini, lama waktu inkubasi antara 4 jam dan 6 jam untuk setiap perlakuan, secara statistik tidak memberikan pengaruh yang bermakna (P>0,05).
Tabel 10 Efek kurkuminoid temu mangga terhadap oksidasi LDL oleh sel makrofag mencit yang diinkubasi dengan Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg proteinLDL) Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 Jam Sel + LDL 3 19,95 ±0,01 18,98 ±0,04 Sel + LDL + Cu2 ++ E0 3 36,77±0,91 A 36,054 ±2,02 Sel + LDL + Cu2+ + E2 3 35,39 ±1,06 A 35,150 ±1,22 Sel + LDL + Cu 2++ E6 3 32,89 ±0,18 BA 34,190 ±1,69 Sel + LDL + Cu 2++ E8 3 31,97 ±0,03 B 34,544 ± 0,72
Keterangan:Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menujukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid 2 ppm;E6 6 ppm,
81 Gambar 19 Panghambatan oksidasi LDL oleh kurkuminoid ekstrak pada
makrofag beruk yang diinkubasi dengan LDL + Cu+2 pada inkubasi 4 jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm) Oksidasi LDL oleh sel makrofag beruk yang telah dipra-inkubasi dengan kurkuminoid 8ppm menurun secara bermakna (P<0,01) (Tabel 11). Proses oksidasi LDL menghasilkan MDA yang terjadi pada sel makrofag beruk sebesar 7,89 ± 0,02 (inkubasi 4 jam) dan 8,24 ±0,86 (inkubasi 6 jam). Peningkatan oksidasi LDL terjadi setelah sel makrofag diinkubasi dengan LDL dan ion Cu2+. Konsentrasi MDA yang terbentuk sebesar 27,11 ± 0,97 (inkubasi 4 jam) dan 30,86 ± 2,49 (inkubasi 6 jam). Peningkatan konsentrasi MDA pada sel makrofag tanpa diberi kurkuminoid sebesar 2,9% dan 9,1%. Konsentrasi MDA ini dapat diturunkan setelah sel makrofag dipra-inkubasi dengan kurkuminoid ekstrak temu mangga.
Gambar 20 memperlihatkan hambatan oksidasi LDL oleh sel makrofag yang diberi kurkuminoid 2 ppm sebesar 6,14 % (inkubasi 4 jam). Penghambatan oksidasi LDL dapat dititingkatkan menjadi 12,33 % setelah kultur sel makrofag dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid 8 ppm. Sedangkan kultur sel makrofag yang diinkubasi selama 6 jam terjadi penurunan konsentrasi MDA dari 30,86±2,49menjadi 23,37±0,12. Besar penurunan konsentrasi MDA menandakan adanya penghambatan oksidasi LDL di dalam sel makrofag dari 8,93% menjadi 24,28 %. Keadaan ini memberikan hasil yang cukup baik dari kurkuminoid dalam menekan proses oksidasi LDL.
Data meunjukkan semakin tinggi konsentrasi ekstrak kurkuminoid yang diberikan, semakin bermakna penurunan proses oksidasi LDL yang terjadi (P<0,01). Uji Tukey terhadap perlakuan E0 dengan E6 dan E0 dengan E8
82 menunjukkan adanya penurunan konsentrasi MDA yang sangat bermakna (P<0,01), baik pada inkubasi 4 jam maupun 6 jam.
Tabel 11 Efek kurkuminoid temu mangga terhadap oksidasi LDL oleh sel makrofag beruk yang diinkubasi dengan Cu2+
Perlakuan N Konsentrasi MDA (nmol/mg proteinLDL) Inkubasi 4 Jam Inkubasi 6 Jam
Sel + LDL 3 7,89±0,02 8,24±0,86 Sel + LDL + Cu2+ + E0 3 27,11±0,97 A 30,86±2,49A Sel + LDL + Cu 2++ E2 3 25,45±0,05AB 28,11±1,23AB Sel + LDL + Cu 2++ E6 3 24,02±0,12 B 27,21±1,92AB Sel + LDL + Cu 2++ E8 3 23,77±0,10 B 23,37±0,12 B
Keterangan:Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01), E0: tanpa kurkuminoid; E2 kurkuminoid 2 ppm;
E6 : 6 ppm, E8 : 8 ppm
Gambar 20 Penghambatan oksidasi LDL oleh makrofag beruk yang diinkubasi dengan Cu+2 dan kurkuminoid ekstrak selama 4jam (biru) dan 6 jam (merah) (E2: 2 ppm; E6: 6 ppm, E8: 8 ppm)
Kurkumin merupakan turunan dari kurkuminoid, diketahui mempunyai kemampuan dalam mencegah terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid merupakan kondisi awal kemajuan dari beberapa penyakit. Menurut Quiles et al. 2002, secara in vitro, kurkumin 2,4-9,6 umol/l dapat menghambat oksidasi LDL manusia, mencegah peroksidasi lipid plasmatik dan diketahui bahwa lipid plasmatik berperan penting dalam patogenesis penyakit. Penggunaan 500 mg kapsul kurkumin 98% murni yang diberikan pada voluntair selama 7 hari tidak memperlihatkan efek toksisitas (Soni & Kuttan 1992). Menurut Rao (1995), kurkumin dapat menghambat peroksidasi lipid pada hemogenat hati dan otak tikus
83 yang mengalami udema. Kurkumin mempunyai kemampuan dalam mencegah perluasan penyakit seperti menurunkan kerentanan LDL terhadap oksidasi, menceggah proliferasi sel-sel otot polos pembuluh darah, mempunyai efek antitrombik, efek hipotensif sementara dan mencegah agregasi platelet in vivo. Fuhman et al. (2000) menyatakan modifikasi oksidatif dari LDL memegang peranan penting di dalam pathogenesis atherosclerosis, kondisi ini dapat dihindarkan dengan mengkonsumsi makanan yang kaya akan antioksidan fenolik. Selanjutnya dikatakan bahwa 76% antioksidan fenolik yang berasal dari jahe dapat menurunkan biosintesa kolesterol selular pada makrofag peritoneal mencit.
Sreejayan et al. (1997) melaporkan bahwa sebanyak 500 mg kurkumin yang diberikan pada manusia selama 7 hari dapat menurunkan peroksidasi lipid darah sebesar 35%. Salah satu fungsi kurkumin adalah mengeliminasi radikal bebas (radikal hidroksi, radikal superoksida, nitrogen dioksi, dan nitrogen monooksida), dan mencegah terbentuknya turunan dari radikal superoksid (Ruby & Lokesh 1995; Sreejayan et al. 1997).
Makrofag yang diinduksi oleh LDL teroksidasi akan melepaskan radikal bebas yang dapat mempengaruhi lingkungan sekitarnya Libby (2002) . Kurkumin 8 ppm/ml (kurkuminoid) yang ditambahkan dalam percobaan mampu menghambat pelepasan radikal bebas. Apabila dilihat dari hasil percobaan yang telah dilakukan, maka penelitian ini memberikan angin segar bagi dunia pengobatan Indonesia dalam mengembangkan obat tradisional untuk mencegah awal terjadinya proses arterosklerosis. Jayaprakasa dkk. (2005) menyatakan bahwa gugus hidroksil dan metoksil pada cicin fenil dan subtituen 1,3 diketon memiliki peran penting yang sangat signifikan dalam kemampuan kurkumini sebagai antioksidan.
Rataan kadar MDA (nmol/ml protein LDL) dari hasil percobaan menunjukkan, kurkuminoid ekstrak temu mangga memberikan efek menekan terhadap reaksi oksidasi LDL. Demikian juga terhadap kultur makrofag mencit maupun makrofag beruk yang diinduksi dengan Cu2+. Secara umum, dosis kurkuminoid ekstrak 2 ppm/ml yang ditambahkan ke dalam kultur belum mampu mencegah proses oksidasi LDL secara sempurna. Namun demikian, terjadi
84 peningkatan penghambatan oksidasi LDL setelah dosis kurkuminoid ekstrak ditingkatkan.
Reaksi oksidasi LDL oleh sel makrofag mencit dan beruk yang ditambahkan LDL terjadi setelah diinkubasi selama 4 jam dan 6 jam. Namun demikian laju oksidasi yang dihasilkan jauh lebih rendah, dibandingkan bila LDL dioksidasi lebih dahulu dengan cara menambahkan ion Cu2+. Hal ini membuktikan bahwa penambahan ion Cu2+ dapat mempercepat proses reaksi oksidasi secara in vitro baik pada sel makrofag maupun LDL yang diinkubasikan dalam inkubator CO2.
uji Tukey terhadap lama waktu inkubasi sangat mempengaruhi penurunan oksidasi LDL ketika LDL diinkubasikan ke dalam kultur makrofag mencit dan beruk. Penurunan oksidasi ini terjadi setelah kultur dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml (Tabel 10 dan 11). Keadaan ini disebabkan oleh LDL yang digunakan berasal dari monyet ekor panjang.
Telah diuraikan di atas bahwa Monyet ekor panjang dan beruk berasal dari spesies yang sama yaitu primata yang berbeda dengan mencit. Secara patologis dan fisiologis, beruk dan monyet ekor panjang mempunyai kesamaan reaksi biologis diantara sel-sel tubuh yang ada. Namun berbeda dengan mencit, sehingga mencit secara patologis-fisiologis memberikan reaksi yang berbeda pula terhadap reaksi oksidasi LDL yang berasal dari monyet ekor panjang.
Makrofag yang diinkubasi dengan LDL secara in vitro, tidak akan memproduksi sel busa. Kondisi ini akan berbeda apabila makrofag terakumulasi dengan LDL termodifikasi sehingga dengan cepat dapat ditangkap oleh reseptor skavenger (Holvoet & Collen 1994). Partikel LDL yang teroksidasi /peroksidasi lipid, dapat terjadi pada semua sistem yang mengandung hidrogen peroksida (H2O2). Hidrogen peroksida mempunyai efek yang sangat kuat terhadap peroksida
lipid, sehingga peroksida lipid akan menginduksi ekpresi gen katalase pada sel-sel yang dikultur (in vitro). Hidrogen peroksida, secara umum dapat sebagai mediator oksidasi pada semua mekanisme yang ada pada LDL teroksidasi. Katalase merupakan protein enzim yang dapat meningkatkan aktivitas dinding arteri yang telah diteliti pada tikus jantan C57 BL/6 (Meilhac et al. 2001).
85 Hasil penelitian Keaney et al. (1999) terhadap sel pembuluh darah secara in vitro menunjukkan bahwa terjadinya oksidasi LDL akan merbentuk ligan bagi reseptor skavenger sehingga mengakibatkan terbentuknya sel busa. Molekul LDL teroksidasi adalah zat kemotaksis terhadap kultur monosit dan dapat menstimuli selr dalam memproduksi kemokina yang potensial dalam menarik sel radang ke dinding arteri
Dapat disimpulkan dari hasil analisis terhadap data dalam penelitian ini bahwa, LDL teroksidasi yang diinkubasikan ke dalam makrofag mencit dan beruk dapat dihambat oleh kurkuminoid ekstrak temu manggs. Hal ini ditunjukan dengan penghambatan reaksi oksidasi yakni pada kultur yang diberi kurkuminoid ekstrak temu mangga hingga 8 ppm/ml (P<0,01). Ini berarti kurkuminoid ekstrak temu mangga dapat fungsinya sebagai antioksidan. Selain itu makrofag mencit lebih responsive terhadap ekstrak kurkuminoid debandingkan dengan makrofag beruk.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa kurkuminoid ekstrak temu mangga dapat menghambat proses oksidasi LDL di tingkat seluler, baik pada sel makrofag mencit maupun makrofag beruk. Sel makrofag mencit lebih responsif terhadap kurkuminoid ekstrak temu mangga dibandingkan dengan sel makrofag beruk. Makrofag mencit yang diinkubasi dengan kurkuminoid 8 ppm mampu menghambat oksidasi LDL yang ditandai dengan penghambatan oksidasi LDL sebesar 13,07% yang diinkubasi selama 4 jam (P<0.01). Sedangkan pada makrofag beruk, penghambatan oksidasi LDL sebesar 24,28% yang diinkubasi selama 6 jam (P<00).
Saran
Saranyang diberikanadalah adanya penelitian lanjutan untuk membuktian penghambatan oksidasi LDL oleh kurkuminoid ekstrak temu mangga secara in vivo pada hewan laboratorium. Bagaimana mekanisme kerja kurkuminoid temu
86 mangga dalam menurunkan kadar kolesterol LDL dan fraksi-fraksi lipoprotein lainnya. Masih diperlukan uji terhadap toksisitas kurkuminoid ekstrak temu mangga dan khasiat-khasiat lain serta melakukan orientasi efektivitas dosis kurkuminoid dengan tepat.
DAFTAR PUSTAKA
Adams MR, Kaplan JR, Kornitnik DR, Clarkson TB. 1985 Ovariectomy, social status, and atheroscerosis in cynomolgus monkets. Aterioscleris 5:1992-200.
Argmann CA, Caroline H, Diespstraten van D, Sawyer CG, Edwards JY, Hegele RA, Wolfe BM, Huff MW. 2001. Transforming growth factor- β1 inhibits macrophage cholesteryl ester accumulation induced by native and oxidized VLDL remnants. Arterioscler Thromd Vasc Biol. 21:2011-2018.
Aviram M, Dornfeld L, Rosenblat M, Volkova N, Kaplan M, Coleman R, Hayek T, Presser D, Fuhrman B. 2000. Promeganate juice consumption reduces oxidative stress, atherogenic modifications to LDL, and aggregation: studies in human and in atherosclerotic apolipoprotein E-deficient mice. Am. J Nutr. 71:1062-1076.
Brown MS, Goldstein JL. 1986. Nobel Lecture. The Nobel Foundation.
Clarkson P, Adams MR, Powe AJ, Donald AE, McCredie R, Robinson J, Bettiridge DJ, Celermajer DS and Deanfield JE. 1996. Oral-Larginie improves andothelium-depependent dilatation in hypercholesterolemic young adults. 92: 361-366.
Conti M, Morand CP, Levillain P, Lemonniera A. 1991. Improved flouroletric determination of malondialdehyde. Journal Clinical Chemistry 37: 1273-1275.
Esterbauer H. 1993. Cytotoxicity and genotoxicity of lipid oxidation products, Am.J.Clin.Nutr. 57:779S-7786S.
Fuhman B, Rosenblat M, Hayek T, Coleman R & Aviram M. 2000. Ginger Extract Consumption Reduces Plasma Cholesterol, Inhibits LDL Oxidation and Attenuates Development of Atherosclerosis in Atherosclerotic, Apolipoprotein E- Deficient Mice. J. Nutr. 130:1124-1131.
Franke A, Lante W, Kurig E, Zoller LG, Weinhold C, Markewitz A. 2006. Is interferon gamma suppression after cardiac surgery caused by a decreased interleukin-12 synthesis?. Ann Thorac Surg 82(1):103-109.
87 Gaspersz V. 1991. Metode Perancangan Percobaan untuk Ilmu-ilmu Pertanian,
Ilmu-ilmu Teknik dan Biologi. Bandung: CV. Armico.
Halliwell B, Gutteridge JMC, Cross CE. 1992. Free radicals, antioxidants and human diseases, where are we now ?. J. Lab Clin Med. 119(6): 598-620. Hansson GK. 2005. Inflamation, atherosclerosis and coronary atery disease.
Atheroscler Thromb Vasc Biol. 352:1685-1695.
Hansson GK. 2009. Atherosclerosis-an immune disease: the Atnitschove lecture 2007. Atheroscler, 202(1):2:10.
Holvoet P, Collen D. 1994. Oxidazed lipoprotein in atherosclerosos and thrombosis. Faseb J. 8: 1279-1284.
Hortan HR, Moran LA, Ochs RS, Scrimgeour. 1996. Principles of Biochemistry. Ed. 2. New York: Prentice- Hall International, Inc. hal 459-491.
Jayaprakarsha GK, Rao MJ & Sakaria KK. (2005). Chemistry and biological activities of Curcuma longa. Trends in Food Science and Tecnology 16, 33-48.
Keaney JF et al. 1999. Vitamin E and vascular homeostasis: implication for atherosclerosis. Faseb J. 13:965-972.
Kikuzaki H, & Nakatami N. 1993. Antioxidants Effect of Some Ginger Constituent. Dalam: J. Food Scient. 58:1407-1409.
Kleinveld HA, Hak-Lemmers HM, Stalenhoef AFH, Demacker PNM. 1992. Improved measurement of low-density lipoprotein susceptability to cooper-induced oxidation: application of a short procedure of isolation low-density liporotein. Clin. Chem. 38: 2066-2072.
Libby P. 2002. Inflamation in atherosclerosis. Nature 42:868-874.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Far A, randal NJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol Chem. 193:265-275.
Mahlberg FH, Glick JM, Jerome WG and Rothblat. 1990. Metebolism of cholesteryl ester lipid droplets in a J774 macrophage foam cell model Biochemica et Biophysica, 1045:291-298.
Meilhac O, Ramachandran S, Chiang K, Santanam N, Phatasarathy S. 2001. Role of arterial wall antioxidant defense in benefficial effects of exercise on atherosclerosis in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21:1681-1688. Mertens A, Holvoet P. 2001. Oxidazed LDL and HDL: antagonists in
atherothrombosis. Faseb J. 15:2073-2077.
Packard RS and Libby P. 2008. Inflammation in Atherosclerosis: from Vascular Biology to Biomarker Discovery and risk prediction. Clin. Chem. 54:1 : 24-38.
88 Priyana A.13 April 2004. Anggur merah baik untuk jantung. Kompas: 36 (kolom
5-8).
Quiles JL, Dolores M, Ramires-Tortosa CL, Aquilera CM, Battina M, Gill A, Ramires-Tortosa MC. 2002. Curcuma longa extract suplementation reduces oxidative stress and attenuates aortic fatty streak development in rabbits. Arteriolscler Thromb Vasc Biol. 22:1225-1231.
Rao MNA. 1995. Antioxidan properties of curcumin. Didalam: Proceeding of the International Symphosium on Curcumin Pharmacochemistry (ISCP) August 29-31, 1995. Curcumin Pharmacochemistry. Yogyakarta.
Riemersma RA. 1994. Epidemiology and the role of antioxidant in preventing coronary heart disease. A Brief overview. Proc. Nutr. Soc. 53: 59-65.
Robertson AKL and Hansson GK. 2006. T Cells in Atherosclerosis. For Better or Worse. Atherioscler throm Vasc Biol; 26:2421-2432.
Ross R. 1999. Atherosclerosis an Inflammatory disease. N Engl. J Med. 340:11 Sreejayan N, Rao MNA. Pryardasini KI, Devasagayen TP. 1997. Inhibition of radiation induced lipid peroxidation by curcumin. Int. J. Phamr, 151:127-130 -126.
Ruby AJ, Lokesh BR. 1995. Anti-tumor and antioxidant activity of Natural curcuminoid. Cancer Lett. 146:35-37.
Schwenke DC. 1998. Antioxidants and atherogenesis. J. Nutr. Biochem. 9:424-445.
Soni KB & Kuttan R. 1992. Effect of oral curcumin administration on serum peroxides and cholesterol level in human volunteer. Indian J Physiol pharmacol. 36 (4):273-27.
Sreejayan N, Rao MNA. 1997. Curcuminoid as potent inhibitor of lipid peroxidation. J. Phar. Pharmacols 46:1013-1016.
Sreejayan N, Rao MNA. Pryardasini KI, Devasagayen TP. 1997. Inhibition of radiation induced lipid peroxidation by curcumin. Int. J. Phamr, 151:127-130.
Sulistiyani, St Clair RW. 1991. The method of isolation of primary cells and their subcultute influence the expression of LDL receptor on Pigeon and chicken embryo cells in culture. Arteroscler. 91:123-135.
Steinberg D. 1993 . Vitamin E for a healthy heart. New Eng. J. Med. 31:33-58. Vijayagopal P, Glancy DL. 1996 . Macrophages Stimulate Cholesteryl Ester
Accumulation in Cultured Muscle Cells Incubated with Lipoprotein Proteoglycan Complex. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16:1112-1121.
89 Williams JK, Adam MR, Klopfeinstein HS. 2001. Estrogen modulated responses
of atherosclerotic coronary arteries. Circulation 81:1680-7.
Williams JK Suparto . 2004. Hormone replacement therapy and cardiovascular disease: lessons from a monkey model of postmonopausal women. Ilar J. 4 (2): 139-146.
Wuryastuti H. 2000. Stres oksidatif dan implikasinya terhadap kesehatan. Pidato pengukuhan Jabatan Guru Beasar dalam Ilmu Penyakit Dalam FKH- UGM Yogyakarta
