Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan penge -tahuan tentang konsep biologi molekuler dan peng -gunaan tehnik-tehnik dalam laboratorium
Teknologi DNA telah meluncurkan revolusi
dalam bidang bioteknologi
yaitu manipulasi
organisme atau komponen organisme untuk
melakukan tugas tugas praktis untuk
menghasilkan produk yang bermanfaat.
Semuanya melibatkan para peneliti dari
bidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologi
KEMAMPUAN YANG REVOLUSIONER DARI
REKAYASA GENETIKA
Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan yang revolusioner, antara lain :
– Cepat
– Dapat diterapkan secara universal
– Dapat dilakukan pengendalian yang ketat
terhadap proses manipulasi
– Dapat membentuk berbagai kombinasi genetik
Cara / Garis besar kloning gen :
1. Membuka sel hidup. Untuk ini terdapat beberapa cara,
kemudi-4. Memotong gen khusus yang diinginkan.
Metode ini dilakukan dengan cara seperti meng -edit film. Seperti halnya film, DNA juga terdiri atas ”frame” untuk menunjukkan urutan yang tepat.
5. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang
disebut cloning vehicles yang akan membawa potongan DNA ke dalam sel hidup lain.
o. Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.
o. Menempatkan gen khusus pada kloning vehicle mi rip seperti menyambung adegan cerita dalam film pendek.
o. Proses penyambungan menghasilkan chimeric DNA molekul ( molekul DNA kimera ), Sebagian adalah gen khusus dan bagian lainnya adalah gen dari cloning vehicle tersebut.
Cloning vehicle yang mengandung potong-
an khusus DNA tadi dimasukkan ke dalam
sel inang yang biasanya adalah organisme
sel tunggal ( seperti bakteri atau ragi ).
membiarkan sel inang untuk memperbanyak
Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong
DNA berlangsung baik. Seperti halnya film yang
menjadi berguna setelah diproyeksikan. Demuikian juga informasi dalam DNA yang harus dirubah
kedalam produk yang berguna.
Untuk membuat produk, informasi dalam DNA
ditransfer dari gen ke tempat molekul protein diproduksi.
Pembuatan produk berdasar informasi yang
Yang harus kita ketahui, protein adalah
rangkaian molekul yang terdiri dari ratusan
mata rantai asam nukleat.
Suatu tipe dari fungsi protein sebagai balok
penyusun struktur sel, dan tipe lain yang
Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara
memurnikan protein pankreas babi.
Tetapi sekarang dengan tehnik kloning gen,
yaitu : memindahkan gen insuling manusia
ke dalam sel bakteri. Dengan demikian akan
didapatkan produksi insulin dalam jumlah
Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin
dengan perantara bakteri.
Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk
mengontrol metabolisme gula dalam tubuh kita.
Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict)
TINGKAT KEBERHASILAN KLONING :
Dipengaruhi oleh :
Pemilihan Vektor
Pemilihan sistem kloning, tergantung pada
penentuan tujuan yang ingin dicapai.
Tujuan dari kloning fragmen DNA
– Isolasi dan perbanyakan fragmen DNA murni
– Preparasi pelacak DNA atau RNA dari urutan spesifik – Sequencing daerah penting pada berbagai genom – Ekspresi dan pemurnian sejumlah protein biologis – Modifikasi genetik species
Garis besar kloning gen :
Membuka sel hidup, dengan cara memblender ,
skuensing dan destruksi ( memecah sel ).
Mengambil informasi genetik ( DNA ). Karena
molekul DNA panjangnya ratusan kali molekul lain didalam sel.
Memotong gen (DNA) khusus yang diinginkan
menggunakan enzim restriksi.
Menempatkan potongan DNA spesifik kedalam
perantara yang disebut “cloning vehicles “ yang akan membawa DNA ke sel hidup yang lainnya.
Perangkat Teknik DNA Rekombinan
/ Rekayasa Genetika
:
Enzim restriksi
Vektor / wahana kloning
Konstruksi dan pengklonan
Enzim Restriksi
▲
Adalah :
Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pe motongan DNA dibeberapa tempat / lokasi spesifik dengan jumlah yang terbatas & dapat direproduksi. ▲ Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease restriksi( Russell, 1980).
▲ Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam
nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan target umumnya sering muncul berkali kali.
Sejarah penemuan enzim restriksi
Stewart Linn & Werner Arber (1960)
Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim
nuklease “restriksi” dalam bakteri E.coli galur B yang dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.
Hamilton Smith (1970)
– Pertama kali menemukan enzim nuklease
restriksi spesifik yang memutus DNA pada tempat- tempat tertentu dan dapat
diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae
Watson dkk, (1983)
Menemukan nuklease restriksi & metilase
modifikasi dalam dua galur
E.coli
lain yang
membuka kemungkinan adanya banyak
Enzim gol 1
Memecah DNA pada tempat yang tidak spesifik,
jauh dari tempat pengolahan.
Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik.
Antara lain : enzim-enzim yang terlibat dalam
Enzim gol 2
Memecah DNA pada tempat yang spesifik. Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme
(Russell, 1980).
Vektor / Wahana kloning
♦ Seutas molekul DNA tunggal tempat
dilekatkannya material genetik yang kita
inginkan sebelum di injeksikan ataupun
ditransformasikan kedalam bakteri tertentu.
♦ Wahana kloning yang paling sering di
Plasmid
Adalah unsur genetik diluar kromosom ( ekstrakromosomal), yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel bakteri.
DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda.
Mendukung gen yang diperlukan untuk replikasi ataupun fungsi lain yang dipikulnya.
Plasmid mudah dipisahkan dan dimurnikan dari DNA inang Pada Rhizobium sp. plasmid berguna karena terlibat dalam
Adalah molekul yang dapat diturunkan secara stabil
tanpa mengkaitkannya dengan kromosom.
Sangat berarti bagi bidang kedokteran , farmasi, dan
pertanian , karena plasmid membawa resisten terha dap antibiotik yang berguna bagi manusia dan hewan.
Selain itu dapat menjandikan toksin dan protein lain
Jenis plasmid
Plasmid F :
– Berfungsi dalam proses konjugasi dan dikenal pada
berbagai bakteri. Plasmid faktor R :
– Plasmid yang membawa gen-gen penyebab resistensi
terhadap antibiotik. Plasmid Ti :
– Pada berbagai Agrobacterium
– Fungsi berhubungan dengan tumbuhan inang, yaitu
Fungsi plasmid
Mendukung replikasi
Sebagai vektor untuk pengklonan DNa
Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )
– Contoh : plasmid resisten p BR. 322.( plasmid R.E Coli ,
yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap ampicilin dan tetrasiklin. )
♦ DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara “melisiskan” sel
bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom.
.
Kuliah ke11
Konstruksi dan Pengklonan
¤. Pengisolasian DNA sumber gen dan vektor
– Isolasi DNA sebagai sumber gen menggunakan enzim
endonuklease. diperoleh dari gen yang diinginkan yang kemudian ditumbuhkan / dikultur kan dalam laboratorium.
– Isolasi plasmid dari bakteri (E.coli ) yang membawa 2 gen
penanda e.g.
– 1. Resistensi terhadap antibiotik ampisilin,
¤. Penyelipan DNA kedalam vektor ( 3 langkah) 1. Memotong DNA yang ingin diselipkan dan DNA plasmid dengan enzim restriksi yang
sama. Pada saat pemotongan enzim restrik si membuat / menciptakan ujung ujung ket dari kedua DNA.
2. Menyatukan kedua utas DNA dimana ke 2 ujung lengket akan berpasangan
3. Menggabungkan molekul molekul DNA
¤. Pemasukan vektor kedalam sel
– Sel bakteri akan mengambil plasmid dengan cara trans formasi
(penyerapan DNA dari larutan disekelilingnya).
¤. Pengklonan sel- sel ( gen DNA asing)
– Dalam proses ini bakteri yang telah mengandung plasmid
rekombinan ditempatkan dalam nutrien agar yg mengandung ampisilin dan x- gal ( gula).
– Bakteri akan bereproduksi yang membentuk koloni sel rekombinan.
yang mengandung sel rekombinan resisten antibiotik ampisilin dan gen lak Z.
¤.
Identifikasi klon gen rekombinan.
– Dengan metode hibridisasi asam nukleat :menggunakan utas DNA / RNA yang pendek dapat diketahui urutan basanya disebut probe asam nukleat.
– Probe asam nukleat diberi label radio isotop
PCR ( Polymerase Chain Reaction)
Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen
DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel.
PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali
dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan
Manfaat PCR
Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.
Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah Kerjanya sangat spesifik dan ampuh.
Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk
dideteksi
Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrio
Analisis DNA Hasil Klon
Electroforesis
Southern Blotting
Aplikasi DNA Rekombinan
Dalam Bidang Kedokteran
Dalam Bidang Farmasi
Dalam Bidang Forensik
Dalam Bidang Lingkungan
Dalam Bidang Pertanian
Konjugasi, transformasi, transduksi
Konjugasi
Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke
sel bakteri lainnya secara kontak antar sel.
Sel donor akan memberikan informasi genetik
kepada resipien.
Plasmid akan mengontrol formasi filamen
Plasmid memiliki sistim khusus untuk
replikasi dan transfer DNA plasmid dan
sistem pengontrolan
Transformasi
Prosesperpindahan genetik dimana sel
resipien membutuhkan molekul DNA bebas
( DNA yang berada diluar sel atau yang telah
dimurnikan.
Dalam laboratorium transformasi dapat
dilakukan dengan mengisolasi DNA donor
kemudian menambahkannya pada suspensi
selresipien.
Pada prinsipnya transformasi akan terjadi
bila sel resipien mampu menerima DNA yang
telah diisolasi dari sel donor.
Transformasi dapat terjadi pada bakteri
Gram positif ataupun Gram negatif
Transduksi
Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh
virus dari sel inang .
Transduksi terbagi 2
– Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa
virus tertentu.gen inang langsung diintegrasi kedalam genomvirus.lalu ditransfer ke resipien
selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )
– Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga
– Transduksi umum : gen gen inang yang berasal
dari suatu genom akan menjadi bagian dari
partikel DNA virus yang sudah matang darisuatu tempat atau penambahan pada genom virus.
– Virus yang telah mengalami transduksi tidak
