BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan penelitian yaitu penyiapan sampel, skrining simplisia, karakterisasi simplisia, penyiapan hewan percobaan dan pengujian respon hipersensitivitas tipe dan titer antibodi pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis secara ANAVA (analisis variansi) dan Kruskal-Wallis dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey menggunakan SPSS (Statistical Product and Service Solution) versi 17.0 dan Mann Whitney.
2.1. Alat dan Bahan 2.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboraturium,microtiration plate96, microtube, mortir dan stamfer, neraca hewan, neraca listrik, oral sonde, mikro pipet, plethysmometer digital,spuit 1ml, dan
centrifuge PLC series, kandang mencit. 2.1.2 Bahan-bahan
2.2 Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan dengan berat badan 20-35 gram yang berumur 8-12 minggu.Sebelum digunakan, mencit dipelihara selama 2 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya, dan diberi makan pelet hewan serta air.
2.3 Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Fraksi diperoleh dari Amos P. Lumban Tobing pada Juni 2016. Metode fraksinasi yang digunakan yaitu metode maserasi, sesuai dengan yang tertera dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
Serbuk simplisia dan mahkota dewa dimaserasi dengan 75 bagian pelarut n -heksan sampai seluh serbuk terendam, ditutupi dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk. Kemudian sampel disaring dan filtat diproleh, sedangkan residu di rendam kembali menggunakan 25 bagian n -heksan, dimasukkan dalam wadah dan disimpan ditempat yang terlindung dari cahaya selama 2 hari (Ditjen POM, 1979). Seluruh maserat digabung dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator pada temperature ±40ºC, kemudian dikeringkan dengan freeze dryer pada suhu -40ºC sampai diperoleh fraksi kental.
2.4 Penyiapan Hewan Percobaan
sebagi hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu dalam kandang yang baik pada suhu ruangan untuk penyesuaian lingkungan, pengontrolan kesehatan dan berat badan. Mencit diberi makan pelet hewan dan tetap diberi air minum.
Penentuan besar sampel dihitung dengan rumus Federer (Arkeman dan David, 2006) sebagai berikut:
Keterangan: n= besar sampel
t= jumlah kelompok perlakuan
jumlah hewan yang digunakan 5 ekor. Perhitungan jumlah hewan yang digunakan dapat dilihat pada (Lampiran 6).
2.5 Penyiapan Kontrol, Bahan Uji, dan Antigen
Penyiapan kontrol, bahan uji, dan antigen meliputi penyiapan CMC 0,5%,penyiapan suspensi levamisol, penyiapan suspensi fraksi n-heksan daun mahkota dewa dan penyiapan sel darah merah sapi.
2.5.1 Penyiapan Suspensi CMC Na 0,5%
Sebanyak 0,5 gNa-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi aquadest yang dipanaskan. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang transparan, diencerkan dengan aquadest, dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml,dicukupkan volumenya dengan aquadest hingga 100 ml.
2.5.2 Penyiapan Suspensi levamisol
Pengambilan tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan digerus tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan tersebut kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang 25 mg levamisol (Depkes, 1995).
Pembuatan suspensi levamisol dilakukan dengan cara sebagai berikut: levamisol 29,46 mg (setara dengan 25 mg levamisol) sebanyak 0,25 mg ditimbang dan dimasukkan kedalam lumpang. Digerus serbuk kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 0,5% secukupnya. Digerus hingga homogen dan dituangkan kedalam labu tentukur 25 ml,ditambahkan suspensi CMC Na 0,5% sampai batas tanda. Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada (Lampiran 4).
2.5.3 Penyiapan Suspensi Fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD)
Untuk dosis 100 mg/kg BB dibuat dengan cara sebagai berikut; Ditimbang 100 mg fraksi n-heksan daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 0,5% sambil digerus hingga homogen, setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan dengan suspensi CMC Na 0,5% hingga garis tanda. Begitu juga untuk pembuatan dosis 25 mg/kg BB dan 50 mg/kg BB dilakukan hal yang sama.
2.5.4 Penyiapan Phosphate Buffered Saline (PBS)
2.5.5 Penyiapan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berikut: Darah segar dikumpulkan dari sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml. Kemudian ditambahkan 1,5 ml antikoagualan dan dimasukkan ke dalam termos yang berisi es.
Darah sapi segar yang telah diberi antikoagulan dimasukkan dalam tabung sentrifus sebanyak 5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan plasma dari sel darah merah. Lapisan atas yang berupa plasma dibuang dan lapisan bawah yang berupa endapan sel darah merah ditambahkan larutan PBS sebanyak 3 ml. Tabung kemudian dibolak-balik dengan perlahan-lahan sampai SDMS tercampur secara homogen, kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Lapisan atas yang jernih dibuang dan lapisan bawah adalah SDMS murni. SDMS ditambahkan PBS sebanyak 3 ml homogenkan sehingga diperoleh SDMS 50%. Kemudian diambil 0,2 ml SDMS 50%, ditambahkan larutan PBS sebanyak 10 ml sehingga diperoleh SDMS 1% (Emelda, 2015).
2.6 Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator fraksi n-heksan daun mahkota dewa ditentukan dengan mengukur volume respon hipersensitivitasmenggunakan uji pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakshmi, 2003; Ray, 1996).
a Kelompok I diberi suspensi CMCNa 0,5%sebagai kontrol pelarut.
b Kelompok II diberi suspensi fraksi n-heksan Daun Mahkota Dewa (FHDMD) dengan dosis 25 mg/kg bb.
c Kelompok III diberi FHDMD dengan dosis 50 mg/kg bb. d Kelompok IV diberi FHDMD dengan dosis 100 mg/kg bb.
e Kelompok V diberi suspensi levamisol dengan dosis 25 mg/kg bb sebagai kontrol positif.
Tiap kelompok diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS) 1%secara intraperitoneal pada hari ke-0. Kemudian pada hari berikutnya diberikan perlakuan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sendi kaki mencit sebelah kanan diberi tanda batas pengukuran volume kaki mencit.Volume kaki mencit diukur sebagai volume awal (V0).Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi (SDMS) 1% secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki mencit dengan plethysmometer digital. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton terlihat pada kenaikan skala pada plethysmometer sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
2.7 Uji Titer Antibodi
setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah masing-masing mencit diambil melalui pembuluh darah vena di bagian ekor. Sampel darah dikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan 1900 rpm dengan alat sentrifugasi selama 10 menit dan diambil serumnya.
Nilai titer atibodi ditentukan dengan metode hemaglutinasi. Duapuluh lima mikroliter (25 µl) serum diteteskan ke dalam lubang microtitration plate96
lubang, ditambahkan larutan PBS dengan volume yang sama, dan diencerkan dua kali lipat (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048) kemudian ditambahkan SDMS dengan volume yang sama dengan volume serum dan PBS. Kemudian diamati penggumpalan yang terjadi (Makare, et al., 2001; Puri, et al., 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir dimana antibodi masih terdeteksi melalui hemaglutinasi terlihat secara visual. Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1] (Hargono, 2000).
2.8 Analisis Data
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan fraksin-Heksan daun mahkota dewa yang sama dengan fraksi yang digunakan Amos P. Lumban Tobing pada Juni 2016. Hasil skrining fitokimia yang telah dilakukan Amos P. Lumban Tobing diperoleh bahwa serbuk simplisia dan fraksi n-Heksan memiliki kandungan senyawa kimia yang berbeda. Simplisia memiliki kandungan senyawa kimia alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, steroid dan triterpenoid. Sedangkan fraksi n-Heksan hanya memiliki kandungan steroid/triterpenoid. Hal ini disebabkan oleh pelarut n -Heksan bersifat non polar sehingga hanya dapat melarutkan senyawa metabolit skunder non polar (Harbone, 1987). Hasil pemeriksaan karakteristik diperoleh kadar air 7,2 %, kadar sari larut air 26,52 %, kadar sari larut etanol 55,98 %, kadar abu total 10,83 % dan kadar abu tidak larut asam 0,24 %.
3.1 Pengujian Efek Imunomodulator
yangdigunakan adalah levamisol dengan dosis 25 mg/kg bb. Dosis dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Razdan, et all., (2008).
Pengujian dilakukan dengan cara menginduksi sel imun mencit dengan sel darah merah sapi(SDMS)sebagai antigen secara intraperitoneal pada hari ke-0. Antigen yang telah diinduksikan ke dalam tubuh hewan coba mencit akan dikenal oleh sistem imun spesifik dengan membentuk sel B memori. Antigen akan merangsang sel B untuk berubah menjadi sel plasma dan mensekresi antibodi spesifik (Hendarsula,2011). Antibodi pertama yang terbentuk adalah Imunoglobulin M (IgM). Pada hari keenam dan hari ketujuh dalam serum mulai dapat dideteksi antibodi IgG (Srihidayati, et all., 2012). Pemberian sel darah merah sapi (SDMS) yang digunakan sebagai antigen pada mencit dimaksudkan untuk merangsang pembentukan antibodi spesifik. Pada pembuatan sel darah merah sapi (SDMS) digunakan PBS (Phosphate Buffered Saline) sebagai larutan pencuci dan larutahn pengencer. Pencucian sel darah merah sapi (SDMS) bertujuan untuk memperoleh sel darah merah sapi yang murni artinya tidak dicemari oleh protein serum (Kumala, et al., 2012).
digunakan disuspensikan dalamlarutan penyangga dengan pH ±7 (PBS) untuk menjaga agar sel darah merah tetap dalam kondisi pH netral, sehingga tetap bermuatan negatif.
Hemaglutinasi terbentuk karena adanya ikatan silang antara sel darah merah dengan antibodi. Antibodi yang mempunyai kemampuan lebih besar untuk berikatan dengan sel darah merah adalah IgM. IgM mempunyai ukuran yang besar dan valensi yang tinggi, sehingga dapat melawan rintangan elektrik dan membentuk ikatan silang dengan sel darah merah sehingga menyebabkan terjadinya aglutinasi. Antibodi lainnya seperti IgG mempunyai ukuran dan valensi yang lebih kecil, sehingga kemampuannya melawan rintangan elektrik lebih lemah dibandingkan dengan IgM (Kuby, 1994).
Tabel 4.1 Volume Pembengkakan Kaki Mencit dan Nilai Titer Antibodi(Rerata±SEM)
No Kelompok Perlakuan Volume kaki mencit (ml) 5 Suspensi Levamisol 25
mg/kg bb
0,5640±0,05758 3,7700±0,14697
3.1.1 Respon Hipersensitivitas
Pembengkakan terkait langsung dengan cell mediated immunity(CMI), karena antigen mengaktivasi sel T terutama sel Th1. Aktivasi sel T menyebabkan pelepasan beberapa sitokin yang bersifat proinflamasi. Sitokin tersebut akan menarik makrofag ke tempat terjadinya induksidan mengaktivasinya sehingga menyebabkan peningkatan aktivitas fagositik untuk melawan antigen yang masuk (Fulzele, et al.,2003). Penarikan makrofag inilah yang menyebabkan terjadinya pembengkakan. Semakin besar pembengkakan menunjukkan semakin tinggi respon hipersensitivitas sehingga dapat menggambarkan peningkatan aktivitas sistem imun.
Gambar 4.1 Volume pembengkakan kaki mencit pada berbagai perlakuan(Rerata±SEM). * = p < 0,05 dengan CMC-Na 0,5%, + = p < 0,05 dengan Levamisol 25 mg/kgbb.
Pada Gambar 4.1 dan Tabel 4.1 terlihat bahwa FHDMD dosis 25, 50 dan 100 mg/kg bb, dan suspensi levamisol dosis 25 mg/kg bb menunjukkan volume pembengkakan yang jauh berbeda dengan suspensi CMC 0,5% sebagai kontrol pelarut. FHDMD dosis 100 mg/kg bb dengan volume pembengkakan 0,728ml menunjukkan volume pembengkakan yang lebih besar dibandingkan dengan FHDMD dosis 25, 50 mg/kg bb dan suspensi levamisol 25 mg/kg bb yang masing-masing bernilai 0,256, 0,526 dan 0,564 ml. Untuk melihat ada tidaknya perbedaan dari setiap perlakuan pada tiap kelompok hewan coba, maka dilakukan analisis variansi (ANAVA) menggunakan program SPSS versi 17.0 terhadap volume pembengkakan kaki mencit. Hasil uji Anava menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan terhadap volume pembengkakan kaki mencit dengan nilai signifikansi (p < 0,05).
Untuk mengetahui kelompok perlakuan mana yang memiliki efek yang sama atau berbeda antara satu perlakuan dengan perlakuan yang lain dilakukan uji Post Hoc Tukey terhadap semua perlakuan dimana hasil uji tersebut dapat dilihat pada (lampiran 10).
Berdasarkan uji statistik menunjukkan bahwa volume pembengkakan kaki mencit kelompok perlakuan FHDMD dosis 25 mg/kg bb tidak berbeda signifikan dengan kontrol pelarut CMC Na 0,5%. FHDMD 50, 100 mg/kg bb dan suspensi Levamisol 25 mg/kg bb berbeda signifikan dengan kontrol pelarut CMC Na 0,5. Suspensi Levamisol tidak berbeda signifikan dengan FHDMD 100 mg/kg bb dan FHDMD 50 mg/kg bb, dan berbeda signifikan dengan FHDMD 25 mg/kg bb. FHDMD 100 mg/kg bb dan FHDMD 50 mg/kg bb berbeda signifikan dengan FHDMD 25 mg/kg bb.
Peningkatan volume pembengkakan kaki mencit merupakan gambaran adanya peningkatan respon hipersensitivitas mencit tersebut. Peningkatan respon ini mengindikasikan adanya peningkatan kemampuan sel imun mencit dalam menanggapi antigen terutama peningkatan respon imun spesifik selular. Sel yang berperan dalam respon imun selular adalah sel T terutama sel Th. Sel Th memproduksi IFN-y yang kemudian mengaktivasi makrofag (Kresno, 2010). Dengan demikian, fraksin-Heksan daun mahkota dewa menunjukkan efek stimulan terhadap sel T terutama sel Th.
3.1.2 Titer Antibodi
peningkatan titer antibodi mencit yang mengindikasikan peningkatan kepekaan sel T dan sel B terkait dengan produksi antibodi.
Efek pemberian FHDMD dan suspensi levamisol menunjukkan hasil yang tidak berbeda pada titer antibodi. Titer antibodi sel imun mencit dapat dilihat pada Gambar 4.2 dan Tabel 4.1
Gambar 4.2Titer Antibodi Sel Imun Mencit pada berbagai perlakuan
(Rerata±SEM). * = p < 0,05 dengan CMC-Na 0,5%,+ = p < 0,05 dengan Levamisol 25 mg/kgbb.
Pada Gambar 4.2 dan Tabel 4.1 terlihat bahwa FHDMD dosis 25, 50, dan 100 mg/kg bb menujukkan nilai titer antibodi yang jauh berbeda dengan CMC Na 0,5% sebagai kontrol pelarut. Pemberian FHDMD dosis 100 mg/kg bb menunjukkan peningkatan nilai titer antibodi senilai 5,69. Nilai ini lebih besar dibandingkan dengan FHDMD dosis 25, 50 mg/kg bb dan suspensi Levamisol 25 mg/kg bb yang bernilai 3,77, 4,85 dan 3,77.Untuk melihat ada atau tidaknya perbedaan dari setiap perlakuan pada tiap kelompok hewan percobaan, dilakukan
analisis uji Mann Whitneyterhadap titer antibodi. Hasil uji Mann Whitney menunjukkan adanya perbedaan yangsignifikan antara kelompok perlakuan terhadap titer antibodi sel imun, dengan nilai signifikansi (p < 0,05). Berdasarkan uraian di atas dapat disimpulkan bahwa pemberian FHDMD dosis 25, 50, dan 100 mg/kg bb memberikan efek peningkatan titer antibodi sel imun mencit.
Berdasarkan uji statistik menunjukkan bahwa nilai titer antibodi mencit kelompok perlakuan FHDMD dosis 25, 50, 100 mg/kg bb dan suspensi Levamisol 25 mg/kg bb berbeda signifikan dengan kontrol pelarut CMC Na 0,5. Suspensi Levamisol tidak berbeda signifikan dengan FHDMD25mg/kg bb. FHDMD 100 mg/kg bb berbeda signifikan dengan FHDMD 25mg/kg bb dan suspensi Levamisol 25 mg/kg bb. FHDMD 100 mg/kg bb tidak berbeda signifian dengan FHDMD 50 mg/kg bb.
Peningkatan titer antibodi terjadi karena peningkatan aktivitas sel Th, yaitu sel Th2 untuk menstimulasi produksi dan meningkatkan aktivitas sel B dalam pembentukkan antibodi (Roit,1989). Antibodi akan berikatan dengan antigen yang menginfeksi tubuh. Ikatan antigen dan antibodi memberikan gambaran adanya efek stimulasi fraksi n-Heksan daun mahkota dewa terhadap respon imun humoral yang berikatan dengan stimulasi.
tersebut, daun mahkota dewa dapat digunakan sebagai imunostimulator terkait dengan pengaruhnya dalam meningkatkan respon hipersensitivitas dan titer antibodi sel imun mencit.
Menurut wagner (1985), senyawa yang mempunyai bioaktifitas sebagai imunostimulan adalah golongan senyawa polisakarida, terpenoid, alkaloid, dan polifenol. Berdasarkan penelitian sebelumnya, penelitian Kumala, et all., (2012) menemukan bahwa ekstrak etanol Pegagang (Centella asiatica (I.) Urban.)mengandung senyawa alkaloid dan terpenoid yang bersifat imunostimulator. Maka dapat disimpulkan bahwa efek suatu bahan sangat erat kaitannya dengan senyawa kimia yang terkandung dalam bahan tersebut.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil dari penelitian ini, diperoleh kesimpulan bahwa :
a. Pemberian fraksin-Heksan daun mahkota dewa dapat mempengaruhi respon hipersensitivitas pada mencit jantan, pada dosis 100 mg/kg bb dan 50 mg/kg bb diperoleh volume pembengkakan rata-rata 0,728ml dan 0,526 ml sebanding dengan kontrol positif (levamisol) volume pembengkakan yang diperoleh 0,564ml.
b. Pemberian fraksin-Heksan daun mahkota dewa dapat mempengaruhi respon titer antibodi sel imun mencit jantan, pada dosis100 mg/kg bb dan 50 mg/kg bb diperoleh nilai titer antibodi rata-rata5,69 µl dan 4,85 µ l lebih tinggi dibandingkan kontrol positif (levamisol) nilai titer antibodi yang diperoleh 3,77 µ l.
c. Fraksin-Heksan daun mahkota dewa menunjukkan aktivitas imunomodulatorsebagai imunostimulan
4.2 Saran
