PERCOBAAN I SKRINING FITOKIMIA I. Tujuan Percobaan
a. Mengidentifikasi senyawa metabolit primer yang terkandung pada simplisia.
b. Mengidentifikasi simplisia secara cepat II. Teori dasar
Berbagai macam pendekatan dilakukan untuk mendapatkan produk bahan alam, dalam hal ini obat dari bahan alam yang memilki aktivitas biologis. Tujuan utama dari pencarian ini adalah untuk mendapatkan tanaman yang akan dikaji kandungan kimianya secara lebih mendalam. Pada dasarnya ada 2 metode untuk mendapatkan zat aktif secara bioligis dalam suatu tanaman yaitu dengan mencari zat aktif (senyawanya) ataupun dengan mencari efek biologis yang ditimbulkan oleh tumbuhan tersebut.
Salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan obat adalah penapis senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Cara ini digunakan untuk mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan golongannya. Sebagai informasi awal dalam mengetahui senyawa kimia apa yang mempunyai aktivitas biologi dari suatu tanaman. Informasi yang diperoleh dari pendekatan ini juga dapt digunakan untuk keperluan sumber bahan yang mempunyai nilai ekonomi lain seperti sumber tanin, minyak untuk industri, sumber gum, dll. Metode yang telah dikembangkan dapat mendeteksi adanya golongan senyawa alkaloid, flavonoid, senyawa fenolat, tannin, saponin, kumarin, quinon, steroid/terpenoid. (Teyler.V.E,1988)
1. Alkaloid
a. Pengertian alkaloid
Alkaloid merupakan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar. Pada umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik. Alkaloid seringkali
beracun bagi manusia dan banyak yang mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol yang digunakan secara luas dalam bidang pengobatan. Alkoloid biasanya tanpa warna, seringkali bersifat optis aktif, kebanyakan berbentuk kristal tetapi hanya sedikit yang berupa cairan ( misalnya nikotina pada suhu kamar ).
Prazat alkaloid yang paling umum adalah asam amino, meskipun sebenarnya biosintesis kebanyakan alkaloid lebih rumit. Secara kimia, alkaloid merupakan suatu golongan heterogen. Ia berkisar dari senyawa sederhana seperti koniina, yaitu alkaloid utama Conium maculatum sampai pentasiklik seperti estrikhnina yaitu racun kulit strychnos.
Alkoloid, sekitar 5500 telah di ketahui, merupaan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar. Tidak ada satu pun istilah alkoloid yang memuaskan tetapi pada umumnya alkoloid mencakup senyawa bersifat basa mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. Alkoloid sering kali beracun bagi manusia dan banyak yang mempunyai kegiatan fisiologi yang menonjol jadi digunakan secara luas dalam bidang pengobatan. Alkoloid biasanya tanpa warna, sering kali bersifat optis aktif, kebanyakan berbentuk kristal tetapi hanya sedikit yang berupa cairan (misalnya nikotina) pada suhu kamar . Uji sederhana tetapi yang sama sekali tidak satu sempurna, untuk alkoloid dalam daun atau buah segar adalah rasa pahitnya di lidah. Misalnya, alkoloid kinina adalah zat yang dikenal paling pahit dan pada konsentrasi molar 1x 103 membeikan rasa pahit yang berarti. Amina tumbuhan (misalnya meskalina) dan basa Purina dan pirimidina (misalnya kafeina) kadang-kadang digolongkan sebagai alkoloid dalam arti umum.
Banyak alkoloid bersifat terpenoid dan beberapa (misalnya solanina alkoloid – steroid kentang, Solanum tuberosum) sebaiknya ditinjau dari segi biosintesis sebagai terpenoid termodifikasi. Yang
lainnya terutama berupa senyawa aromatik ( misalnya kolkisin, alkoloid tropolon umbi crocus musim gugur ) yang mengandung gugus basa sebagai gugus rantai samping. Banyak sekali alkoloid yang khas pada suatu suku tumbuhan atau beberapa tumbuhan sekerabat. Jadi nama alkoloid sering kali diturunkan dari sumber tumbuhan penghasilnya, misalnya alkoloid atropa atau alkoloid tropana, dan sebagainya. (Harbrone.J.B,1987)
Sebagian besar alkaloid alami yang bersifat sedikit asam memberikan endapan dengan reaksi yang terjadi dengan reagent Mayer (Larutan Kalium Mercuri Iodida); reagent Wangner (larutan Iodida dalam Kalium Iodida); dengan larutan asam tanat, reagent Hager (saturasi dengan asam pikrat); atau dengan reagent Dragendroff (larutan Kalium Bismuth Iodida). Endapan ini berbentuk amorf atau terdiri dari kristal dari berbagai warna. Cream (Mayer), Kuning (Hager),coklat kemerah – merahan (Wagner dan Dragendroff). Caffein dan beberapa alkaloid tidak menimbulkan reaksi pengendapan. Ketelitian harus dimulai dari ekstraksi alkaloid yang diuji karena bahan akan membentuk endapan dengan protein. sebagian dari protein akan membuat tidak larut dari bahan yang telah diekstrak oleh proses epaporasi atau mungkin disebabkan filtrat yang terbongkar. Jika ekstrak asli telah dikonsentrasi ke konsentrasi rendah akan membentuk ekstrak alkaloid yang berbentuk basa dengan pertolongan suatu pelarut organik kemudian dimasukan dalam larutan asam encer (misalnya : Tartrat), larutan haus bebas dari protein dan siap untuk dilakukan uji alkaloid. (Teyler.V.E,1988)
b. Pereaksi Alkaloid
Untuk pereaksi Dragendrof dibuat dua larutan persediaan : (1) 0,6 g bismut subnitrat dalam 2 ml HCl pekat dan 10 ml air ; (2) 6 g Kalium iodida dalam 10 ml air. Larutan persediaan ini dicampur dengan 7 ml HCl pekat dan 15 ml air. Untuk menyemprot kertas dengan pereaksi
iodoplatinat, 10 ml larutan platina klorida 5% dicampur dengan 240 ml Kalium iodide 2% dan diencerkan dengan air sampai 500 ml. untuk menyemprot pelat, campurkan 10 ml platina klorida 5%, 5 ml HCl pekat, dan 240 ml Kalium iodide 2%. (Teyler.V.E,1988)
c. Klasifikasi alkaloid
Pada bagian yang memaparkan sejarah alkaloid, jelas kiranya bahwa alkaloid sebagai kelompok senyawa, tidak diperoleh definisi tunggal tentang alkaloid. Sistem klasifikasi yang diterima, menurut Hegnauer, alkaloid dikelompokkan sebagai:
1) Alkaloid Sesungguhnya
Alkaloid sesungguhnya adalah racun, senyawa tersebut menunjukkan aktivitas fisiologi yang luas, hampir tanpa terkecuali bersifat basa; lazim mengandung Nitrogen dalam cincin heterosiklik ; diturunkan dari asam amino ; biasanya terdapat “aturan” tersebut adalah kolkisin dan asam aristolokhat yang bersifat bukan basa dan tidak memiliki cincin heterosiklik dan alkaloid quartener, yang bersifat agak asam daripada bersifat basa.
2) Protoalkaloid
Protoalkaloid merupakan amin yang relatif sederhana dimana nitrogen dan asam amino tidak terdapat dalam cincin heterosiklik. Protoalkaloid diperoleh berdasarkan biosintesis dari asam amino yang bersifat basa. Pengertian ”amin biologis” sering digunakan untuk kelompok ini. Contoh, adalah meskalin, ephedin dan N,N-dimetiltriptamin.
3) Pseudoalkaloid
Pseudoalkaloid tidak diturunkan dari prekursor asam amino. Senyawa biasanya bersifat basa. Ada dua seri alkaloid yang penting
dalam khas ini, yaitu alkaloid steroidal (contoh: konessin dan purin (kaffein). (Teyler.V.E,1988)
2. Fenol
Senyawa asam fenolat ada hubungannya dengan lignin terikat sebagai ester atau terdapat pada daun di dalam fraksi yang tidak larut dalam etanol; atau mungkin terdapat dalam fraksi yang larut dalam etanol, yaitu sebagai glikosida sederhana. Deteksi asam fenolat dan lignin dalam jaringan tumbuhan Lignin ialah polimer fenol yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan, yang bersama selulosa, menyebabkan kekakuan dan kekokohan batang tumbuhan. Lignin terutama terdapat pada tumbuhan berkayu karena sampai 30% bahan organik pepohonan terdiri atas zat ini. Bila dioksidasi dengan nitrobenzene, lignin menghasilkan tiga aldehida fenol sederhana yang ada kaitannya dengan asam fenolat tumbuhan umum. (Harbrone.J.B,1987)
3. Tanin
Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae terdapat khusus dalam jaringan kayu. Menurut batasannya, tanin dapat bereaksi dengan protein membentuk kepolumer mantap yang tidak larut dalam air. Dalam industri, tanin adalah senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mampu mengubah kulit hewan yang mentah menjadi kulit siap pakai karena kemampuanya menyambung silang protein.
Di dalam tumbuhan letak tanin terpisah dari protein dan enzim sitoplasma, tetapi bila jaringan rusak, misalnya bila hewan memakanya, maka reaksi penyamakan dapat terjadi. Reaksi ini menyebabkan protein lebih sukar dicapai oleh cairan pencernaan hewan. Pada kenyataanya, sebagian besar tubuhan yang banyak bertanin dihindari oleh hewan pemakan tumbuhan karena rasanya yang
sepat. Kita menganggap salah satu fungsi utama tanin dalam tumbuhan ialah sebagai penolak hewan pemakan tumbuhan.
Secara kimia terdapat dua jenis utama tanin yang tersebar tidak merata dalam dunia tumbuhan. Tanin –terkondensasi hampir terdapat semesta di dalam paku-pakuan dan gimnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae, terutama pada jenis tumbuhan berkayu. Sebaliknya, tanin yang terhidrolisiskan penyebaranya terbatas pada tumbuhan berkeping dua. (Harbrone.J.B,1987)
4. Flavonoid
Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan. Disamping itu, sering terdapat campuran yang terdiri atas flavonoid yang berbeda kelas. Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan mula – mula didasarkan pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Kemudian diikuti dengan pemeriksaan ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis secara kromatografi. (Harbrone.J.B,1987)
5. Steroid dan Triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C 30 asiklik, yaitu skualena. Triterpenoid dapat dipilah menjadi sekurang – kurangnya empat golongan senyawa : triterpena sebenarnya, steroid, saponin dan glikosida jantung. Kedua golongan yang terakhir sebenarnya triterpena atau steroid yang terutama terdapat sebagai glikosida.
Sterol adalah triterpena yang kerangka dasarnya system cincin siklopentana perhidrofenantrena. Dahulu sterol terutama dianggap sebagai senyawa satwa (sebagai hormone kelamin, asam empedu, dll),
tetapi pada tahun – tahun terakhir ini makin banyak senyawa tersebut yang ditemukan dalam jaringan tumbuhan. (Harbrone.J.B,1987)
6. Kuinon
Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti kromofor pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon – karbon. Untuk tujuan identifikasi, kuinon dapat dipilah menjadi empat kelompok : benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon, dan kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidroklisasi dan bersifat senyawa fenol serta mungkin terdapat in vivo dalam bentuk gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol.
Untuk memastikan adanya suatu pigmen termasuk kuinon atau bukan, reaksi warna sederhan masih tetap berguna. Reaksi yang khas ialah reduksi bolak balik yang mengubah kuinon menjadi senyawa tanwarna, kemudian warna kembali lagi bila terjadi oksidasi oleh udara. (Harbone.J.B, 1987)
III. Alat dan Bahan Alat Percobaan: - Mortar - Tabung reaksi - Kertas saring - Penangas air - Gelas kimia - Cawan penguap Bahan Percobaan :
- Simplisia (Daun Imbaw) - Amoniak 25% - Kloroform - Asam Klorida 10% - Raksa Klorida P 2,266% b/v - Kalium Yodida P 50% b/v - Air - Bismut Nitrat P 40% - Asam Nitrat P - Serbuk Mg - Amilalkohol - NaOH 1 N - Larutan gelatin 1% - Pereaksi Steasny - Eter - Larutan vanillin 10% - Pereaksi Liebermann-Burcard - Pereaksi besi (III) klorida
IV. Prosedur Percobaan Alkaloid
Simplisia dimasukan kedalam mortar yang bersih, ditambahkan 5 ml amoniak 25%, kemudian digerus. Ditambahkan 20 ml CHCl3 dan
digerus kembali dengan kuat, disaring, diambil filtratnya (larutan 1). Sebagian larutan A dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan asam klorida 10% v/v, maka akan terbentuk 2 fase. Dipisahkan fase air larutan 2). Larutan 1 diteteskan pada kertas saring, lalu semprot dengan pereaksi Dragendorff. Terbentuknya warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukan adanya golongan senyawa alkaloid. Larutan 2 dibagi menjadi 2 bagian didalam tabung reaksi, tabung pertama ditambahkan pereaksi Dragendorff, dan tabung keddua ditambahkan pereaksi Mayer. Terbentuknya endapan mmerah bata dengan pereaksi Dragendorff atau endapan putih denga pereaksi Mayer menunjukkan adanya gologan senyawa alkaloida.
Dicampurkan 60 mL larutan Raksa Klorida P 2,266% b/v dan 10 mL larutan Kalium Yodida P 50% b/v, ditambahkan air secukupnya hingga 100 mL.
Pembuatan pereaksi Dragendorff:
Dicampur 20 mL larutan Bismut nitrat P 40% b/v dalam Asan Nitrat P dengan 50 mL larutan Kalium yodida P 54,4% b/v, didiamkan sampai memisah sempurna. Diambil arutan jernih dan diencerkan dengan air secukupnya.
Senyawa Polifenolat
Simplisia atau bahan uji ditempatkan pada tabung reaksi lalu ditambahkan air secukupnya. Lalu dipanaskan diatas penangas air dan disaring. Ke dalam filtrate ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida dan timbulnya warna hijau atau hijau, merah ungu, biru-hitam hingga biru-hitam menandakan positif fenolat atau timbul endapan coklat menandakan adanya polifenolat. Dibandingkan terhadap filtrate sebagai pembanding.
Flavonoid
1 g simplisia ditempatkan dalam gelas kimia, kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan dididihkan selama 10 menit. Campuran disaring, filtrate ditampung sebagai larutan A (yang nantinya akan digunakan untuk pemeriksaan golongan senyawa flavonoid, saponin, dan kuinon). 5 ml larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat. Campuran ditambahkan amilalkohol. Dikocok dengan kuat, dibiarkan sampai terjadi pemiahan. Terbentuknya warna dalam lapisan amilalkohol menunjukkan adanya golongan senyawa flavonoid. Dibandingkan terhadap filtrate sebagai blanko.
Saponin
5 ml larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi, kocok secara vertical selama 10 detik. Dibiarkan selama 10 menit. Terbentuknya busa 1 cm yang stabil didalam tabung reaksi menunjukkan adanya golongan senyawa saponin san busa tersebut masih bertahan(tidak hilang) setelah ditambahkan beberapa tetes asam klorida.
Kuinon
5 ml larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N. terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya golongan senyawa kuinon. Dibandingkan terhadap filtrate sebagai blanko.
Tannin
1 g simplisia ditambahkan 100 ml air panas, kemudian dididihkan selama 5 menit. Campuran didinginkan, kemudian disaring dan filtrate dibagi menjadi 3 bagian dalam tabung reaksi yang berbeda. Kedalam filtrate pertama: ditambahkan larutan besi (III) klorida 1%. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukan adanya senyawa golongan tannin. Kedalam filtrate 2: ditambahkan larutan gelatin 1%. Terbentuknya endapan putih menunjukan adanya senyawa golongan tannin. Kedalam filtrate ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi Steasny, lalu dipanaskan diatas penangas. Terbentuknya endapan merah muda menunjukkan adanya tannin katekat. Hasil uji filtrate ketiga disaring. Filtrate dijenuhkan dengan penambahan natrium aetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III) klorida 1%. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tannin galat. Pembuatan pereaksi Steasny:
2 bagian folmaldehid 30% dicampurkan dengan 1 bagian HCl pekat.
Monoterpena dan seskuiterpena
Simplisia atau bahan uji digerus dengan eter lalu disaring. Filtrate ditempatkan dalam cawan penguap dan dibiarkan meguap sampai kering. Ditambahkan larutan vanillin 10% dalam HCl pekat. Timbulnya warna-warna menandakan positif senyawa mono dan seskuiterpen.
Simplisia atau bahan uji digerus dengan eter lalu disaring. Filtrate ditempatkan dalam cawan penguap dan dibiarkan meguap
sampai kering. Ditambahkan larutan pereaksi Liebermann-Burchard. Terjadinya warna merah-ungu menandakan positif triterpenoid, sedangkan bila warna hijau-biru menunjukan positif steroid.
Pembuatan pereaksi Liebermann-Burchard:
1 ml asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 ml kloroform, lalu didinginkan pada suhu 0oC, lalu ditmbahkan 1 tetes HCl pekat.
V. Data Pengamatan dan perhitungan Perhitungan
Pembuatan Pereaksi Mayer Untuk 50 ml
HCl p 2,266 % 30 ml = 2,266/100 x 30 ml = 0,7 gram KI p 50 % 5 ml = 50/100 x 5 ml = 2,5 gram HCl 10 % ( 50 ml) V1 x N1 = V2 x N2 50 ml x 10 % = V2 x 37 % V2 = 500/37 = 13,51 ml ad 50 ml aquadest Pembuatan Pereaksi Dragendorff untuk 50 ml Bismuth Nitrat p 40 % 10 ml = 40/100 x 10 ml = 4 gr KI p 54,4 % 25 ml = 54,4/100 x 25 ml = 13,6 gr NaOH 1 N N = Gr/ Mr x 1000/v 1 = Gr/40 x 1000/50 Gr = 2 gr NaOH
Reagen Steasny 50 ml, 2 bagian dan 1 bagian Formaldehid = 2/3 x 50 ml = 33,3 ml HCl pekat = 1/3 x 50 ml = 16, 67 ml FeCl3 1 % = 1/100 x 50 = 0,5 gram ad aquadest 50 ml Vanilin Vanilin 10 % = 10/100 x 50 = 5 gram ad HCl 50 ml Gelatin 1 % = 1/100 x 50 = 0,5 g ad air panas 50 ml Hasil Pengamatan
Percobaan Hasil Pengamatan
menghasilkan warna kuning
Larutan 2 ditambahkan pereaksi Dragendorff tidak terbentuk endapan merah.
Larutan 2 ditambahkan pereaksi Mayer tidak terbentuk endapan putih.
Negatif alkaloid.
Negatif alkaloid.
Senyawa Polifenola t
Filtrate ditambahkan FeCl3
menghasilkan larutan berwarna hijau.
Positif fenolat.
Flavonoid Terbentuk warna pada lapisan amilalkohol.
Positif
flavonoid.
Saponin Larutan A ditambahkan HCl
menghasilkan busa yang menghilang.
Negatif saponin.
Kuinon Larutan A ditambahkan
NaOH menghasilkan larutan berwarna merah.
Positif kuinon.
Tanin Filtrate 1 menghasilkan
warna hijau kehitaman. Filtrate 2 menghasilkan kuning bening. Filtrate 3 menghasilkan endapan merah. Positif tannin. Negatif tannin katekat. Positif tannin galat. Monoterpena Menghasilkan warna hitam Positif
dan Seskuiter pena keunguan. Monoterpena dan Seskuiterpen a. Triterpena dan steroid
Menghasilkan warna hijau kebiruan.
Positif steroid.
VI. Pembahasan
Indonesia merupakan negara kepulauan yang terletak di zona khatulistiwa (tropik) dan terkenal mempunyai kekayaan alam dengan beranekaragam jenis tumbuhan, tetapi potensi ini belum seluruhnya dimanfaatkan sebagai bahan industri khususnya tumbuhan berkasiat obat. Masyarakat Indonesia secara turun-temurun telah memanfaatkan berbagai jenis tumbuhan untuk bahan obat tradisional baik sebagai tindakan pencegahan maupun pengobatan terhadap berbagai jenis penyakit. Pemanfaatan tumbuhan obat tradisional akan terus berlangsung terutama sebagai obat alternatif, hal ini terlihat pada masyarakat daerah yang sulit dijangkau oleh fasilitas kesehatan modern.
Penemuan berbagai senyawa obat baru dari bahan alam semakin memperjelas peran penting metabolit sekunder tanaman sebagai sumber bahan baku obat. Metabolit sekunder adalah senyawa hasil biogenesis dari metabolit primer. Umumnya dihasilkan oleh tumbuhan tingkat tinggi, yang bukan merupakan senyawa penentu kelangsungan hidup secara langsung, tetapi lebih sebagai hasil mekanisme pertahanan diri organisma. Aktivitas biologi tanaman
dipengaruhi oleh jenis metabolit sekunder yang terkandung didalamnya. Aktivitas biologi ditentukan pula oleh struktur kimia dari senyawa.
Uji fitokimia atau skrining fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai tumbuhan obat atau dalam hal pencarian senyawa aktif baru yang berasal dari bahan alam yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obat-obat baru dari senyawa aktif tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji sederhana tetapi mendapatkan hasil yang maksimal. Metode uji fitokimia yang banyak digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat dilakukan di lapangan atau di laboratorium.
Pada percobaan kali ini skrining fitokimia dilakukan pada daun imba. Daun imba mengandung senyawa-senyawa diantaranya adalah β-sitosterol, hyperoside, nimbolide, quercetin, quercitrin, rutin, azadirachtin, dan nimbine. Beberapa diantaranya diungkapkan memiliki aktivitas antikanker. Daun imba mengandung nimbin, nimbine, 6-desacetylbimbine, nimbolide dan quercetin . dimana imba digunakan untuk penyembuhan penyakit kulit, antiinflamasi, demam, antibakteri, antidiabees, penyakit kardiovaskular, dan insektisida (Mc. Daun imba juga di gunakan sebagai repelan, obat penyakit kulit, hipertensi, diabetes, anthelmintika, ulkus peptik, dan antifungsi. Selain itu bersifat antibakteri dan antiviral.
Skrining fitokimia pada daun imba dilakukan untuk melihat senyawa – senyawa yang terdapat didalam daun imba seperti alkaloid, polifenolat, flavonoid, saponin, kuinon, tanin, monoterpena, sesquiterpena, triterpenoid dan steroid. Pada uji alkaloid simplisia terlebih dahulu digerus didalam sampai halus tujuan dari penggerusan adalah untuk memperkecil ukuran simplisia agar banyak senyawa
kimia yang dapat keluar. Sebelum digerus simplisia terlebih dahulu ditambah amoniak yang kemudian digerus dan ditambah kloroform. Penambahan amoniak bertujuan untuk memisahkan alkaloid basa dari ikatan garamnya dengan asam organik sehingga alkaloid bebas dan dapat disari oleh pelarut organik (dibuat basa agar terekstraksi dalam pelarut organik), sedangkan kloroform untuk melarutkan alkaloid. Setelah proses penggerusan simplisia selesai kemudian disaring, penyaringan dilakukan untuk memisahkan antara filtrat dengan residu. Dimana filtrat yang akan diambil kemudian diidentifikasi apakah mengandung tanin. Filtrat 1 ditetesi pada kertas saring dan disemprot dengan pereaksi dragendorff, dimana pereaksi ini digunakan untuk melihat kandungan tanin didalam filtrat simplisia yang jika ada tanin ditunjukan dengan warna merah. Filtrat 1 ditambah HCl 10%, penambahan HCl bertujuan untuk menarik fase air. Saat ditambah hcl pada tabung reaksi terbentuk dua fase karena adanya perbedaan tingkat kepolaran antara fase air yang polar dan kloroform yang relative non polar. Garam alkaloid akan larut pada lapisan atas, sedangkan lapisan kloroform berada pada lapisan paling bawah karena memiliki massa jenis yang lebih besar. Fase air yang diambil akan dibagi menjadi dua bagian. Satu digunakan untuk direaksi dengan pereaksi mayer dan satu nya lagi direaksikan dengan perekasi dragendorff.
Pada pengujian senyawa polifenolat simplisia daun imba dicampur dengan air dan dipanaskan di penangas air. Pemansan dilakukan untuk meningkatkan kelarutan simplisia dalam air dan mempercepat reaksi senyawa yang ada dalam simplisia. Kemudian disaring untuk memisahkan antara filtrat dengan residu. Dimana filtrat ditambahkan besi (III) klorida untuk melihat senyawa polifenolat yang ditandai dengan perubahan warna hijau pada larutan
Uji flavonoid pada simplisia dilakukan dengan menambahkan air panas pada simplisia daun imba dan didihkan selama 10 menit yang
bertujuan un tuk mempercepat reaksi senyawa yang ada dalam simplisia. Kemudian disaring, filtrat yang diambil sebagai filtrat A yang akan digunakan untuk identifikasi pada flavonoid, saponin dan kuinon. Pada uji flavonoid filtrat dimasukan dalam tabung reaksi dan ditambahkan serbuk Mg dan HCl pekat. Penambahan serbuk Mg dan HCl pekat untuk mereduksi agar ikatan gula pecah. Setelah itu ditambah amil alkohol, amil alkohol dapat menarik aglikon dari senyawa flavonoid, dimana sebelumnya flavonoid dihidrolisa dengan HCl menjadi glikon dan aglikon.
Pada uji saponin, filtrat dikocok selama 10 detik dan didiamkan selama 10 menit. Pengocokan dilakukan untuk membantu pembentukan busa pada senyawa yang diuji. Setelah itu ditambahkan HCl untuk melihat apakah busa masih ada atau tidak setelah penambahan zat ini. Penambahan HCl dilakukan dalam jumlah yang sedikit karena apabila ditambahkan dalam jumlah yang banyak dapat menurunkan permukaan aktif sabun. Saponin bisa berbusa karena merupakan senyawa yang mempunyai sifat aktif permukaan. Gugusan dari saponin merupakan glikosid triterpenoid pentasiklis yang mempunyai gugusan glikon dan aglikon (aglikonnya adalah sapogenin).
Untuk identifikasi senyawa kuinon, filtrat dimasukan dalam tabung reaksi dan ditambahkan NaOH. PenambahanNaOH 1N untuk mengikat Na sebagai kuinon fenolat yang larut dalam air, sehingga lapisan berubah menjadi warna merah. Penambahan NaOH berfungsi untuk mendeprotonasi gugus fenol pada kuinon sehingga terbentuk ion enolat. Ion enolat tersebut akan mampu mengadakan resonansi antar elektron pada ikatan rangkap π, karena terjadinya resonansi ini ion enolat dapat menyerap cahaya tertentu dan memantulkan warna.
Ketika dilakukan uji untuk tanin. Pada simplisia dilakukan dengan menambahkan air panas pada simplisia daun imba dan didihkan selama 15 menit yang bertujuan un tuk mempercepat reaksi senyawa yang ada dalam simplisia. Kemudian disaring untuk mengambil filtratnya, filtrat dibagi menjadi tiga bagian. Filtrat 1 ditambah FeCl3 yang merupakan senyawa yang mengandung logam, sehingga apabila bereaksi dengan tanin maka Fe3+ akan tereduksi
menjadi Fe2+ dan akan membenruk senyawa kompleks kelat dengan
tanin sehingga menghasilka warna biru. Filtrat 2 ditambah gelatin yang bertujuan memebentuk endapan protein dan tanin. Filtat 3 ditambahkan pereaksi steasny untuk mengidentifikasi adanya tanin katekat yang kemudian dijenuhkan dengan natrium asetat dan besi ( III) klorida untuk melihat tanin galat.
Pada uji monoterpena dan sesquiterpena simplisia digerus dengan eter, yang bertujuan untuk menarik senyawa terpenoid pada simplisia. Proses penggerus harus dilakukan dengan cepat karena eter mudah menguap. Setelah itu disaring, filtrat yang diambil diuapkan pada cawan untuk menguapkan sisa senyawa eter dan air, setelah itu ditambahkan vanilin dan HCl pekat untuk mengidentifikasi seyawa monoterpenes dan sesquiterpenes.
Pada uji triterpenes dan steroid simplisia digerus dengan eter, yang bertujuan untuk menarik senyawa terpenoid pada simplisia. Proses penggerus harus dilakukan dengan cepat karena eter mudah menguap. Setelah itu disaring, filtrat yang diambil diuapkan pada cawan untuk menguapkan sisa senyawa eter dan air, setelah itu ditambahkan lieberman-burchard untuk identifikasi senyawa triterpenes dan steroid. Steroid adalah triterpena yan gkerangka dasarnya sistem cincin siklopentana perhidrofenantren. Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari 6 satuan isopren.
Dari percobaan yang dilakukan didapatkan hasil pengamatan bahwa didalam daun imba ketika direaksikan dengan pereaksi mayer dan pereaksi dragendorff tidak terdapat senyawa alkaloid. Sebenarnya, didalam daun imba terdapat senyawa alakloid berupa azadirachtin, salannin, nimbin, meliantriol, quertecin dan senyawa disulfide ( Ersi, 2013 ). Tidak terdeteksinya senyawa alkaloida pada simplisia imba bisa disebabkan oleh penggerusan yang tidak dilakukan secara homogen pada simplisia ketika akan diambil ekstraknya dan Pereaksi yang digunakan kemungkinan sudah kadaluarsa.
Adapun mekanisme reaksi yang terjadi antara pereaksi mayer dan pereaksi dragendorff sehingga dapat membentuk endapan pada deteksi senyawa alakloida adalah sebagai berikut :
Pereaksi Mayer
HgCl2 + 2KI HgI2 + KCl
KI + HgI2 K2HgI4 ( endapan putih ) Pereaksi dragendorff
4KI + Bi(NO)3 BiI4 ( endapan merah ) ( Fessenden, 1999)
Ketika dilakukan pengamatan untuk senyawa polifenol, daun imba memang positif mengandung senyawa polifenol, senyawa golongan polifenol pada daun imba adalah antarkinon. Adapun mekanisme reaksi antara polifenol dengan FeCl3 adalah sebagai berikut :
OH + FeCl3 OH ( hijau) Cl3
Daun mimba ketika dilakukan pengamatan terhadap senyawa flavonoid, positif mengandung senyawa flavonoid. Adapun senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun imba adalah kuersetin. Adapun mekanisme yang terjadi pada percobaan uji flavonoid adalah sebagai berikut :
( Fessenden,1999).
Ketika dilakukan uji saponin pada daun imba, ternayta didalam daun imba tidak mengandung saponin karena tidak terbentuk busa yang tingginya 1 cm setelah dilakukan pengocokan dan didiamkan 10 menit setelah itu diberikan HCl. Jika suatu tumbuhan mengandung kada saponin yang tinggi maka tumbuhan tersebut tidak baik untuk dikonsumsi oleh manusia, karena saponin dapat menghemolisis darah. Mekanisme reaksi :
Pada uji terhadap kuinon, daun imba positif mengandung senyawa kuinon dengan terbentuknya larutan bewarna merah ketika diuji dengan NaOH. Menurut literatur , didalam daun imba memang mengandung senyawa kuinon ( Ersi,2013). Kuinon merupakan senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti kromofor pada benzakuionon yang terdiri dari 2 gugus karbonil yang
berkonjugaasi dengan R ikatan rangkap karbon. Adapun reaksinya adalah sebagai berikut :
( Markham, 1988)
Uji tanin bertujuan untuk adanya tanin dalam simplisia daun imba. Tanin merupakan senyawa yang mengandung gugus hidroksi (turunan benzena) yang dapat larut dalam air karena adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil yang dimiliki tanin dengan molekul air. Oleh karena itu penentuan tanin pada daun dilakukan dengan penambahan air pada daun imba kemudian didihkan. Tanin yang bersifat polar akan larut dalam air yang bersifat polar, hal ini sesuai dengan prinsip “like dissolve like”. Kelarutan tanin yang tinggi terjadi dalam keadaan panas karena alasan inilah maka dilakukan proses pendidihan agar tanin yang terlarut semakin banyak. Selain itu proses pendidihan juga berfungsi untuk memecah ikatan-ikatan pada tanin sehingga dihasilkan bentuk monomer-monomer tanin bebas. Kemudian dilakukan pendinginan untuk mengendapkan senyawa-senyawa pengotor yang tidak larut pada suhu rendah, misalnya saponin. Selanjutnya adalah penyaringan yang bertujuan untuk memisahkan tanin dari simplisia dan senyawa lain yang terkandung didalamnya seperti alkaloid, steroid, flavonoid. Larutan/filttrat dibagi menjadi 3 bagian.
Filtrat pertama ditambahkan FeCl3 1%. Penambahan FeCl3 berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tanin merupakan ligan yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks yang stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat
Fe3+ dengan ligan tanin. Uji positif yaitu terbentuk larutan berwarna cokelat kehitaman.
Dari percobaan menunjukan hasil negatif karena larutan tetap berwarna hijau kehitaman. Hal ini menunjukan bahwa didalam imba tidak mengandung tanin, hal ini mungkin disebabkan karena masih terkandung zat pengotor/air pada lapisan kencur.
Filtrat kedua ditambahkan dengan gelatin dan pereaksi steasny, untuk mengujji keberadaan tanin katekat. Tanin katekat merupakan kelompok tanin yang tidak dapat terhidrolisis dan merupakan polimer kondensasi katekin. Uji positif adalah terbentuk endapan putih. Pada perobaan ini, setelah larutan ekstrak ditambahkan gelatin tidak terjadi perubahan apa-apa, yaitu larutan tetap berwarna kuning bening. Penambahan gelatin berfungsi untuk menunjukan adanya keberadaan tanin tertentu yaitu tanin katekat. Kemudian ditambahkan pereaksi steasny. Pereaksi steasny akan menunjukan keberadaan tanin katekat tanpa tanin dibentuk terlebih dahulu menjadi senyawa kompleks dengan Fe3+ tetapi dalam percobaan ini menunjukan uji negatif karena larutan tetap berwarna kuning bening. Hal ini menunjukan bahwa didalam kencur tidak mengandung tanin katekat, hal ini mungkin disebabkan karena masih terkandung zat pengotor/air pada lapisan kencur.
Filtrat ketiga, ditambahkan dengan Na-asetat dan FeCl3 untuk mengetahui keberadaan tanin galat pada simplisia imba. Tanin galat merupakan kelompok tanin yang dapat terhidrolisis menghasilkan asam galat. Uji positif adalah terbentuk warna biru tinta pada larutan tersebut. Penambahan Na-asetat bertujuan untuk mengikat molekul air sehingga larutan menjadi lebih jenuh dan dilanjutkan dengan penambahan FeCl3 untuk membentuk kompleks dengan atom pusat Fe3+dari FeCl3 dan ligan tanin. Hasil percobaan ini menunjukan uji
negatif karena endapan merah yang terbentuk. Hal ini menunjukan bahwa didalam daun imba tidak mengandung tanin galat.
Pada pengujian senyawa monoterpene dan sesquiterpene, pada daun imba negatif mengandung senyawa monoterpene dan sesquiterpene yang ditandai dengan terbentuknya warna hitam keunguan. Hal ini bisa terjadi karena masih ada zat pengotor yang tekandung didalam simplisia.
Pada uji triterpenes dan steroid pada daun imba juga imba juga negatif mengandung senyawa diatas. Karena warna yang terbentuk adalah hijau kebiruan bukan warna ungu merah.
VII. Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan, dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Didalam simplisia daun imba hanya mengandung senyawa metabolit sekunder seperti polifenolat, flavonoid, kuinon. 2. Didalam simplisia daun imba tidak mengandung senyawa
alkaloid, saponin, tanin, monoterpene, sesquiterpene, triterpene dan steroid.
3. Tidak terdeteksinya senyawa senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, saponin, tanin, monoterpene, sesquiterpene, triterpene dan saponin bisa disebabkan oleh adanya zat pengotor yang masih terkandung walauypun telah dilakukan pemanasan, reagent yang sudan kadaluarsa, dan proses penggerusan yang kurang homogen.
VIII. Daftar Pustaka
Fessenden. 1999. Kimia Organik. Jakarta : Erlangga
Harborne. J.B.,1987. Metode Fitokimia , terjemahan K. Radmawinata dan I. Soediso, 69-94, 142-158, 234-238. Bandung : ITB Press
Herliana, Ersi. 2013. Diabetes Kandas Berkat Herbal. Jakarta: Gramedia.
Markham. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : ITB Press.
Teyler.V.E.et.al.1988.Pharmacognosy Edition 9th. 187 – 188. Phiadelphia : Lea & Febiger
LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOLOGI -TOKSIKOLOGI I PERCOBAAN 1
PENANGANAN HEWAN PERCOBAAN DAN KONVERSI DOSIS
