3 METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian meliputi isolasi bakteri endofit, identifikasi bakteri endofit terseleksi berdasarkan sekuen 16S rDNA, uji antimikrob bakteri teridentifikasi serta uji toksisitas bakteri endofit terpilih menggunakan embrio ikan zebra (Gambar 3).
Gambar 3 Diagram alur penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai April 2014 di Laboratorium Biosistematika dan Kultur Koleksi Mikrob, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kunyit putih (C. zedoaria), media Nutrient Agar (NA), media Water Yeast Extract Agar
Isolasi Bakteri Endofit
Seleksi Bakteri Endofit Berdasar Karakteristik Morfologi Koloni
Uji Potensi Bakteri Endofit Terpilih dalam Menghasilkan Senyawa Toksik Menggunakan
Embrio Ikan Zebra Identifikasi Bakteri Endofit Berdasar Analisis 16S rDNA
Isolat Bakteri Endofit Teridentifikasi
Uji Aktivitas Antimikrob Bakteri Endofit Teridentifikasi
(WYEA) (Lampiran 1), media Nutrient Broth (NB), media Potato Dextrose Agar
(PDA), media Potato Dextrose Broth (PDB), etanol 70%, larutan natrium hipoklorit, Gotaq Green Master Mix, bahan-bahan PCR, dan embrio ikan zebra. Alat-alat yang digunakan antara lain inkubator, micropippet, mesin PCR, alat elektroforesis, UV transilluminator, spektrofotometer, sentrifugasi, evaporator, mikroskop, plate multiwell, serta alat-alat gelas.
Sampel Tanaman
Tanaman kunyit putih (C. zedoaria) diambil dari tiga lokasi yang berbeda. Sampel tanaman diambil dari kebun pribadi di Bojong Gede (BG), kebun percobaan Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, (CBN), dan kebun koleksi tanaman obat, Pusat Penelitian Biofarmaka, IPB, Dramaga (DRMG) (Tabel 2). Masing-masing sampel diambil tiga tanaman. Sampel tanaman diambil pada bulan November 2012–April 2013. Tanaman yang diambil adalah tanaman sehat bebas kontaminasi patogen tanaman. Sampel selanjutnya dibawa ke laboratorium dan dalam waktu 24 jam sampel sudah diisolasi. Sampel tanaman diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI. Identifikasi dilakukan berdasarkan karakteristik morfologi dengan mengacu pada buku identifikasi tanaman ‘Flora of Java’ (Backer dan van den Brink 1968) dan membandingkan dengan spesimen herbarium yang terdapat di Herbarium Bogoriense.
Tabel 2 Lokasi sampel tanaman kunyit putih (C. zedoaria)
Asal tanaman Lokasi tanaman Umur tanaman Bagian tanaman Balitro Bojong Gede 11 bulan Seluruh bagian Rimbo Panti, Padang LIPI Cibinong 8 bulan Seluruh bagian Cimas, Sukabumi IPB Dramaga 12 bulan Seluruh bagian
Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih
Sterilisasi Permukaan Jaringan Tanaman Kunyit Putih
Sampel tanaman (rimpang, batang, dan daun) dibersihkan dari kotoran dengan cara dicuci dengan air mengalir selama 5–10 menit. Tanaman dipotong-potong dan direndam dalam larutan etanol 70% selama 3 menit. Potongan tanaman direndam kembali dengan larutan natrium hipoklorit 3% selama 5 menit, dibilas dengan etanol 70% selama 30 detik, dan dilanjutkan dengan akuades steril selama 2 menit. Pencucian dengan akuades steril diulang selama tiga kali. Potongan sampel kemudian dikeringkan menggunakan kertas tisu steril. Efisiensi sterilisasi permukaan diuji dengan menyebar 100 µL akuades hasil pencucian terakhir pada beberapa jenis media yang sudah ditambah sikloheksamida 50 µg/mL untuk menghambat pertumbuhan cendawan. Media yang digunakan adalah NA, NA dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (NAT), WYEA, WYEA dengan 2% ekstrak tanaman kunyit putih (WYEAT). Akuades hasil pencucian yang menunjukkan adanya pertumbuhan mikrob tidak dapat digunakan sebagai sampel isolasi bakteri endofit.
Isolasi Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit dilakukan dengan metode plant piece untuk potongan sampel dan metode spread plate untuk sampel yang dihaluskan. Sampel yang telah steril, bagian rimpang, batang dan daun dipotong menjadi potongan-potongan kecil (4–6 mm). Sampel kemudian diletakkan di atas media yang telah ditambah sikloheksamida 50 µg/mL. Cawan Petri selanjutnya diinkubasi selama 2–15 hari pada suhu 28 oC (Araujo et al. 2002). Isolasi menggunakan metode
spread plate dilakukan dengan sampel dihaluskan terlebih dahulu menggunakan mortar steril. Sebanyak 1 g sampel yang sudah dihaluskan dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 mL akuades steril, kemudian dilakukan pengenceran secara berseri. Sebanyak 100 µL dari pengenceran 10-1 dan 10-2 disebar di atas permukaan media. Media selanjutnya diinkubasi selama 2–15 hari pada suhu 28 o
C. Koloni bakteri yang tumbuh dari metode spread plate dihitung dan data populasi ditransformasikan dalam nilai log (CFU per gram sampel). Bakteri yang tumbuh dari metode spread plate dan plant piece diisolasi dan dipurifikasi. Selanjutnya bakteri endofit yang memiliki karakteristik morfologi berbeda dipilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Karakteristik morfologi yang diamati adalah warna, tepian, permukaan dan juga penentuan sifat Gram menggunakan uji KOH. Interpretasi uji KOH yaitu bakteri merupakan Gram negatif apabila campuran sel dengan larutan KOH 3% berubah menjadi kental dan berlendir, Gram positif apabila campuran sel dan larutan KOH 3% tidak berubah menjadi kental dan berlendir setelah satu menit (Powers 1995).
Pemurnian Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit Putih
Koloni bakteri yang telah tumbuh dimurnikan pada media NA dengan digores berdasarkan metode kuadran. Pemurnian dilakukan beberapa kali sampai diperoleh koloni tunggal. Koloni yang telah murni selanjutnya ditanam dalam tabung reaksi yang berisi agar miring NA dan disimpan pada suhu 4 oC. Isolat murni selanjutnya dipelihara dengan baik dan digunakan pada uji selanjutnya.
Penyimpanan Bakteri Endofit dari Tanaman Kunyit
Bakteri endofit yang sudah murni disimpan dalam media NA miring. penyimpanan jangka panjang dilakukan dalam bentuk gliserol 10% kemudian disimpan dalam suhu –80 oC.
Identifikasi berdasar sekuen 16S rDNA
Isolasi DNA Bakteri Endofit
Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode PCR koloni (Packeiser et al. 2013). Sel dari koloni tunggal pada permukaan media padat diambil menggunakan tusuk gigi steril dan disuspensikan ke dalam 50 µL air bebas nuklease. Lisis sel dilakukan dengan suspensi divortex selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 98 oC selama 5 menit. Lisat selanjutnya di spin down untuk memisahkan supernatan dan debris sel. Supernatan diambil dan digunakan sebagai cetakan DNA pada amplifikasi PCR.
Amplifikasi PCR 16S rDNA
Amplifikasi fragmen 16S rDNA dilakukan menggunakan GoTaq (Promega) dengan primer 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) (Palaniappan et al. 2010). Komposisi amplifikasi fragmen 16S rDNA terdiri dari 9.75 µL Ultrapure water, 12.5 µL GoTaq Green Master Mix 2x, 0.625 µL primer 27F (10 µM), 0.625 µL primer 1492R (10 µM), 0.5 µL DMSO, dan 1 µL sampel DNA dengan total volume 25 µL. Amplifikasi dilakukan dengan kondisi PCR: denaturasi awal 95C selama 90 detik, dilanjutkan (95 C, 30 detik denaturasi; 50 o
C, 30 detik annealing; 72 oC, 90 detik pemanjangan) selama 30 siklus dan final extension pada 72 oC selama 5 menit, 4 oC selama 20 menit.
Elektroforesis
Sebanyak 3 μl dari produk PCR dianalisis menggunakan gel agarosa 1% dengan aliran listrik bertegangan 100 V selama 25 menit. Setelah selesai, gel direndam dalam larutan ethidium bromide 5 µg/mL selama 30 menit dan dibilas menggunakan bufer TAE 1x. Hasil elektroforesis dilihat menggunakan alat UV
transilluminator. DNA dikatakan teramplifikasi apabila pada hasil elektroforesis diperoleh 1 pita tunggal berukuran 1500 pb.
Sekuensing 16S rDNA, Analisis Bioinformatika dan Konstruksi Pohon Filogenetik
Produk PCR disekuensing secara parsial menggunakan primer 27F di Laboratorium Macrogen Korea menggunakan automated DNA sequencer (ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Data hasil sekuensing selanjutnya diolah dengan program Bioedit. Homologi sekuen 16S rDNA dicari menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide
(BLASTN) pada website National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Sekuen referensi diperoleh dari bank data DNA NCBI secara online melalui internet www.ncbi.nlm.nih.gov. Konstruksi pohon filogenetik dianalisis dengan metode neighbor-joining (Saitou & Nei 1987) yang terimplementasi dalam program MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011) dan nilai bootstrap 1000x.
Bioassay Antimikrob
Persiapan Seed Culture
Mikrob uji yang digunakan adalah B. subtilis InaCCB1, P. aeruginosa
InaCCB3, S. aureus InaCCB4, E. coli InaCCB5, C. albicans InaCCY116, dan
S. cerevisiae InaCCY728. Seed culture mikrob uji dibuat dengan menginokulasikan 1 ose mikrob uji pada media cair. B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, E. coli diinokulasi pada media NB, sedangkan C. albicans dan
S. cerevisiae diinokulasi pada media PDB. Bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC dan yeast diinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jam.
Pembuatan Media Bioassay
Media yang digunakan untuk uji antimikrob adalah media dua lapis terdiri atas 20 mL lapisan bawah dan 4 mL lapisan atas. Bioassay terhadap bakteri menggunakan media NA, dan bioassay terhadap yeast menggunakan media PDA.
Komposisi media lapisan atas sama dengan komposisi media lapisan bawah tetapi dengan konsentrasi bacto agar lapisan atas adalah setengah dari konsentrasi bacto agar lapisan bawah. Seed culture ditumbuhkan pada media NB selama 20 jam. Pada jam ke-20, dilakukan pemeriksaan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm untuk bakteri dan 530 nm untuk yeast. Konsentrasi bakteri dan yeast yang digunakan adalah 106 dan 105 CFU/ml. Setelah diperoleh konsentrasi yang diinginkan, seed culture ditambahkan pada media lapisan atas sebelum media tersebut dituangkan ke permukaaan cawan Petri.
Uji Antimikrob
Uji antimikrob dilakukan berdasarkan metode antagonisme langsung. Bakteri endofit terlebih dahulu ditumbuhkan pada media NA selama 5 hari. Bakteri endofit pada media agar selanjutnya dibuat dalam bentuk lempengan bulat menggunakan sedotan steril. Lempengan kemudian diletakkan di atas permukaan media bioassay. Cawan Petri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk bakteri, dan suhu 30 oC selama 48 jam untuk yeast. Zona hambat yang terbentuk diamati pada jam ke-24 dan 48. Uji antimikrob masing-masing bakteri endofit dilakukan tiga pengulangan. Kriteria kekuatan daya hambat bakteri yang digunakan adalah sangat kuat (zona hambat >20 mm), kuat (zona hambat10–20 mm), sedang (zona bening 5–10 mm), lemah (<5 mm) (Davis dan Stout 1971).
Produksi Filtrat Kultur Bakteri Endofit dan Ekstraksi Senyawa Aktif
Produksi filtrat dilakukan pada empat bakteri endofit terseleksi yaitu bakteri endofit yang mampu menghambat pertumbuhan lebih dari satu mikrob patogen dan memiliki ukuran daya hambat yang besar (>10 mm). Satu ose penuh biakan bakteri endofit diinokulasikan ke dalam 5 mL media NB dan diinkubasi selama 24 jam. Kultur bakteri yang sudah berumur 24 jam diinokulasikan ke dalam 100 mL media NB dan diinkubasi pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm suhu 28 oC selama 5 hari. Kultur kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Supernatan yang diperoleh selanjutnya diekstrak menggunakan pelarut organik etil asetat (Arunachalam dan Gayathri 2010). Etil asetat kemudian dievaporasi menggunakan evaporator suhu 40 oC. Ekstrak kering yang diperoleh ditimbang dan dilarutkan dalam akuades apabila akan digunakan.
Uji Toksisitas Akut Ekstrak Terhadap Embrio Ikan Zebra
Uji Toksisitas
Larutan fase ekstrak etil asetat dan fase air dibuat dalam konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 ppm. Satu telur embrio ikan zebra dalam 150 µL air tawar dan 150 µL ekstrak dimasukkan ke dalam plate multiwell. Satu ulangan dibuat dalam lima sumur dan ulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dan diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang (Lampiran 2).
Pengamatan Embrio Ikan Zebra
Embrio ikan zebra yang telah terpapar dengan ekstrak aktif selama 72 jam diamati morfologinya setiap 24 jam inkubasi menggunakan mikroskop stereo.
Bagian organ larva ikan zebra yang diamati meliputi sumbu tubuh, panjang tubuh, pigmentasi, kantong kuning telur, jantung, warna mata, telinga, dan sirkulasi darah (Kumar et al. 2013)
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Identitas Sampel Tanaman Kunyit Putih
Identifikasi sampel tanaman dilakukan untuk mengkonfirmasi kembali kebenaran dari identitas sampel yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diamati antara lain warna rimpang, bentuk rimpang, aroma rimpang, bentuk daun, dan warna tulang tengah daun. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ketiga sampel tanaman tersebut adalah C. zedoaria (Christm.) Roscoe, yang termasuk dalam genus Curcuma dalam famili Zingiberaceae (Tabel 3).
Tabel 3 Hasil identifikasi sampel tanaman kunyit putih di Herbarium Bogoriense
Lokasi sampel Nama koleksi Famili Species
Bojong Gede Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe
LIPI, Cibinong Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe
IPB, Dramaga Kunyit Putih Zingiberaceae Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe
Kelimpahan Bakteri Endofit
Isolasi bakteri endofit dilakukan dari tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi tanam yang berbeda berdasarkan metode sterilisasi permukaan. Metode sterilisasi permukaan yang digunakan pada penelitian ini dikatakan berhasil karena tidak ada pertumbuhan mikrob pada cawan Petri kontrol. Hasil isolasi menunjukkan bahwa bakteri endofit ditemukan pada semua bagian tanaman kunyit putih meliputi bagian rimpang, batang dan daun. Keberadaan bakteri endofit ditemukan hampir pada semua bagian tanaman inang termasuk akar, batang, daun, biji, buah, umbi, dan juga dalam nodul tanaman legum (Sturz et al.
1997; Jalgaonwala dan Mahajan 2011). Struktur populasi bakteri endofit pada suatu tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya rotasi tanaman, kondisi tanah, umur tanaman, musim ketika dilakukan isolasi, jaringan tanaman, dan keberadaan patogen tanaman.
Populasi bakteri endofit berbeda antar lokasi, umur, bagian tanaman (rimpang, batang, daun), dan hal ini juga dipengaruhi oleh jenis media isolasi yang digunakan. Tiga sampel tanaman kunyit putih yang diambil dari lokasi berbeda diisolasi menggunakan empat macam media dan dua jenis metode menunjukkan kelimpahan bakteri endofit yang berbeda. Sampel tanaman dari CBN menunjukkan kelimpahan bakteri 3 log (CFU/g) sampel, sampel dari BG adalah berkisar 2 sampai 3 log (CFU/g) sampel, dan sampel dari DRMG adalah 3 sampai 4 log (CFU/g) sampel (Gambar 4).
