3. METODE PENELITIAN
3.1 Bahan dan AlatDalam pengambilan sampel, bahan dan alat yang diperlukan yaitu media transport berupa Brain Heart Infusion (BHI) dalam tabung berukuran 2 ml, sampel usap steril, syringe, kapas dan alkohol 70%.
Peralatan yang diperlukan selama pemerikasaan di laboratorium yaitu biosafety cabinet (BSC), vortex, sentrifus, mikropipet, tips, alkohol, desinfektan, plat ekstraksi 96 sumuran, plat mikrotirasi 96 sumuran berdasar V, kulkas, freezer -20oC dan freezer -80oC.
Pemeriksaan sampel dilakukan menggunakan real time RT-PCR dan uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI). Isolasi RNA virus dilakukan menggunakan MagMAXTM AI/ND Viral RNA Isolation kit dari Ambion®, plat ekstraksi 96 sumuran, dan magnetic stand. Alat dan Bahan untuk pengujian real time RT-PCR yaitu Ag-Path IDTM One-Step RT-PCR kit dari Ambion® dengan plat optik 96 sumuran pada mesin Applied Biosystem 7500 Real Time PCR System.
Pada pengujian HI diperlukan larutan phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2, red blood cell (RBC) ayam, plat mikrotitrasi 96 sumuran berdasar V, plat sentrifus, kontrol serum positif (A/Legok/SGT/1/2004 (H5N1) dari PT IPB-Shigeta Animal Pharmaceuticals dan A/Ck/West Java/PWT-Wij/2006 (H5N1) dari Balai Besar Penelitian dan Veteriner, Bogor) serta antigen H5 standar (A/Legok/IPB-SGT/1/2004 (H5N1) dari PT IPB-Shigeta Animal Pharmaceuticals dan A/Ck/West Java/PWT-Wij/2006 (H5N1) dari Balai Besar Penelitian dan Veteriner, Bogor).
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel untuk dianalisa pada penelitian ini dilaksanakan di Pasar Burung Pramuka, Jakarta secara cross-sectional pada bulan April sampai dengan September 2011. Pemeriksaan sampel dilaksanakan di Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor (IPB) pada bulan Oktober 2011 sampai dengan Juni 2012.
3.3 Desain Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan terhadap 30 kios secara cross sectional setiap bulannya di Pasar Burung Pramuka, Jakarta. Kios dipilih secara acak. Pengambilan sampel dilakukan satu bulan satu kali selama 6 bulan berturut-turut sebanyak 5 sampel/kios/bulan (Gambar 3). Sampel yang akan diambil langsung di lokasi yaitu feses, usap kloakal dan usap orofaringal/trakeal. Dari beberapa kios yang diambil sampel dibeli minimal satu ekor unggas yang selanjutnya diambil sampel usap orofaringeal/trakeal, kloakal dan darah. Jumlah unggas yang dibeli setiap bulan adalah 30 ekor. Spesies unggas yang dibeli bervariasi.
Sampel usap orofaringeal/trakeal, kloakal dan fekal diambil menggunakan tip steril berbahan polyester dan disimpan di dalam tabung berisi Brain Heart Infusion (BHI) sesuai metode oleh National Veterinary Services Laboratories (NVSL) (Killian 2008). Protein di dalam media transport virus dapat mencegah degradasi virus hidup selama penanganan dan transportasi ke laboratorium. Sampel darah dari unggas yang dibeli disimpan di dalam syringe sebelum dibawa ke laboratorium. Semua sampel diberi kode berdasarkan waktu pengambilan sampel, pedagang, jenis sampel dan spesies unggas (Whitworth et al. 2007). Identifikasi unggas dilakukan berdasarkan informasi pedagang yang dicocokkan dengan metode identifikasi burung menurut MacKinnnon (1991), Gosler (2007), dan informasi dari internet.
Sampel disimpan pada suhu ± 4oC selama proses transportasi. Setelah tiba di laboratorium, sampel usap disimpan pada suhu di bawah -70oC sedangkan serum disimpan pada suhu -20oC (WHO 2007, OIE 2009).
Gambar 3 Desain Penelitian.
Keterangan: F: fekal, K: usap kloakal, O: usap
orofaringel, HI: Uji Hemaglutinasi Inhibisi, rRT-PCR: real time reverse transcriptase polymerase chain reaction.
3.3.2 Pengumpulan Data Epidemiologis
Responden yang diwawancara untuk mengumpulkan data epidemiologis merupakan pedagang pemilik/penjaga kios yang pernah diambil sampel. Komponen yang ditanyakan dalam wawancara menyangkut jumlah dan spesies
unggas yang masuk dan dijual, asal unggas, cara memperoleh unggas (dari penangkaran/tangkapan), dan lama unggas dipelihara oleh pedagang.
Sumber data cuaca diperoleh dari Bagian Database Badan Meteorologi, Klimatologi, dan Geofisika (BMKG) Republik Indonesia. Adapun data cuaca yang dikaji yaitu rataan suhu bulanan, rataan kelembapan bulanan, dan rataan curah hujan bulanan yang dikoleksi oleh stasiun Priok, Jakarta.
3.3.3 Pemeriksaan Laboratorium
Sampel usap kloakal, orofaringeal dan fekal akan diuji terhadap keberadaan matriks dan H5 virus Avian Influenza (VAI) dengan menggunakan teknik real time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR). Sampel serum akan diperiksa menggunakan uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI) untuk mengetahui keberadaan antibodi terhadap VAI H5. Pemeriksaan dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
3.3.3.1 Pooling
Sampel usap dikelompokkan berdasarkan jenis sampel (sampel usap kloakal, usap orofaringeal dan fekal) dan pedagang. Setiap kelompok/pool berisi maksimal 5 sampel (NVSL 2008) dimana dari setiap sampel diambil 100 µl selanjutnya dihomogenkan dengan vorteks. Setiap pool diperiksa menggunakan uji tapis terhadap keberadaan Matriks VAI. Apabila terdapat pool yang positif Matriks VAI, maka dilakukan pengujian H5 terhadap setiap sampel individu dalam pool tersebut.
3.3.3.2 Isolasi RNA
Isolasi RNA dilakukan menggunakan kit Isolasi MagMAXTM AI/ND Viral RNA dari Ambion®. Sebanyak 50 µl sampel dimasukkan ke dalam 100 µl buffer lisis pada plat ekstraksi 96 sumuran. Selanjutnya ditambahkan larutan beads (manik-manik sangat kecil yang bersifat paramagnetik untuk mengikat RNA) sebanyak 20 µl, diagitasi selama 4 menit, dan didiamkan di atas magnetic stand (lempeng magnetik yang berfungsi mengendapkan beads paramagnetik ke dasar plat) selama 2 menit. Supernatan dibuang dengan cara disedot dengan mikropipet. Plat diturunkan dari magnetic stand lalu ditambahkan 100 µl wash buffer I (buffer pencuci I), diagitasi selama 30 detik dan didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit. Setelah itu, supernatan dibuang menggunakan mikropipet. Proses pencucian ini dilanjutkan menggunakan wash buffer II sebanyak dua kali. Pada tahap selanjutnya beads diagitasi selama 2 menit agar kering. RNA dielusi menggunakan 50 µl elution buffer kemudian plat diagitasi selama 3 menit lalu didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit untuk mengendapkan beads. Supernatan yang berisi RNA diambil dan dipindahkan ke dalam plat 96 sumuran yang baru. RNA tersebut digunakan sebagai cetakan (template) PCR atau disimpan pada suhu -80oC sampai digunakan (Desiliyarni 2006).
3.3.3.3 Real Time RT-PCR
Penyiapan campuran PCR dilakukan di atas blok dingin dalam biosafety cabinet (BSC). Secara berurutan reagen PCR seperti yang tertulis pada Tabel 2 dicampur pada tabung berukuran 1.5 ml kemudian disimpan pada -20oC hingga digunakan. Adapun primer dan probe yang digunakan tertera pada Tabel 3.
Tabel 2 Campuran rRT-PCR Reagen Volume/reaksi (µl) H2O 5.40 Primer forward (20 µM) 0.50 Primer reverse (20 µM) 0.50 Probe (10 µM) 0.60 Fast MIX 5.00 Template 8.00 Volume total 20.0
Tabel 3 Primer dan probe yang digunakan
Sekuens Referensi
Primer matriks forward M+25* 5’
5’-AgATgAgTCTTCTAACCgAggTCg-3’ Heine et al. 2005, NVSL 2008 Primer matriks reverse
M-124*3’
5’-TgCAAAAACATCTTCAAg TCTCTG-3’
Probe AIV Matriks M+64* 5’DFAM-TCAggCCCCCTCAAAg CCgA-BHQ1-3 Primer H5 forward IVA D148 H5 5’-AAACAgAgAggAAATAAgT ggAgTAAAATT-3’ Keawcharoen et al. 2008 Primer H5 Reverse IVA D149 H5 5’-AAAgATAgACCAgCTACCAT gATTgC-3’ Probe AIV H5 H5+1637* 5’d FAM-TCAACAg TggCgAg TTCCCTAgCA-BHQ1-3’ Heine et al. 2005 dengan modifikasi, NVSL 2008
Ke dalam setiap sumur plat optik 96 sumuran dimasukkan 12 µl campuran PCR lalu ditambahkan 8 µl template hasil isolasi (NVSL 2008). Plat ditutup dengan segel optik kemudian ditempatkan pada mesin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System dengan kondisi suhu amplifikasi untuk gen Matriks (Tabel 4) atau H5 (Tabel 5).
Tabel 4 Kondisi amplifikasi untuk rRT-PCR Matriks
Siklus PCR Suhu Waktu
Tahap I (1x)
Reverse transcription 50oC 5 menit
Denaturasi 95oC 20detik
Tahap II (45x)
Denaturasi 94oC 3 detik
Tabel 5 Kondisi amplifikasi untuk rRT-PCR H5
Siklus PCR Suhu Waktu
Tahap I (1x)
Reverse transcription 50oC 5 menit
Denaturasi 95oC 20detik
Tahap II (40x)
Denaturasi 95oC 3 detik
Anealling 56oC 32 detik
Ekstensi 72oC 10 detik
3.3.3.4 Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI)
Serum dari spesies selain ayam kadangkala menunjukkan hasil positif yang nonspesifik sehingga perlu dilakukan adsorbsi serum menggunakan RBC ayam. Sebanyak 0.025 ml RBC ayam ditambahkan ke 0.5 ml serum spesies non ayam, dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya, RBC diendapkan melalui sentrifugasi 800 g selama 5 menit dan serum yang diadsorbsi dipisahkan (OIE 2009). Sebelum diuji HI, serum diinaktifasi melalui pemanasan pada penangas air dengan suhu 56oC selama 30 menit (Kalthoff et al. 2008; Capua dan Alexander 2009).Uji Hemaglutinasi Inhibisi dilakukan sesuai dengan metode OIE 2009, sebagai berikut:
1. Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam setiap sumur plat mikrotitrasi 96 sumuran berdasar V, sumur 1-12.
2. Sebanyak 25 µl serum dimasukkan ke sumur pertama.
3. Pengenceran bertingkat dua kali dilakukan dengan memasukkan 25 µl serum dari sumur 1 ke sumur 2 dan dihomogenkan. Selanjutnya sebanyak 25 µl serum dari sumur kedua dipindahkan ke sumur ketiga, demikian seterusnya. Hal yang sama juga dilakukan terhadap kontrol serum positif. 4. Sebanyak 25 µl 4 HAU antigen standar dimasukkan ke setiap sumur dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang.
5. Sebanyak 25 µl RBC 1% (v/v) ditambahkan ke setiap sumur dan dihomogenkan. Larutan diinkubasi selama 40 menit pada suhu ruang (20oC) atau sampai kontrol RBC (hanya berisi 25 µl RBC 1% (v/v) dan 50 µl PBS) telah mengendap dan membentuk formasi seperti “kancing”. 6. Titer HI merupakan pengenceran tertinggi dimana serum dapat secara
sempurna menginhibisi antigen sebanyak 4 HAU. Aglutinasi dinilai dengan memiringkan plate. Hasil dinyatkan positif jika tidak terjadi aglutinasi dan negatif jika terjadi aglutinasi. Hasil divalidasi dengan kontrol negatif dan kontrol serum positif ((A/Legok/IPB-SGT/1/2004 (H5N1) dan A/Ck/West Java/PWT-Wij/2006 (H5N1)).
3.4 Analisa Data
Data hasil pengujian laboratorium maupun data epidemiologis dianalisa secara deskriptif. Sampel lapang dianalisis berdasarkan spesies dan jumlah unggas yang positif matriks VAI dan H5 serta asal unggas. Data sampel unggas yang dibeli dikaitkan antara hasil pemeriksaan rRT-PCR dengan hasil pemeriksaan serologis uji hemaglutinasi inhibisi. Data epidemiologis (pedagang, sumber unggas, cuaca) dikaitkan dengan hasil pemeriksaan laboratorium.
