Lampiran 1. DATA SHEET : RIBAVIRIN (Bertrand 2000 dalam McEvoy 2005)

(1)

(2)

Lampiran 1. DATA SHEET : RIBAVIRIN (Bertrand 2000 dalam McEvoy 2005)

Nilai toksisitas Non-Manusia :

Rat LD50 oral 5,3 g / kg; Mouse LD50 oral 2 g /

kg; Ip Mouse LD50 0,9-1,3 g / kg; LD50 ip rat 2 g / kg.

Formula molekul

: C

8

-H

12

-N

4

-O

5

Bobot molekul

: 244.20

Warna / Bentuk

: Tanpa warna/ Kristal putih bubuk

Bau

: Tanpa bau

Rasa

: Hambar

Melting Point

: 166-168

o

C (aq etanol); 174-176

o

C (etanol).

Kelarutan

: Larut air, Sedikit larut dalam alkohol. Dalam air, 142 mg /

mL pada 25

o

C

Spectral Properties

: Khusus rotasi optik: -36,5 derajat di 25

o

Fitotoksisitas

: 100 ppm

(3)

Lampiran 2 Tahapan umum penelitian

Plbs (Protocorm likes bodies) dari anggrek Dendrobium

Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA

Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW (Vacin and Went) Cair

Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Ribavirin Positif terinfeksi CyMV

Analisis Statistik

Negatif terinfeksi CyMV

Membedakan pola pita protein pada tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plb anggrek Dendrobium sakit (terinfeksi CyMV) dengan Elektroforesis Gel Komposit

(4)

Lampiran 3 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA

(Clark&Adam 1977; BALITHI 2003)

Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4o atau 2jam pada suhu 37

C o

C

C o

C

C Cuci kembali dengan penyangga

o

C PBST 3 x 3 menit

C Cuci kembali dengan penyangga

o

C PBST 3 x 3 menit

Inkubasi pada suhu kamar + selama 1 jam

Coating/lapisi lubang plate dengan antibody-anti CyMV (IgG) yang dicampur dengan penyangga “coating” ( 1,59 g Na2CO3 + 2,93 g NaHCO3 + 0.20 g NaN3 + H2O s/d 1 Liter)

(1:200), tiap lubang sebanyak 100 µl.

Cuci lubang plate dengan penyangga PBS Tween (8 g NaCl + 1,2 g KH2PO4 + 2,9 g

Na2HPO4.12H2O + 0,2 g KCl + 500 µl Tween 20 + H2O s/d 1 liter) menggunakan botol

semprot 3 x 3 menit (sambil dishaker). Kemudian tunggu hingga cukup kering.

Timbang sampel (plbs anggrek) 0,2 g berikut control negatif dan positif CyMV, hancurkan dalam mortar dengan penyangga ekstraksi (PBS IX; 0,10% tween 20; 20%

PVP; 0,20% BSA) dengan perbandingan 1:5 s/d 1: 10

Masukan sampel ke dalam lubang plate sebanyak 100 µl, posisi sampel disesuaikan dengan format yang telah diisi sebelumnya

Masukan antibody-anti CyMV (yang telah dilabel dengan enzim alkalin fosfatase) yang dicampur dengan ECl (20% PBS 5 x 0,02% tween 20; 20% PVP; 0,20% BSA, H2O)

(1:200) sebanyak 100 µl

Masukan penyangga substrat yang mengandung 4-nitrophenylphosphate (1mg/ml), tiap lubang 100 µl

Setelah terjadi perubahan warna menjadi kuning, hentikan reaksi dengan NaOH 3 M sebanyak 25 µl

Ukur intensitas perubahan warna (kandungan virus) dengan menggunakan Elisa Reader pada panjang gelombang 410 nm

(5)

Lampiran 4 Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW (Vacin

and Went) Cair

Plbs terinfeksi CyMV

Masukan dan lakukan kultur dalam media VW Cair

Inkubasi selama 2 bulan (18oC) sambil di shaker

(6)

Lampiran 5 Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Ribavirin

Plbs yang akan diberi perlakuan, berukuran + 5 mm

Ditanam pada media VW padat mengandung Ribavirin 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm

Ribavirin dicampur ke dalam media steril dengan cara

difilter (saringan bakteri/milipore 0.22 µm)

Botol kultur disimpan di ruang kultur (18oC) dengan intensitas cahaya 1000 lux

Subkultur selama 18 hari pada media yang sama

Deteksi kembali CyMV dalam sampel dengan ELISA

dilakukan 3 kali

(7)

Lampiran 6 Pembuatan Media Vacin and Went (VW) Cair dan Padat

sebanyak 1 liter.

Membuat media VW cair

Membuat media VW Padat

STOK A: KNO3 0,525 gr; KH2PO4 0,25 gr; (NH4)2SO4 0,5 gr; MnSO4.4H2O 7,5 mg; (dilarutkan dalam 20 ml aquades steril) STOK B: MgSO4.7H2O 25mg; (dilarutkan dalam 20 ml aquades steril) STOK C: Na EDTA 37,5 mg; FeSO4.7H2O 27,8 mg; (dilarutkan dalam 20 ml

aquades steril panas)

STOK D: Ca3(PO4)2 0,2 gr (dilarutkan dalam HCl 1 N)

STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa

Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter

Diukur pH hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit

NaOH 3 M

STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa

Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter

Diukur pH hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit

NaOH 3 M

Ditambahkan 7 gr agar dan panaskan hingga mendidih

(8)

Lampiran 7 Membedakan pola pita protein tanaman dan plbs anggrek

Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plbs

anggrek

Dendrobium

sakit (terinfeksi CyMV) dengan

Elektroforesis Gel Komposit

Cara membuat gel:

Prosedur:

Agarose 0,5% dan aquades dicampurkan dalam wadah I, dipanaskan dalam microwave

Acrylamid:bis 2% dan TBE 3x dicampurkan dalam wadah II, dipanaskan dalam inkubator

(water bath) 100oC selama 1 menit

Ditambahkan 200 µl APS 10% _{Ditambahkan 30 µl TEMED}

Setelah hangat kuku,dicampurkan kedua larutan tersebut, diaduk sebentar, kemudian dicetak dalam casting (pencetak gel).

1 g daun/plbs digerus dalam 1 ml buffer ekstraksi

Diinkubasi 10 menit pada suhu 50 oC (water bath)

Disentrifus 12.000 rpm selama 10 menit.

Diambil supernatan, sebelum dipakai disimpan di suhu 4 oC

100 µl supernatan tiap sampel yang sudah dicampur dengan

20 µl loading buffer (sample buffer 6x) dan Marker protein dipanaskan pada suhu 95 oC selama 5 menit lalu didinginkan selama 15 detik dan dimasukan ke dalam sumur gel

Running dilakukan selama ± 3,5 jam pada voltase 50

Pewarnaan dengan Amidobalck (0,1 g Amidoblack dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 7%)

(9)

Lampiran 8 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium untuk perlakuan zat

antivirus Ribavirin

Jenis Plbs Dendrobium

Ulangan

Absorbansi

Hasil Uji

D. Sonia

1 0,00

-

2 0,01

-

3 0,00

-

D. Jayakarta

1 0,09

+

2 0,07

+

3 0,08

+

D. Polisema

1

0.01 -

2 0,00

-

3

0.01 -

Kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; Kontrol negatif = 0.10

Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)

(10)

Lampiran 9 Hasil uji DAS-ELISA terhadap plbs anggrek D. Jayakarta selama

tiga kali subkultur

Sub

kultur

Konsentrasi

Ribavirin

(ppm)

Hasil Uji DAS-ELISA

%

bebas

CyMV

Ulangan

Absorbansi pada 410 nm

Hasil uji

1

2

3

1

2

3

1

0

0.13

0.15

0.13 +

+

0

10

0.2

0.22

0.22 +

+

0

20

0.18

0.19 +

+

0

30

0.19

0.21

0.21 +

+

0

40

0.18

0.17

0.17 +

+

0

50

0.17

0.14

0.17 +

+

0

2

0

0.12

0.11

0.14 +

+

0

10

0.07

0.09

0.08 +

+

0

20

0.09

0.11

0.1 +

+

0

30

0.12

0.15

0.13 +

+

0

40

0.12

0.17

0.22 +

+

0

50

0.22

0.21

0.2 +

+

0

3

0

0.24

0.29

0.25 +

+

0

10

0.27

0.19 +

+

-

33.33

20

0.13

0.21

0.21 -

+

33.33

30

0.13

0.15

0.18 -

-

100

40

0.15

0.11

0.1 -

-

100

50

0.13

0.14

0.19 -

-

100

keterangan:

kontrol positif subkultur 1 = 0.15 ; kontrol negatif = 0.05 kontrol positif subkultur 2 = 0.16 ; kontrol negatif = 0.03 kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; kontrol negatif = 0.10

Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)

(11)

(12)

Lampiran 11 Analisis statistika data hasil penelitian

Transformasi data % Bebas CyMV berdasarkan arcsin transformation

(Gomez&Gomez, 1976)

Konsentrasi Ribavirin

(ppm)

Data % Bebas CyMV Transformasi Data % Bebas CyMV

Subkultur 1 Subkultur 1 Ulangan total rata-rata Ulangan total rata-rata 1 2 3 1 2 3 0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 20 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 30 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 40 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 50 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 Konsentrasi Ribavirin (ppm)

Subkultur 3 Subkultur 3 Ulangan total rata-rata Ulangan total rata-rata 1 2 3 1 2 3 0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 100 100 33.33 1.28 1.28 88.72 91.28 30.43 20 100 0 0 100 33.33 88.72 1.28 1.28 91.28 30.43 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 Keterangan:

Transformasi menggunakan rumus Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n)

Nilai 100% disubstitusi dengan [100 - 1/(4n)] n = banyaknya plbs per perlakuan

(13)

Hasil analisis ANOVA % Bebas CyMV subkultur 1 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 3 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 22512 4502 5.30 0.008 Error 12 10194 850 Total 17 32707 S = 29.15 R-Sq = 68.83% R-Sq(adj) = 55.84%

(14)

Hasil uji Duncan % Bebas CyMV pada setiap subkultur

Konsentrasi

Ribavirin

(ppm)

% Bebas CyMV Subkultur 1

Transformasi Data

Data Asli

Rata-rata

Uji Duncan

Rata-rata

Uji Duncan

0

1.28 a

0 a

10

1.28 a

0 a

20

1.28 a

0 a

30

1.28 a

0 a

40

1.28 a

0 a

50

1.28 a

0 a

Konsentrasi

Ribavirin

(ppm)

% Bebas CyMV Subkultur 2

Transformasi Data

Data Asli

Rata-rata

Uji Duncan

Rata-rata

Uji Duncan

0

1.28 a

0 a

10

1.28 a

0 a

20

1.28 a

0 a

30

1.28 a

0 a

40

1.28 a

0 a

50

1.28 a

0 a

Konsentrasi

Ribavirin

(ppm)

% Bebas CyMV Subkultur 3

Transformasi Data

Data Asli

Rata-rata Uji Duncan

Rata-rata

Uji Duncan

0

1.28 a

0 a

10

30.43 ab

33.33 ab

20

30.43 ab

33.33 ab

30

88.72 b

100 b

40

88.72 b

100 b

50

88.72 b

100 b

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama

menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%

(15)

Transformasi data % Hidup plbs berdasarkan arcsin transformation

(Gomez&Gomez, 1976)

Konsentrasi Ribavirin

(ppm)

Data % Hidup plbs Transformasi Data %Hidup plbs

Subkultur 2 Subkultur 2 Ulangan total rata-rata Ulangan total rata-rata 1 2 3 1 2 3 0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 50 250 83.33 88.72 88.72 45 222.4 74.15 Konsentrasi Ribavirin (ppm)

Subkultur 3 Subkultur 3 Ulangan total rata-rata Ulangan total rata-rata 1 2 3 1 2 3 0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46 40 100 66.67 66.67 233.3 77.78 88.72 54.94 54.94 198.6 66.20 50 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46 Keterangan:

Transformasi menggunakan rumus Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n)

Nilai 100% disubstitusi dengan [100 - 1/(4n)] n = banyaknya plbs per perlakuan

(16)

Hasil Analisis ANOVA % Hidup plbs Anggrek D. Jayakarta

subkultur 1 Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 531 106 1.00 0.458 Error 12 1274 106 Total 17 1805 S = 10.30 R-Sq = 29.41% R-Sq(adj) = 0.00% subkultur 3 Source DF SS MS F P Konsentrasi Ribavirin 5 1268 254 1.33 0.315 Error 12 2282 190 Total 17 3550 S = 13.79 R-Sq = 35.71% R-Sq(adj) = 8.93%