DENGAN METODE ENZYME LINK IMMUNOSORBENT ASSAY
(ELISA)
SUMARIA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI TUGAS AKHIR DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tugas akhir ”Validasi metode pengujian kadar Imunoglobulin G dalam susu bubuk skim dengan metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA)” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tugas akhir ini.
Bogor, Januari 2013
Sumaria F252090025
ABSTRACT
SUMARIA. Validation Method of Analysis of Imunoglobulin G in Skim Milk Powder using Enzyme Link Immunosobent Assay (ELISA). Under Direction of HARSI D KUSUMANINGRUM and ENDANG PRANG DIMURTI.
People take a more proactive approach to maintaining their wellness by looking for natural ways to stay healthy and maintain a balanced immune system such as functional food. Functional foods are foods, and in fact they are foods, that go beyond simple nutrition and have specific targeted actions. Various strategies have been adopted to develop functional foods. The last approach to developing functional foods is based on the addition of ingredients that are very specific and have a very targeted action, that are used to reduce the risk of disease. Milk-based products enriched with immunoglobulins are recently available in the market. The active ingredient, colostrum, is targetted at maintaining health and the natural microbiota. The product is claimed to be lactose-free and fat- free, to have benecifial effects on the immune system and to improve the health of muscles and joints. Immunoassay is development of food analysis which is antibody-based optical were used as to determine IgG because of their simplicity, sensitivity and spesificity. Immunoglobulin G (IgG) in skim milk powder were analyzed by Sandwich Enzyme Link Immunosorbent Assay using bovine IgG ELISA kit. However, before adoption analysis method as a routine method, it should be validated. Standard curves were constructed using IgG standard (stock solution is 125ng/ml), ELISA was linear within 0-125 ng/mL range. Therefore, the samples required a 1/500 dilution to approximately 12.8 ng/mL. ELISA was developed for determination of IgG in bovine milk and colostrum with either goat or rabbit antibovine IgG or protein G used as detecting molecule. Performance parameters validation included liniearity, showed a working range of 5,10 ng to 38,42 ng and correlation coefficient r: 0.99. Overall instrument response repeatability relative standard deviation (RSD) were of 3,87% , 9,67% and 4,86% for IgG over 7 analyses for 3 kind of samples and recovery was 111,24%. The technique was applied to the measurement of IgG content in milk powders, and a precision relative standard deviation values of ≤20%, acuracy of 85-115% and percent recovery of RSD ≤15%, and the method is specific.
Keywords :Immuglobulin G, Sim Milk Powder, Validation Method of Analysis, ELISA
RINGKASAN
SUMARIA. Validasi Metode Pengujian Kadar Imunoglobulin G dalam Susu Bubuk Skim dengan metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA),” dibimbing oleh HARSI D KUSUMANINGRUM and ENDANG PRANG DIMURTI.
Saat ini banyak dipopulerkan pangan yang mempunyai fungsi fisiologis tertentu untuk tubuh seperti meningkatkan kesehatan, vitalitas, meningkatkan kinerja fisik sehingga lebih aktif dan memperpanjang umur seperti pangan yang diperkaya dengan imunoglobulinG atau IgG (Mattila dan Hoolihan, dalam Mattila 2005). Pangan fungsional adalah pangan olahan yang mengandung satu atau lebih komponen fungsional yang berdasarkan kajian ilmiah mempunyai fungsi fisiologis tertentu, terbukti tidak membahayakan dan bermanfaat bagi kesehatan. Pangan fungsional juga harus menggunakan bahan yang memenuhi standar mutu dan persyaratan keamanan, mempunyai manfaat bagi kesehatan sesuai persyaratan yang ditetapkan (Badan POM, 2003)). Seiring dengan banyaknya pangan yang diklaim mempunyai fungsi fisiologis tertentu untuk tubuh seperti meningkatkan kesehatan, vitalitas, dan meningkatkan kinerja fisik. Terjadi peningkatan keberadaan colostrum-based functional foods dan suplemen, dimana pangan diperkaya dengan imunoglobulin G (IgG) yang diklaim dapat meningkatkan kesehatan gastrointestinal dan stimulasi sistem imun sehingga meningkatkan imunitas.
Pengembangan metode untuk pengujian IgG dalam suatu produk merupakan hal yang sangat penting karena metode ujinya masih terbatas (sporns 2004). Umumnya pengujian dapat dilakukan dengan beberapa metode misalnya kit radial imunodifusion (RID), affinity high-performance liquid chromatography (HPLC) dan metode immunoassay. Immunoassay yang dikenal dengan Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan pengembangan analisis pangan antibody-based optical yang pada saat ini digunakan untuk pengujian IgG karena simplisitas, sensitivitas, dan spesifitasnya. Aplikasi metode ini dapat diterapkan pada uji cepat terhadap food borne-pathogen dan mendeteksi protein spesifik dalam jumlah kecil.
Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan validasi metode pengujian kadar bovine imunoglobulin G (IgG) dalam susu bubuk skim, sehingga dapat digunakan untuk analisis terhadap susu bubuk skim yang diklaim mengandung IgG yang telah banyak beredar di Indonesia. Validasi metode dilakukan dengan parameter uji linieritas dan rentang, limit deteksi dan limit kuantitasi, uji presisi untuk ripitabilitas, uji akurasi dan uji spesifisitas. Dengan dilakukan penelitian ini, diharapkan diperoleh metode analisis yang valid untuk pengujian kadar IgG dalam susu bubuk skim sehingga dapat menjadi metode acuan.
kurva kalibrasi dan menetapkan kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim yang mengandung IgG dengan kadar 150/15g. Tahap kedua adalah melakukan validasi metode pengujian kadar IgG dalam susu bubuk skim dan dilakukan validasi metode analisis dengan parameter uji keberulangan terhadap susu bubuk skim lainnya dengan kadar yang bervariasi dalam hal ini digunakan sampel lain dengan kadar 180mg/15g dan 200mg/15g.
Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa pada tahap uji pendahuluan diperoleh kurva baku kalibrasi yang baik dengan nilai koefisien korelasi (r) 0,99 dan masih dalam kriteria keberterimaan r ≥ 0,95, untuk kadar optimum IgG dalam sampel diperoleh pada pengenceran 1/500 atau 12,8 ng/mL. Hasil validasi metode analisis yang diperoleh adalah valid yang ditunjukkan dengan kurva kalibrasi dan linieritas pada rentang konsentrasi antara 5,1 ng/mL dan 38,4 ng/mL dan koefisien korelasi r = 0.99. Presisi dengan nilai RSD 3,87%, dan akurasi dengan satu tingkat konsentrasi yang memberikan nilai persen rekoveri 111,24% pada kriteria keberterimaan untuk presisi nilai RSD ≤20%, akurasi dengan nilai persen rekoveri antara 85-115% atau RSD ≤15%. Sedangkan Limit deteksi 0,93 ng/mL dan limit kuantisasi 3,1 ng/mL.
Hasil analisis menggunakan metode ELISA terhadap 3 sampel merek susu bubuk skim yang diklaim mengandung Imunoglobulin G (IgG) atau kolostrum yang beredar memiliki nilai RSD berturut-turut untuk sampel A, sampel B dan sampel C adalah 3,87% , 9,67% dan 4,86%. Hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional instrumen dan prosedur metode sudah baik dengan respon.Hasil validasi untuk parameter uji spesifitas menunjukkan bahwa metode sudah spesifik untuk pengujian kadar bovine IgG dalam susu bubuk skim.
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2013 Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
VALIDASI METODE PENGUJIAN
KADAR IMUNOGLOBULIN G DALAM SUSU BUBUK SKIM
DENGAN METODE ENZYME LINK IMMUNOSORBENT ASSAY
(ELISA)
SUMARIA
Tugas Akhir
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi Pada Program Studi Teknologi Pangan
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2013
Nama Mahasiswa : Sumaria
Nomor Pokok : F252090025
Program Studi : Magister Profesi Teknologi Pangan
Menyetujui, Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Harsi D Kusumaningrum Dr. Ir. Endang Prangdimurti, MSi (Ketua) (Anggota)
Mengetahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pasca Sarjana Magister Profesi Teknologi Pangan
Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tugas akhir ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Magister Profesi pada Program Magister Profesional Teknologi Pangan. Tema penelitian ini diangkat dari masalah yang dijumpai oleh peneliti dalam pekerjaan sehari-hari. Tugas akhir ini diharapkan dapat memberikan manfaat bagi pembaca, dan memberikan kontribusi bagi regulator dalam mengevaluasi mutu pangan dalam rangka pengawasan mutu pangan.
Penulis mengucapkan terima kasih yang tulus atas bimbingan dan tuntunan kepada Dr. Ir. Harsi D Kusumaningrum dan Dr. Ir. Endang Prangdimurti, MSi, selaku komisi pembimbing yang telah membimbing penulis dengan sabar dalam menyusun tugas akhir ini, mulai dari awal hingga akhir. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Hanifah Nuryani Lioe, Msi, selaku penguji luar komisi yang telah banyak memberikan masukan dalam penyusunan tugas akhir ini. Terima kasih juga disampaikan kepada Dr. Lilis Nuraida, MSc selaku Koordinator Program Studi Magister Profesi Teknologi Pangan yang telah membantu, memberikan dorongan dan kesempatan yang begitu banyak kepada penulis.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada seluruh dosen pengajar di Program Studi Teknologi Pangan yang telah membekali berbagai pengetahuan kepada penulis selama menjalani kuliah di sekolah pascasarjana Magister Profesi Teknologi Pangan. Tidak lupa terima kasih juga kepada ibu Tika yang telah banyak membantu dalam masalah administrasi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Drs. Syamsudin, Apt. MSi selaku Kepala Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional, dan Dra.Hermini Tetrasari MSi yang telah mengizinkan dan membantu penulis dalam rangka penelitian serta teman teman di laboratorium Obat Tradional kosmetika dan produk
Terima kasih juga kepada teman-teman MPTP batch 5 dan batch 6 yang telah memberikan motivasi kepada penulis, serta teman teman yang tidak tersebutkan namanya disini, terima kasih semua.
Penulis juga mengucapkan terima kasih yang tulus kepada Ibunda tercinta dan keluarga besar di STM yang tersayang selama ini telah mendukung dan memberikan semangat kepada penulis serta selalu mendoakan dari awal kuliah hingga menyelesaikan pendidikan ini.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini belum sempurna, sehingga penulis lain dapat melanjutkan untuk penyempurnaannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2013
Penulis dilahirkan pada tanggal 27 Juli 1954, di Medan Sumatera Utara sebagai anak kelima dari ayahanda Mohammad Sudian (almarhum) dan Ibu Ramsah.
Menyelesaikan pendidikan sekolah dasar negeri tahun 1966 dan melanjutkan pendidikan sekolah menengah pertama negeri dan menyelesaikan tahun 1969. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan kejuruan Sekolah asisten Apoteker di SAA Negeri Medan dan selesai pada tahun 1972. Selesai pendidikan penulis menjalankan kerja kefarmasian di Apotek swasta selama 3 tahun hingga tahun 1975. Pada tahun 1976 penulis melanjutkan pendidikan pada jurusan farmasi FMIPA Universitas Sumatera Utara di Medan hingga tahun 1982 dan lulus sebagai sarjana farmasi, selanjutnya pada tahun 1983 menyelesaikan pendidikan Apoteker setelah menjalankan kerja profesi dan menempuh ujian Apoteker. Selama masa studi penulis aktif pada kegiatan di kampus sebagai anggota senat mahasiswa dan pengurus pada korps mahasiswa pencinta alam dan studi lingkungan hidup.
Sejak tahun 1984 hingga tahun 2010 penulis bekerja pada Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM. dan sejak Awal masuk penulis ditempatkan dilaboratorium Mikrobiologi PPOMN Badan Pengawas Obat dan Makanan (Badan POM). Disamping bekerja di Laboratorium Mikrobiologi. Penulis juga membantu tugas inspeksi/audit ke pabrik farmasi dan pangan yang ditugaskan oleh Badan POM, serta asesmen laboratorium mikrobiologi dalam lingkup kegiatan mikrobiologi yang ditugaskan oleh Komite Akreditasi Nasional Badan Standardisasi Nasional.
xi
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah... 4
1.3 Tujuan ... 5
1.4 Manfaat ... 5
1.5 Ruang Lingkup Penelitian ... 6
II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Imunoglobulin G……... 9
2.2 Susu Bubuk Skim…………... 11
2.3 Enzyme Link Immunosorbent Assay………... 14
2.4 Validasi Metode Analisis…... 23
III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat ... 33
3.2 Alat dan Bahan ... 33
3.3 Metode Penelitian ... 34
IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan kurva baku dan Penetapan kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim ………..………... 43
4.2 4.3 Validasi metode analisis penetapan kadar imunoglobulin G……… Bahasan Umum……… 45 52 V KESIMPULAN DAN SARAN ………... 67
DAFTAR PUSTAKA ………. 69
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1 Tabel 2
Komposisi beberapa jenis susu pada mamalia dan manusia... Parameter yang diperlukan pada validasi metode analisis untuk
12 uji kualitatif dan kuantitatif ………... 26 Tabel 3
Tabel 4
Keberterimaan akurasi berdasarkan persen rekoveri……… Densitas optik (OD) larutan baku bovine IgG………...
29 43 Tabel 5
Tabel 6
Kadar optimum IgG dalam Sampel A ………... Densitas optik dan kadar larutan baku bovine IgG……….
44 46 Tabel 7
Tabel 8
Densitas optik (OD) dan konsentrasi larutan baku bovine IgG……. Uji keberulangan larutan baku bovine IgG pada kadar 5,37 ng/mL
47 48 Tabel 9 Tabel 10 Tabel 11 Tabel 12 Tabel 13
Uji presisi pada Sampel A………. Uji Akurasi dengan Uji Rekoveri……… Densitas optik larutan sampel dan larutan matriks (1,5 mg/mL) dengan dan tanpa kandungan IgG ………... Uji keberulangan pada Sampel B dan sampel C………. Parameter validasi, kriteria keberterimaan dan hasil validasi………
49 50 51 52 65
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1 Struktur Imunoglobulin... 9 Gambar 2 Gambar 3 Gambar 4 Gambar 5 Gambar 6 Gambar 7 Gambar 8 ELISA langsung ……….……….. ELISA tidak langsung……… Sandwich ELISA……… Tahapan prosedur Sandwich ELISA ……… Reaksi pembentukan warna pada proses ELISA………. Kurva Baku larutan standar dengan bentuk garis lurus………. Kurva Baku larutan standar dengan bentuk sigmoid……….
15 16 16 18 22 55 56
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1 Komposisi sampel Susu Bubuk skim dalam 15 g/sachet
dan sampel matriks susu bubuk skim ………. 75 Lampiran 2 Data densitas optik larutan baku bovine IgG……… 77
I. PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Pada masa kini yang disebut dengan kehidupan modern, telah terjadi pergeseran di bidang pangan, dimana makan bukanlah sekedar untuk mengenyangkan tetapi untuk mencapai tingkat kesehatan dan kebugaran. Fungsi pangan yang utama untuk manusia adalah untuk memenuhi kebutuhan zat zat gizi tubuh, sesuai dengan jenis kelamin, usia, aktivitas fisik, dan bobot tubuh. selain memiliki untuk memenuhi zat gizi fungsi lainnya yaitu memiliki penampakan dan citarasa yang baik. Seiring dengan makin meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya hidup sehat, maka tuntutan terhadap pangan juga berubah. Bahan pangan yang diinginkan bukan saja yang mempunyai komposisi yang baik serta citarasa yang menarik, tetapi juga mempunyai fungsi fisiologis tertentu bagi tubuh.
Saat ini banyak dipopulerkan bahan pangan yang mempunyai fungsi fisiologis tertentu untuk tubuh seperti meningkatkan kesehatan, vitalitas, meningkatkan kinerja fisik sehingga lebih aktif dan memperpanjang umur (Mattila dan Hoolihan, dalam Mattila 2005). Hasil survei yang dilakukan oleh The American Dietetic Association setiap dua tahun menunjukkan bahwa terjadi perubahan yang mendasar dari persepsi konsumen. Data menunjukkan 85% konsumen percaya bahwa diet dan nutrisi merupakan hal yang sangat penting, dan 75% akan memilih pangan dengan sangat hati hati untuk mendapatkan keseimbangan antara nutrisi dan cara makan yang sehat. Survei yang dilakukan oleh The International Food Information (IFIC) di Massachuset terhadap 1000 konsumen, menyatakan hampir semua konsumen (94%) percaya bahwa pangan mempunyai dampak kesehatan dapat menurunkan risiko penyakit dan efek negatif dari penyakit tertentu. Menurut konsensus pada the First International Conference on East-West Perspective on Functional
Food (1996) pangan fungsional adalah pangan yang karena kandungan komponen aktifnya dapat memberikan manfaat bagi kesehatan, diluar manfaat yang diberikan oleh zat zat gizi yang terkandung didalamnya. Menurut Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan RI No.HK.00.05.52.0685 (2003), Tentang Ketentuan Pokok Pengawasan Pangan Fungsional pasal 1 ayat 3, definisi pangan fungsional adalah pangan olahan yang mengandung satu atau lebih komponen fungsional yang berdasarkan kajian ilmiah mempunyai fungsi fisiologis tertentu, terbukti tidak membahayakan dan bermanfaat bagi kesehatan.
Pangan fungsional juga harus menggunakan bahan yang memenuhi standar mutu dan persyaratan keamanan, mempunyai manfaat bagi kesehatan sesuai persyaratan yang ditetapkan, manfaat berdasarkan atas kajian ilmiah, disajikan dan dikonsumsi sebagaimana layaknya makanan atau minuman, memiliki karakteristik dan sensori seperti penampakan, warna dan tekstur serta citarasa yang dapat diterima konsumen.disamping itu komponen pangan fungsional tidak memberikan interaksi yang tidak diinginkan dengap komponen lain.
Menurut Codex (2007), pangan fungsional dapat berupa makanan dan minuman yang berasal dari hewani atau nabati. Walaupun konsep pangan fungsional baru populer beberapa tahun belakangan ini, tetapi sesungguhnya banyak jenis makanan konvensional yang memenuhi persyaratan untuk disebut sebagai pangan fungsional, misalnya adalah susu. Susu merupakan salah satu pangan fungsional terbaik karena mempunyai nutrisi lengkap secara alami dan susu mudah diserap oleh tubuh.
Secara umum komposisi susu sapi segar terdiri dari, 87% air, 4% laktosa (karbohidrat), 4 % protein, 3% lemak serta 2% campuran vitamin yang terkandung dalam susu berupa vitamin larut minyak (A, D, E, K) dan vitamin larut air (B1, B2, B6, B12, niasin, folat, asam pantotenat dan vitamin C) serta mineral (kalsium, forsfor, magnesium,
kalium, seng, fluorida) yang sangat dibutuhkan tubuh (Smit 2003). Selain itu, susu juga baik untuk pencegahan penyakit seperti osteoporosis, obesitas, hipertensi, kanker dan lain-lainnya. Menurut codex (2007) komposisi susu bubuk skim terdiri dari lemak susu maksimum 1,5%, air maksimum 5% dan protein susu dalam padatan susu non lemak minimum 34%.
Definisi susu bubuk skim yang tercantum dalam kategori pangan yang dikeluarkan oleh Badan POM (2006) adalah produk susu yang sebagian besar lemaknya telah dihilangkan dan dipasteurisasi atau disterilisasi atau diproses dengan UHT dan persyaratan minimum kadar lemak susu tidak lebih dari 0,15% dan kadar protein tidak kurang dari 3%.
Susu juga dapat meningkatkan sistem imun tubuh terhadap berbagai penyakit infeksi, pertumbuhan dan perkembangan sel, termasuk sel otak. Pangan fungsional dapat berupa pangan konvensional yang difortifikasi, diperkaya, disuplementasi, atau ditambahkan nilai manfaatnya (Hoppe 2008). Mikronutrien non vitamin termasuk nutrisi yang sangat tinggi dari bahan aktif yang ada didalam makanan dengan kandungan yang sangat kecil dapat mempengaruhi kesehatan. diantaranya, non vitamin karotenoid, asam lemak esensial, asam amino, komponen fosfolipid, dan semua komponen yang kondisional seperi karnitin, kholin, inositol, komponen antioksidan dan peningkat pertumbuhan, antimikroba, atau immune potential.
Imunoglobulin kolosral teruta lahir ma IgG memberikan imunitas pasif pada bayi yang baru sampai sistem imunitasnya berkembang (Hurley 2011). Saat ini secara global terjadi peningkatan keberadaan colostrum-based functional foods dan suplemen, yang diklaim dapat meningkatkan kesehatan gastrointestinal dan stimulasi sistem imun. Walaupun susu merupakan makanan, dan pada dasarnya adalah pangan yang mengandung zat gizi dan protein tetapi untuk
meningkatkan fungsinya sebagai pangan dengan klaim kesehatan dapat meningkatkan iumunitas masih diperkaya dengan IgG.
Di amerika dan Australia susu yang diperkaya dengan IgG sudah dipasarkan sejak tahun 1998 dengan kandungan ekstrak kolostrum (Mattila 2005). Di Indonesia pemasaran susu bubuk skim yang mengandung IgG dari produsen diklaim sebagai susu bubuk skim yang mengandung kolostrum.yang dijual secara multi level marketing system maupun konvensional. Menurut Gain Report (Pekerti 2010) produsen yang memproduksi minuman untuk diet ataupun meningkatkan kesehatan dengan produk berbentuk serbuk atau cair sebagai pangan fungsional atau suplemen, yang dipasarkan pada labelnya dengan klaim meningkatkan sistem imun dan mencegah infeksi semakin meningkat.
Pengembangan pengujian untuk analisis IgG dalam produk pangan merupakan hal yang sangat penting karena metode uji masih terbatas. Umumnya pengujian dapat dilakukan dengan beberapa metode misalnya kit Radial imunodifusion (RID) walaupun kit Radial Imunodifusion (RID) komersil sudah tersedia tetapi reagen ini umumnya bervariasi terhadap respon. Metode lain adalah affinity high-performance liquid chromatography (HPLC) yaitu metode yang berbasis pada ikatan spesifik IgG dengan immobilized protein G merupakan metode yang dikembangkan untuk analisis IgG ( Don Otter dalam Gapper 2007). Pengembangan metode selanjutnya adalah teknologi biosensor yang dapat digunakan sebagai pendekatan metode alternatif untuk analisis IgG dan metode antibody-based optical (Gapper 2007).
Immunoassay merupakan pengembangan analisis pangan antibody-based optical pada saat ini juga digunakan untuk pengujian IgG karena simplisitas, sensitivitas, dan spesifitasnya (Sporns 2004). Aplikasi metode ini dapat diterapkan pada uji cepat terhadap food
borne-pathogen dan mendeteksi protein spesifik dalam jumlah kecil. Umumnya metode immunoassay dapat digunakan untuk cara deteksi langsung dan kuantifikasi IgG dengan konsentrasi kecil pada pangan, karena kemampuan metode untuk memisahkan dan mendeteksi ikatan antigen-antibodi dari antigen atau antibodi berlabel (Boque 2002). Umumnya label yang digunakan adalah enzim, misalnya horseradish peroxydase, immunoassay ini dikenal sebagai metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA). Metode ELISA ini dapat dilakukan dengan format yang simpel dan uji cepat menggunakan suatu kit, sehingga metode ini banyak digunakan sebagai skrining pada pengujian secara cepat. Kit untuk pengujian ELISA sudah banyak beredar dipasaran dengan berbagai aplikasi yang dapat dipilih sesuai dengan tujuan penggunaanya.
Metode analisis yang digunakan untuk pengujian rutin suatu produk tertentu sebelumnya harus divalidasi terlebih dahulu. Validasi metode analisis adalah penilaian parameter analitik tertentu berdasarkan percobaan untuk memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaan atau konfirmasi melalui pengujian dan bukti obyektif agar persyaratan untuk maksud khusus dipenuhi (SNI 17025-2008). Validasi diperlukan untuk mendapatkan hasil analisis yang valid, reliabel/ dapat dipercaya, serta dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah dan sesuai dengan tujuan pengunaannya.
1.2 PERUMUSAN MASALAH
Seiring dengan peraturan dan kondisi diatas maka perlu dilakukan pengawasan atau monitoring terhadap kadar imunoglobulin G (IgG) yang diklaim dalam susu bubuk skim, baik pada tingkat industri, distributor dan konsumen. Untuk itu dibutuhkan suatu metode analisis yang valid, selektif, cepat, mudah dan praktis untuk penetapan kadar khususnya IgG dalam susu bubuk skim.
Metode resmi atau metode standar pengujian IgG yang ada saat ini masih belum diimplementasikan. Suatu metode baru dapat digunakan bila telah dilakukan validasi yang kondisinya disesuaikan dengan kondisi laboratorium dan peralatan yang tersedia, meskipun metode yang akan digunakan tersebut telah dipublikasikan dalam jurnal, buku teks atau buku resmi (Hadi 2007). Hal ini karena adanya perbedaaan dan keterbatasan alat, pereaksi atau kondisi lain yang menyebabkan metode tersebut tidak dapat diterapkan secara keseluruhan, sehingga sering dilakukan modifikasi, penyederhanaan maupun perbaikan metode, akibatnya metode tersebut harus divalidasi terlebih dahulu dengan cara yang benar. Apabila dari hasil validasi metode tersebut sudah memberikan hasil sesuai kriteria, maka metode ini dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin. Sehingga dapat dipastikan bahwa metode yang telah tervalidasi akan memberikan hasil yang dapat dipercaya.
1.3 TUJUAN PENELITIAN
1. Melakukan validasi metode analisis penetapan kadar immunoglobulin G dalam susu bubuk skim dengan metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA).
2. Parameter validasi adalah linieritas dan rentang, limit deteksi dan limit kuantitasi, presisi, akurasi, dan spesifisitas yang bertujuan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut handal, dan dapat dipercaya.
3. Melakukan uji keberulangan terhadap sampel berbeda dengan tujuan untuk membuktikan bahwa metode tersebut dapat digunakan untuk penetapan kadar imunoglobulin G dalam susu bubuk skim dengan kadar yang berbeda di dalam susu bubuk skim.
1.4 MANFAAT PENELITIAN
1. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan metode analisis yang handal (valid, spesifik, cepat, mudah dan praktis) untuk analisis penetapan kadar Imunoglobulin G dalam susu bubuk skim, 2. Dengan melakukan penelitian ini, diharapkan dapat menambah
pengetahuan baru bagi peneliti dan memberikan kontribusi bagi dunia pendidikan di Indonesia mengenai validasi metode analisis untuk pengujian produk pangan.
1.5 RUANG LINGKUP PENELITIAN
Penelitian ini merupakan studi laboratorium yang dilakukan untuk penetapan kadar optimum Imunoglobulin G dalam sampel susu bubuk skim untuk digunakan dalam validasi metode. Selanjutnya melakukan validasi metode analisis untuk membuktikan kehandalan metode yang diperoleh, dengan parameter validasi meliputi: uji linieritas dan rentang, uji presisi, uji akurasi, uji spesifisitas,penetapan limit deteksi dan limit kuantisasi; uji spesifisitas dan uji keberulangan untuk penetapan kadar IgG dalam berbagai merek susu bubuk skim yang beredar dengan kadar bervariasi.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 IMUNOGLOBULIN G
Menurut Webster dictionary (2002), Imunoglobulin G yang disingkat sebagai IgG adalah kelas terbesar dari kelompok imunoglobulin yang ditemukan dalam darah, termasuk antibodi, yang paling umum ditemukan dalam sirkulasi darah sebagai gamma globulin. Fungsi biologis dari imunoglobulin dalam susu sapi dan kolostrum adalah untuk mencegah kelenjar mamae dari bakteri patogen dan untuk memberikan suatu imunitas anak sapi terhadap patogen.
Menurut Hurley (2001), Imunoglobulin atau antibodi yang terkandung dalam kolostrum atau susu sama seperti didalam darah atau sekresi mukosal. Imunogobulin adalah sekelompok glikoprotein yang terdapat dalam serum atau cairan tubuh pada hampir semua mamalia. Imunoglobulin termasuk dalam glikoprotein yang mempunyai struktur dasar sama, komponen polipeptida membawa sifat biologik molekul antibodi tersebut. Struktur immunoglobulin tercantum pada Gambar 1.
Bila dibandingkan dengan protein dari susu atau kolostrum lainnya maka imunoglobulin relatif lebih resisten terhadap digesti gastrointestinal. Namun bersifat termolabil terutama bila terpapar suhu tinggi, misalnya bila terpapar pada suhu 75°C selama 5 menit akan menurun konsentrasinya hingga 40% dan pada suhu 95°C selama 15 detik menurun hingga 100%.
Antibodi mempunyai dua fungsi yaitu mengikat antigen secara spesifik dan memulai reaksi fiksasi komplemen serta pelepasan histamin dari sel mast. Imunoglobulin terbagi atas 5 kelas immunoglobulin yaitu IgM, IgA, IgG, IgE, dan IgD. Tiap kelas mempunyai perbedaan sifat fisik, tetapi pada semua kelas terdapat tempat ikatan antigen spesifik dan aktivitas biologik berlainan.
Susunan imunoglobulin ini merupakan penyusunan daerah simetris rangkaian asam amino yang dikenal sebagai daerah domain, yaitu bagian dari rantai H atau rantai L yang diapit oleh ikatan disulfid interchain, sedangkan ikatan antara 2 rantai dihubungkan oleh ikatan disulfid interchain. Rantai L mempunyai 2 tipe yaitu kappa dan lambda, sedangkan rantai H terdiri dari 5 kelas, yaitu rantai G (γ), rantai A (α), rantai M (µ), rantai E (ε) dan rantai D (δ). Setiap rantai mempunyai jumlah domain berbeda. Rantai pendek L mempunyai 2 domain; sedang rantai G, A dan D masing-masing 4 domain, dan rantai M dan E masing-masing 5 domain.
Imunoglobulin G (IgG) adalah jenis imunoglobulin yang utama dalam kolostrum dan susu sapi. IgG terdiri dari beberapa subkelas diantaranya IgG1 dan IgG2 dan merupakan imunoglobulin terbesar dalam serum. IgG mempunyai berat molekul: 150,000 dengan tipe rantai H: gamma dan konsentrasi serum 10 – 16 mg/ml , dan total IgG dalam serum 75% , glikosilasi 3%, dan terdistribusi pada intra-ektsravaskular. IgG mempunyai multifungsi seperti opsonisasi, complement fixation, pencegahan adesi mikroba patogen ke dalam serum dalam endothelial lining, inhibisi
metabolisme bakterial dengan membloking enzim, aglutinasi bakteri dan netralisasi toksin dan virus (Marnila dan Korhonen dalam Mehra 1992).
Sejak tahun 1980 sejumlah metode dikembangkan untuk mengisolasi dan memurnikan imunoglobulin dari kolostral dan cheese whey, metode yang digunakan berdasarkan pada ultrafiltrasi (UF) atau kombinasi antara UF dan kromatografi (Korhonen 2000). Beberapa literatur telah menyebutkan beberapa metode yang digunakan untuk isolasi, ekstraksi, konsentrasi dan purifikasi imunoglobulin G dari susu/kolostrum. Tetapi tidak semua metode dilaporkan hanya beberapa metode yang sesuai dengan produksi secara masal yang diterbitkan.
Pada abad keduapuluh dan kemajuan yang begitu cepat dari pemisahan menggunakan teknologi kromatografi, maka sangat memungkinkan untuk mengisolasi individual protein dalam skala besar (Korhonen 2004). Untuk produksi crude imunoglobulin dengan pendekatan yang sangat efektif adalah menggunakan kombinasi dari teknologi membran yang berbeda. Tetapi untuk meningkatkan recovery rate imunoglobulin dari whey dan meningkatkan konsentrasinya dalam produk akhir maka masih diperlukan teknik kromatografi yang spesifik.
2.2 SUSU BUBUK SKIM
Susu adalah cairan berwarna putih yang dihasilkan oleh kelenjar susu baik mamalia maupun manusia dan mengandung banyak vitamin dan protein (Spreer 1998). Umumnya yang disebut dengan susu adalah susu sapi, sedangkan untuk susu dari hewan lainnya, secara spesifik akan disebutkan dari mana asalnya seperti susu kambing, susu domba dan sebagainya. Umumnya Susu merupakan bahan makanan bernilai gizi tinggi, kandungan gizinya lengkap dengan sifat gizi yang mudah dicerna dan diserap oleh tubuh dipandang dari segi gizinya, susu merupakan makanan yang hampir sempurna dan merupakan salah satu makanan tertua dan pada waktu yang bersamaan merupakan salah satu makanan yang sangat penting.
Menurut Spreer (1998) susu adalah suatu sekresi yang komposisinya sangat berbeda dari komposisi darah yang merupakan asal susu. Misalnya lemak susu, kasein, laktosa yang disintesa oleh alveoli dalam ambing, tidak terdapat ditempat lain mana pun dalam tubuh sapi. Sejumlah besar darah harus mengalir melalui alveoli dalam pembuatan susu yaitu sekitar 50 kg darah butuhkan untuk menghasilkan 30 liter susu. Komposisi susu sangat beragam tergantung pada beberapa factor.
Menurut Buckle (1985) angka rata rata komposisi susu untuk semua jenis sapi adalah sebagai berikut : lemak 3%, protein 3,4%, laktosa 4,8%, abu 0,72%, dan air 87,10%, disamping itu juga mengandung bahan bahan lain dalam jumlah sedikit seperti sitrat, enzim enzim, fosfolipid, vitamin A, vitaminB dan vitamin C. Komposisi susu dari hewan lain selain sapi dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel1. Komposisi beberapa jenis susu pada mamalia dan manusia Jenis Materia kering (%) Lemak (%) Total prot. (%) Kase in (%) Whey prot. (%) Laktosa (%) Abu (%) Manusia 12.4 3.8 1.0 0.4 0.6 7.0 0.2 Sapi 13.0 4.0 3.4 2.8 0.6 4.8 0.7 Kambing 13.2 4,5 2.9 2.5 0.4 4.1 0.8 Domba 19.3 7.3 5.5 4.6 0.9 4.8 1.0 Keledai 8.5 0.6 1.4 0.7 0.7 6.1 0.4 Kuda 11.2 1.9 2.5 1.3 1.2 6.2 0.5 Kerbau 17.2 7.4 3.6 - - 5.5 0.8 Unta 13.6 4.5 3.6 2.7 0.9 5.0 0.7 Lama 16.2 2.4 7.3 6.2 1.1 6.0 - Yak 17,3 6,5 5,8 - - 4,6 0,9 Rusa 21,5 10,0 8,4 - - 3,8 1,5 Rusa kutub 33,1 16,9 11,5 - - 2,8 - Sumber : Buckle (1985)
Susu bubuk skim adalah bagian susu yang tertinggal sesudah krim diambil sebagian atau seluruhnya. Susu skim mengandung semua zat makanan dari susu kecuali lemak dan vitamin yang larut dalam lemak. Menurut Codex (2007) komposisi susu bubuk skim terdiri dari lemak susu maksimum 1,5%, air maksimum 5% dan protein susu dalam padatan susu non fat minimum 34% (Buckle 1985) .
Definisi susu skim yang tercantum dalam kategori pangan yang dikeluarkan oleh Badan POM (2006) adalah produk susu yang sebagian besar lemaknya telah dihilangkan dan dipasteurisasi atau disterilisasi atau diproses dengan UHT dan persyaratan minimum kadar lemak susu tidak lebih dari 0,15% dan kadar protein tidak kurang dari 3%. Susu skim dapat digunakan oleh orang yang menginginkan nilai kalori rendah di dalam makanannya, karena susu hanya mengandung 55% dari seluruh energi susu, dan susu skim juga digunakan dalam pembuatan keju dengan lemak rendah dan yoghurt (Buckle 1985).
Mattila (2003) mengkategorikan produk susu atas 3 kategori, 1. basic product (susu, susu fermentasi , keju, es krim, dll). 2. Added value product, dimana komposisi susu telah berubah misalnya produk rendah laktosa atau bebas laktosa, formula hipoalergenik dengan protein terhidrolisa untuk bayi yang hipersensitif terhadap susu, produk susu diperkaya dengan mineral atau vitamin sehingga produk ini dimaksudkan untuk kelompok konsumen dengan target tertentu. 3. produk susu yang secara fungsional untuk meningkatkan kesehatan, produk susu diperkaya dengan komponen fungsional ataupun ingredien dari susu.
Walaupun susu merupakan makanan dan pada dasarnya adalah pangan yang mengandung zat gizi dan protein, namun untuk meningkatkan fungsinya sebagai pangan dengan klaim kesehatan dapat meningkatkan imunitas masih diperkaya dengan IgG. Pada pemasarannya dapat dilihat klaim dari produsen bahwa susu bubuk skim yang mengandung IgG adalah susu bubuk skim yang mengandung kolostrum. Di Amerika dan Australia susu
yang diperkaya dengan IgG sudah dipasarkan sejak tahun 1998 dengan bahan aktif yang disebut ekstrak kolostrum (Mattila 2005).
2.3 ENZYME LINK IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Imunologi merupakan ilmu yang relatif baru dikembangkan pada masa sekarang, dan immnuoassay adalah salah satu dari pengembangan metode dari cabang ilmu ini. Perkembangan immunoassay semakin luas dan digunakan untuk metode standar pada analisis pangan karena spesifisitas, sensitivitas dan simplisitasnya. Immunoassay juga digunakan untuk menganalisa residu dalam pangan, identifikasi bakteri dan virus, serta deteksi protein (Sporns 2004).
Ada beberapa jenis immunoassay diantaranya Radial Immunodifusion (RID), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Nephelometry, Turbidometry, dan Rocket Electro-Phoresis (RIEP). Enzyme Link Immunosorbent Assay, disingkat ELISA, telah berkembang sampai pada tingkatan untuk kemampuan kinerja dengan berbagai konfigurasi (Burgess 1995). Beberapa Kit untuk immuno Assays secara komersial sudah tersedia (RID and ELISA). Metode ELISA telah banyak mengalami perubahan sejak teknik ini pertama kali dipublikasikan, ciri utamanya adalah menggunakan indikator enzim untuk reaksi imunologi.
Banyak pilihan untuk konfigurasi metode ELISA sehingga peneliti dapat menggunakan konfigurasi uji yang identik penampilan atau kinerjanya. Bila ingin menggunakan teknik ELISA dapat memulainya dengan konfigurasi yang relatif sederhana dan menggunakannya untuk menjajagi pilihan yang lain. Konfigurasi sederhana ini dapat digunakan untuk membakukan serangkaian reagen yang kemudian dapat digunakan untuk mengembangkan teknik tersebut lebih lanjut.
Konfigurasi yang paling sederhana adalah ELISA langsung (Gambar 2) , antigen secara langsung diadsorbsikan ke suatu substrat padat. Permukaan substrat dicuci dengan antibodi yang ditempeli enzim digunakan untuk
menunjukkan adanya antigen dan hasilnya akan terlihat bila ditambahkan substra dan antiserum harus dikonjugasikan pada enzim. Keterbatasan konfigurasi ini berkaitan dengan sifat pengikatan substrat padat dan kualitas antibodi indikator. Teknik ini kurang fleksibel, dan konfigurasi ini biasanya digunakan pada uji untuk mengenali suatu antigen.
Gambar 2. ELISA langsung (Burgess 1995)
Konfigurasi kedua adalah ELISA tidak langsung, umumnya digunakan untuk mengukur antibodi (Gambar 3). Antigen teradsorbsi pada substrat padat, antibodi primer tidak berlabel dan dapat diperoleh dari serum atau cairan tubuh lain. Antibodi sekunder terikat pada enzim yang sesuai dan antibodi ini biasanya disebut konjugat serta hasil akan terlihat bila ditambahkan substrat. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer. Kelemahan utama konfigurasi ini terletak pada tidak adanya spesifisitas karena sebagai akibat bereaksi dengan antigen yang tidak murni. Ketidakmurnian disebabkan sampel kemungkinan masih mengandung antigen dalam jumlah yang sangat kecil atau dari antiserum yang ditambahkan sehingga reaksi tidak spesifik.
Gambar 3. ELISA tidak langsung (Burgess 1995)
Konfigurasi ketiga adalah ELISA penangkap antigen atau Sandwich ELISA, dimana pada konfigurasi ini menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik (Gambar 4). Antibodi penangkap, antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik. Bila digunakan antibodi dari berbagai spesies, maka hanya reaksi spesifik yang diinginkan saja yang diamati, karenanya jika mungkin perlu dipilih antibodi yang dimurnikan berdasar afinitas. Sebagai alternatif adsorbsi berdasar afinitas adalah menambahkan imunoglobulin knde dalam pengencer.
ELISA penangkap antigen mempunyai potensi untuk meningkatkan spesifitas ELISA tidak langsung asalkan antibodi penangkapnya dapat menghindarkan penempelan antigen yang ada dalam jumlah kecil yang dapat mengganggu spesifitas tidak langsung. Penggunaan antibodi monoklonal digabung dengan antigen murni atau antigen yang sudah dimodifikasi dapat memperbaiki spesifitas.
Konfigurasi yang keempat adalah ELISA penangkap antibodi, konfigurasi ini menggunakan antiglobulin yang terikat pada substrat padat. Antibodi sampel yang diuji ditangkap dan sistem indikator menempel antigen berlabel. Konfigurasi ini yang paling umum digunakan pada uji yang spesifik terhadap isotipe, misalnya anti-M, diikatkan pada substrat padat (Patterson 1998). Antigen berlabel enzim kemudian ditambahkan, baik yang dilabel secara langsung maupun dilabel lewat ikatan tidak langsung seperti antibodi monoklonal atau biotin/streptavidin dan densitas optik berkaitan dengan kadar IgM spesifik sampel uji.
Konfigurasi kelima adalah ELISA kompetitif atau ELISA pemblok, teknik ini dapat digunakan dalam sejumlah konfigurasi dasar, kompetisi dapat terhadap antigen atau terhadap antibodi. Pengujian pada kompetisi antibodi membutuhkan antigen untuk ditangkap antibodi secara langsung maupun lewat antibodi spesifik ke substrat padat. Antibodi yang telah dikenal berkompetisi dengan antibodi yang tidak dikenal untuk mendapatkan tempat penempelan pada antigen. Antibodi yang telah diketahui dapat dilabel atau dapat dideteksi menggunakan antibodi antispesiesnya. Perlu diketahui bahwa untuk konfigurasi ELISA kompetitif harus dibatasi hanya untuk penambahan dua antibodinya dilakukan secara bersamaan. Umumnya konfigurasi ini digunakan untuk mengukur hapten.
Prinsip uji dari ELISA berdasarkan pada ikatan spesifik antigen pada antibodi (Ab primer) dengan antibodi sekunder (anti-species Ig) yang dilabel enzim, kemudian target akan diuraikan oleh enzim yang terdapat di dalam
substrat untuk selanjutnya hasil urai reaksi enzim lebih lanjut akan bereaksi dengan chromogen dan terbentuk warna yang dapat dikuantitasi dan proporsional dengan jumlah antibodi yang ada dalam sampel. Pembacaan densitas optik (OD) dari warna yang terbentuk selanjutnya diukur. Tahapan prosedur uji sandwich ELISA seperti tercantum pada Gambar 5.
Gambar 5. Tahapan prosedur Sandwich ELISA ( Pomeranz 2000)
Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil.
Setiap konfigurasi harus diperhatikan, terutama variasi yang ada meliputi substrat padat, antigen, penyangga pelapis, cara pelapisan, jenis antibodi, pengencer, substrat, cara pembacaan hasil dan interpretasi hasil. Konfigurasi ELISA yang paling umum menggunakan substrat, pada
mulanya enggunakan permukaan gelas (Burgess,1995) yang dimaksudkan untuk meningkatkan adsorbsi baik untuk antigen maupun antibodi, sekarang plastik telah hampir secara universal diterima sebagai pilihan untuk substrat padat. Diperkirakan proses yang dilakukan adalah dengan maksud untuk pengikatan gugus hidrofobik dan pencucian dengan larutan deterjen menjamin pengikatan lebih lanjut.
Kriteria dalam memilih substrat padat tidak hanya berdasar pada jumlah antigen atau antibodi yang akan mengadsorbsi. Banyaknya adsorbsi harus dapat diulangi dalam microplate, jumah protein yang teradsorbsi pada tiap sumuran harus pada batas tertentu. Apabila merancang suatu pengujian maka sebaiknya pada stadium awal dirancang pemilihan substrat padat yang sesuai (Burgess 1995). Pilihan meliputi membran, plate, tabung, tabung kapiler, batang atau manik manik. Polimer harus merupakan suatu bahan yang akan mengadsorsi sampel yang dikehendaki dalam jumlah banyak namun dengan variasi minimal dari pengujian ke pengujian. Polimer yang digunakan bisa bermacam macam namun dasar pemilihan harus ditentukan sesuai dengan tujuan pengujian.
Antigen atau antibodi dapat secara pasif teradsorbsi pada permukaan padat dan keragaman dapat terjadi karena perbedaan pH, kekuatan ion dan komposisi penyangga. Variasi dapat berupa terjadinya pengeringan penyangga pelapis sehingga pelapisan antigen pada plastik tidak terjadi. Selain itu perbedaan suhu akan berpengaruh pada pengikatan antigen, misalnya pada suhu tinggi pengikatan antigen dapat menyebabkan pengaruh pinggir pada microplate.
Sebagian besar larutan pencuci mengandung deterjen yang digunakan untuk mengurangi reaksi pengikatan non-spesifik. Deterjen dalam penyangga pelapis dapat menaikkan atau menurunkan pelapisan komponen spesifik. Pemilihan penyangga juga harus diperhatikan karena mempunyai pengaruh yang besar terhadap hasil pengujian, perlu dicari pengaruh berbagai penyangga dan pemblok. Keragaman terbesar dalam
merancang ELISA dapat dilihat dalam pemilihan konjugat dan substratnya.
Berbagai enzim telah tersedia, enzim secara langsung ke antibodi atau antigen atau secara tak langsung melalui jembatan protein A. Umumnya tiap enzim memerlukan sejumlah substrat, sehingga keuntungan dapat diperoleh dengan membuat kombinasi enzim dan substrat tertentu sehingga diperoleh cara yang optimal. Saat ini sudah dapat diperoleh antiserum komersial dengan kualitas yang baik dan titer tinggi untuk mengikat enzim, sehingga sensitifitas dan spesifisitas makin baik. Umumnya enzim yang digunakan adalah Horseradish peroxydase (HRP), alkaline phosphatase (AP) dan beta galactosidase. Setiap enzim mempunyai fitur yang unik sesuai dengan kondisi dimana enzim tersebut dapat digunakan secara optimum.
Menurut Burgess (1995) enzim HRP terlihat lebih sensitif pada immunoassay bila dibandingkan dengan enzim AP. Hal ini terjadi karena daya katalitik enzim HRP lebih cepat, maka lebih banyak produk yang digenerasi dalam waktu inkubasi yang lebih pendek. Sebagai tambahan, hidrogen peroksida, suatu ko-substrat pada suatu reaksi, yang dapat menghasilkan suatu inkubasi linier yang lebih cepat. Sensitivitas dapat ditingkatkan dengan membuat masa inkubasi lebih lama. Faktor lain yang mempengaruhi pemilihan konjugat adalah adanya aktifitas enzim endogen didalam sampel yang akan mempengaruhi pengujian dan background signal.
Pada kit ELISA yang digunakan untuk analisis, sumur dalam microplate telah dilapisi dengan poliklonal antibodi bovine IgG dan antibodi tersebut berikatan secara menyeluruh dengan semua subklas dari bovine IgG. Bovine IgG kemudian bereaksi dengan detektor antibodi yang terkonjugasi oleh horseradish peroxydase (conjugated goat anti-bovine IgG peroxydase), dan substrat berisi Tetramethyl Benzidine (TMB).
Berbagai piranti dengan tingkat kecanggihan yang makin meningkat telah tersedia untuk pembacaan hasil dengan objektif. Perbedaan yang paling jelas dapat diperoleh dengan memilih panjang gelombang yang tepat. Meneliti profil absorbsi substrat yang digunakan merupakan hal yang penting, bila memungkinkan dipilih dua panjang gelombang karena hal ini akan variasi antar sumuran. Panjang gelombang primer harus bertepatan dengan absorbansi puncak sampel. Panjang gelombang sekunder bertepatan dengan dataran yang landai. Hal ini merupakan hal yang penting karena dapat menyebabkan pengamatan yang tidak peka dan tidak spesifik. Disamping itu akurasi dan efisiensi ELISA ditentukan oleh spesifisitas dan kemurnian IgG.
Umumnya kisaran kerja sistem ELISA untuk mendeteksi imunoglobulin membutuhkan serum yang sangat encer (1/10000 s/d 1/100.000 untuk serum) sebelum dimasukkan ke dalam sumuran yang dilapisi antibodi penangkap. Ini karena prozona lebar muncul ketika digunakan imunoglobulin dalam jumlah berlebihan pada pengujian (Burgess 1995). Pengenceran tinggi seperti yang sesuai dengan serum tersebut biasanya setara dengan 1-500 ng/ml. Dengan demikian larutan baku harus sesuai dengan konsentrasi imunoglobulin, yaitu harus dapat mendeteksi batas maksimum dan minimum yang mampu dideteksi oleh ELISA reader.
Gambar 6. Reaksi pembentukan warna pada proses ELISA
Idealnya harus dibuat kurva baku yang menggambarkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin menggunakan satu seri pengenceran serum atau imunoglobulin yang dimurnikan. Jika digunakan serum sebagai standar, biasanya dilakukan prakalibrasi untuk konsentrasi imunoglobulin yang diselidiki dengan imunoglobulin murni yang diketahui jumlahnya.
Beberapa pengujian hanya menggunakan dua atau tiga pengenceran serum (atau imunoglobulin yang dimurnikan) untuk menggambarkan bagian linier kurva hubungan antara absorbansi dan konsentrasi imunoglobulin dalam suatu sampel. Namun kurva baku yang dibuat berdasarkan satu seri pengenceran memungkinkan penghitungan konsentrasi imunoglobulin dalam sampel yang berada diluar kisaran liniernya.
Perhitungan dapat dilakukan dengan cara manual maupun dengan program komputer grafik yang menghubungkan absorbansi dengan konsentrasi imunoglobulin. Format ELISA yang sangat umum digunakan adalah Sandwich ELISA terutama untuk identifikasi protein.
2.4 VALIDASI METODE ANALISIS
Metode analisis yang reliabel dan valid digunakan untuk kesesuaian dengan regulasi nasional dan internasional. Laboratorium harus dapat memperlihatkan bahwa data yang diperoleh dari hasil pengujian bermutu. Maka validasi metode merupakan hal yang sangat esensial untuk menghasilkan metode yang dapat dipercaya dan data yang diperoleh reliabel.Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi (SNI 17025: 2008).
Menurut Gunzler (1996), validasi metode adalah menetapkan dengan percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil pengujian yang dimaksudkan. Validasi metode adalah suatu proses untuk mengonfirmasi bahwa suatu metode mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode tersebut (Eurachem 1998).
Jadi tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal, dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti ( Hadi 2007)
Dengan kata lain validasi merupakan proses mendapatkan informasi penting untuk menilai kemampuan sekaligus keterbatasan suatu metode untuk memperoleh hasil yang dapat dipercaya, menentukan kondisi dimana hasil data uji diperoleh dan menentukan batas suatu metode seperti akurasi, presisi, batas deteksi dan kuantitasi, pengaruh matriks dan parameter lainnya. Validasi metode sangat penting karena menyangkut elemen-elemen yang dapat mempengaruhi seperti personil, peralatan/ instrumentasi, analat, kondisi lingkungan, sampel dan waktu yang semuanya merupakan faktor yang dapat menimbulkan variasi pada suatu pengujian.
Menurut Boque (2002), suatu metode analisis dikatakan memuaskan bila memenuhi kriteria kinerja diantaranya:
1. Peka artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar senyawa dalam kadar yang kecil.
2. Tepat (presisi) artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran/ penetapan.
3. Teliti (akurat) artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya (true value),
4. Spesifik, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, dan metode tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain.
5. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak memerlukan waktu dan biaya.
Dengan melakukan validasi metode akan diketahui sejauh mana penyimpangan yang tidak dapat dihindari dari suatu metode pada kondisi normal dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan demikian dapat diperhitungkan dengan pasti tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian. Dalam melaksanakan validasi metode ada beberapa faktor-faktor yang harus diperhatikan adalah keseimbangan antara biaya, waktu, risiko dan aspek teknis misalnya ketepatan dan ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif, ketersediaan reagen serta peralatan yang tersedia.
Pada waktu dilakukan validasi metode ada beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain perbedaan suhu, personil, instrumen, pereaksi yang dipakai dalam metode baku atau metode resmi dengan laboratorium yang akan menggunakannya. Sehingga tujuan validasi adalah untuk memastikan, bahwa laboratorium atau personel/analis dapat menerapkan metode tersebut dengan baik dengan adanya ketersediaan peralatan, fasilitas pereaksi, penguji,yang trampil, dan kompeten.
Validasi metode harus dilakukan bila metode tidak baku, metode yang didesain/dikembangkan laboratorium, metode baku yang digunakan diluar lingkup yang dimaksudkan atau metode baku yang dimodifikasi. Validasi ada dua jenis yaitu validasi primer (primary validation) dan validasi sekunder (secondary validation). Validasi primer adalah validasi yang dilakukan untuk metode analisis baru, hasil pengembangan atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder adalah validasi yang dilakukan untuk verifikasi metode analisis yang diadopsi atau metode standar yang telah divalidasi. Parameter uji yang dilakukan untuk validasi metode kuantitatif dan metode kualitatif tercantum pada Tabel 2.
Tabel 2. Parameter yang diperlukan pada validasi metode analisis untuk uji kualitatif dan kuantitatif
Parameter Uji Kualitatif Uji kuantitatif
Akurasi Tidak perlu Perlu
Presisi Tidak perlu Perlu
Spesifisitas Perlu Perlu
Limit deteksi Perlu Perlu
Limit kuantitasi Tidak perlu Perlu
Linearitas Tidak perlu Perlu
Rentang Perlu Perlu
Keberulangan Perlu Perlu
Robustness Perlu Perlu
Ruggedness perlu Perlu
Beberapa parameter unjuk kerja yang harus diperhatikan ketika melakukan validasi metode yaitu (1) akurasi, (2) presisi, (3) sensitivitas, (4) spesifisitas, (5) limit deteksi (LOD), (6) limit kuantitasi (LOQ), (7) Ruggedness, (8) Robustness, dan (9) linearitas. Menurut USP (2011) tercantum validasi sekunder untuk metode kompendia dan validasi primer untuk metode alternatif.
Presisi adalah tingkat kesamaan (degree of agreement) antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang sampai dengan penggandaan sampling dari suatu sampel homogenat. Presisi dari suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif (relative standard deviation atau coefficient of variation) dari suatu seri pengukuran. Untuk menganalisis hasil validasi, data presisi dapat dievaluasi menggunakan persen standar deviasi relatif (RSD).
Menurut USP (2011) presisi adalah derajat kesesuaian diantara hasil uji individu (berdiri sendiri) jika metode uji dilakukan berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) dari serangkaian pengukuran. Suatu metode analisis dapat diadopsi dalam suatu laboratorium jika nilai RSD < 5%. Menurut Chan (2002) presisi suatu metode khususnya metode ELISA akan memenuhi
keberterimaan apabila RSD yang diperoleh ≤20%. Presisi dapat diukur dari tingkat ripitabilitas atau tingkat reprodusibilitas dari metode analisis yang dilakukan dalam kondisi normal.
Ripitabilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang sama oleh operator (analis) yang sama dengan menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu singkat. Ripitabilitas dapat juga dikatakan penggunaan metode pengujian di dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggunakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah kondisi konstan.
Reprodusibilitas adalah mengukur variasi dalam hasil uji independen yang diperoleh dengan metode yang sama terhadap sampel uji yang identik dalam laboratorium yang berbeda dan peralatan berbeda, atau dengan analis dan peralatan berbeda di dalam laboratorium yang sama. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama. Reprodusibilitas adalah penggunaan metode pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji kolaborasi.
Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analat. Apabila suatu analat secara alami digunakan sebagai uji tantang atau uji profisiensi, metode tersebut harus mampu mendeteksi atau memunculkan kembali (rekoveri) analat pada konsentrasi yang benar atau frekuensinya mendekati akurat. Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima (USP 2011).
Menurut Boque (2002) akurasi atau kecermatan adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh dengan menggunakan metode yang sedang divalidasi dengan nilai sebenarnya yang terdapat dalam sampel uji. Akurasi
biasanya dinyatakan sebagai persen rekoveri. Pada analisis direkomendasikan minimal 9 replikasi atau 3 replikasi dengan 3 konsentrasi dengan kriteria kecermatan sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode (RSD).
Suatu metode analisis dapat diadopsi jika hasil validasi memperoleh nilai rekoveri sesuai dengan keberterimaan. Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara menggunakan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung persen perolehan kembali/rekoveri terhadap sampel yang sudah di spike (Chan 2004). Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergantung kepada konsentrasi analat dalam matrikss sampel dan pada keseksamaan metode (RSD) (Codex 2009). Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level konsentrasi dinilai terhadap rentang persen rekoveri tercantum pada Tabel 3.
Penetapan batas terendah dari kisaran hitung (limit deteksi) adalah konsentrasi terendah dari analat dalam sampel yang dapat terdeteksi, akan tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Sedang Limit kuantitasi biasa juga disebut sebagai batas pelaporan adalah konsentrasi terendah dari analat yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati.
Limit deteksi merupakan jumlah terkecil analat dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko. Limit deteksi merupakan parameter uji batas, dan limit kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil analat dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Penentuan limit deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen limit tersebut ditentukan dengan mendeteksi analat dalam sampel pada pengenceran bertingkat.
Tabel 3. Keberterimaan akurasi berdasarkan persen rekoveri No % Analat Rasio Analat Satuan Rentang keberterimaan (% Rekoveri) 1 100 1 100% (100g/100g) 98 – 102 2 ≥10 10 -1 ≥10 % (10g/100g) 98 – 102 3 ≥1 10 -2 ≥1 % (1g/100g) 97 – 103 4 ≥0,1 10 -3 ≥0,1% (1 mg/g) 95 – 105 5 0,01 10 -4 100 ppm 90 – 107 6 0,001 10 -5 10 ppm 80 – 110 7 0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 110 8 0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 110 9 0,000001 10 -8 10 ppb 60 – 115 10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40 – 120
Pada analisis menggunakan instrumen, limit deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. limit deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Limit deteksi mempunyai nilai ekuivalen dengan rata-rata respon blanko plus 3 kali simpangan baku (SD), dan limit kuantitasi adalah rata-rata blanko plus 10 kali SD (Eurachem 2002).
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analat yang proposional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi matematika. Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebanding / berbanding lurus terhadap konsentrasi analat dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Beberapa metode seperti immunoassay tidak menghasilkan suatu kurva yang linier, pada kasus ini respon analisis dapat digambarkan sebagai fungsi yang sesuai
dengan konsentrasi Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analatnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima analat dalam sampel (USFDA 1996). Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan pengujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang metode menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan yang dinyatakan dalam presisi, akurasi dan linieritas.
Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan antara analat yang dituju dan komponen lain / bentuk-bentuk analat lain yang mungkin ada dalam matriks untuk mengukur secara akurat dan spesifik analat dalam matrikss sampel dengan adanya zat pengganggu.
Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur analat secara cermat dan seksama dengan adanya analat asing/bahan/matriks lain. Spesifisitas dapat dihitung menggunakan jumlah sampel positif yang menunjukkan hasil pengujian positif dibagi dengan hasil pengujian positif terhadap kontrol positif dikalikan 100%. Hasil penghitungan menunjukkan nilai perolehan kembali (rekoveri) dari hasil validasi/verifikasi metode analisis. Pada analisis mikrobiologi, idealnya nilai rekoveri 80% tetapi metode analisis dianggap meyakinkan jika nilai rekoveri berkisar 50 - 95% (AOAC 1999).
Menurut DeSilva (2003) idealnya pada metode ELISA, antibodi yang digunakan harus spesifik dengan analat target, tanpa adanya gangguan dari bahan yang strukturnya hampir sama dengan analat yang ada dalam sampel ataupun bahan yang terdapat dalam matriks. Sensitivitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur analat target dalam jumlah sekecil mungkin.
Ruggedness atau kekasaran adalah suatu ukuran dari kapasitasnya, terhadap sisa yang tidak dipengaruhi oleh konsentrasi yang sedikit, namun variasi-variasi yang mungkin terjadi dalam parameter-parameter metode dan memberikan suatu indikasi dari reliablilitasnya selama penggunaan normal (Chan 2004). Robustness atau ketegaran adalah kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada sampel yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda. Bertujuan untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal terhadap metode (sampel dan metode sama, tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda) . Evaluasi terhadap robustness harus dilakukan selama masa pengembangan metode analisis.
III. BAHAN DAN METODE
3.1 WAKTU DAN TEMPAT
Pelaksanaan penelitian dilakukan di Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM Jl.Percetakan Negara No.23 Jakarta, dari bulan April sampai dengan Agustus 2012.
3.2 ALAT DAN BAHAN
Bahan yang diperlukan untuk penelitian mencakup 3 merk sampel uji produk susu bubuk skim yang diklaim mengandung Imunoglobulin G (Bovine immunoglobulin G) yaitu susu bubuk skim sampel A: kadar IgG 150mg/15g, sampel B: kadar IgG 180mg/15g dan sampel C: kadar IgG 200mg/15g, tercantum pada Lampiran1.
Reagen yang digunakan untuk pengujian IgG adalah kit ELISA komersial yaitu Zeptometrix Immuno-Tek Bovine IgG sandwich ELISA kit. Immuno-Tek Bovine IgG ELISA kit merupakan gabungan bahan-bahan yang terdiri dari: microplate (1x96 well) pre coated with purified goat anti-bovine IgG (Antibodi terhadap bovine IgG yang berasal dari kambing), Detector antibody (12 ml) berisi conjugated goat anti-bovine IgG peroxydase, Bovine IgG standard 125ng/ml (5ml): Assay diluent (100 ml) berisi campuran PBS, triton X-100@ dan 2-chloroacetamide, Plate wash Buffer (125 ml) berisi campuran PBS, Tween 20@ dan 2-chloroacetamide, Substrat (12 ml) berisi Tetramethyl Benzidine (TMB), Stop solution (12 ml) proprietary formulation (hydrochloric acid), air suling. Microplate detektor antibodi yang disediakan dalam kit telah dioptimasi agar bereaksi seimbang dengan semua subklas dari bovine IgG.
Alat yang digunakan antara lain, microplate dan tutup plastik, pipet mikro, tabung mikro dan rak, tips, pipet mikro, gelas Erlenmeyer, labu volumetrik, pipet volumetrik, ELISA reader (Thermo Scientific Multiskan GO UV/Vis Microplate and Cuvette), disposable gloves, inkubator dengan suhu 37±1◦C, dan timer (telah terintegrasi pada ELISA reader) .
