KROMATOGRAFI PLANAR /DATAR) TIM DOSEN FITOKIMIA UHAMKA

(1)

KROMATOGRAFI PLANAR /DATAR)

TIM DOSEN FITOKIMIA UHAMKA

(2)

Surat Taha 20: 114

(3)

TUMBUHAN EKSTRAK ISOLAT SENYAWA MURNI

PEMISAHAN PEMURNIAN

EKSTRAKSI KROMATOGRAFI

ELUSIDASI STRUKTUR

(4)

TUJUAN KROMATOGRAFI

Pemisahan

Analisa: kualitatif, kuantitatif Isolasi/pemurnian

Fase diam (Stationary

phase)

Fase gerak (Mobile

phase)

(5)

Parameter penentu kualitas pemisahan kromatografi

(byknya pelebaran puncak dari masing- masing puncak solut)

Efisiensi

(tingkat pemisahan puncak-puncak yg berdekatan)

Resolusi

(6)

KROMATOGRAFI PLANAR

1. Kromatografi Lapis Tipis

2. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 3. Kromatografi Lapis Tipis Sentrifugal

a.Hitachi CLC-5 Centrifugal Chromatograph

b.Chromatotron

(7)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

(8)

KLT

– KLT dikembangkan oleh Izmailoff dan schraiber tahun 1938

– Cara pemisahan dengan adsorbsi pada lapis tipis adsorben

– Merupakan kromatografi adsorbsi dan partisi – Fase stationer (fs diam ): adsorbent

– Fase gerak : pelarut

– Biasanya untuk Analisa kualitatif

(9)

Kromatografi sistem fase normal (normal phase) → Silika gel – Permukaan silika terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-

OH).

– Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar sehingga mampu membentuk ikatan hidrogen dgn senyawa yg agak polar s/d yg sangat polar.

FASE DIAM

^(lanjutan)

Natural Product Isolation 2^nd edition. 2006.

(10)

Kromatografi sistem fase terbalik (reverse phase) → silika gel termodifikasi

FASE DIAM

^(lanjutan)

(11)

• Kekuatan pelarut (sebagai fase gerak) dapat diukur pada kondisi polaritas atau konstanta dielektrik.

• Konstanta dielektrik tinggi → suatu pelarut POLAR (kekuatan untuk mengelusi besar pada fase diam silika)

• Konstanta dielektrik rendah → suatu pelarut NONPOLAR (kemampuan untuk mengelusi rendah terhadap fase diam silika)

FASE GERAK

^(lanjutan)

(12)

Petunjuk dlm memilih dan mengoptimasi fase gerak:

SISTEM FASE NORMAL

1. Gunakan kloroform:methanol. Awal gunakan kombinasi 8:2, 9:1. Metanol lebih dari 25%

merusak silika gel. Metanol diturunkan jika Rf terlalu besar/bercak terlalu ke atas.

2. Pada pemisahan senyawa yg krg polar, pendahuluan dgn kloroform murni/diklorometan.

3. Sistem lain, dgn menggunkaan n-heksana:etil asetat (7:3, 5:5, 3:7).

4. Utk pemisahan alkaloid, dpt ditambahkan sedikit basa pada fase gerak karena alkaloid basa, sdgkan silika sedikit asam → afinitas tinggi → tailing.

5. Utk pemisahan senyawa polar (fenolik), gunakan kombinasi kloroform:methanol dgn penambahan sedikit air atau BAA.

6. Utk mempertajam pemisahan dpt ditambahkan bbrpa tetes/mikroliter asam atau basa lemah.

SISTEM FASE TERBALIK

1. Gunakan kombinasi methanol:asetonitril 1:1, 3:1, 2:1 atau methanol:asetonitril:air 2:2:1, 1:2:1.

(Aziz dkk., 2011)

(13)

(14)

Cseke L.J., et al. 2006. Natural Product From Plants Ed.2

(15)

Teknik KLT

(16)

(17)

Perhitungan nilai R

_f

(18)

SISTEM DETEKSI

SENYAWA PADA KLT

DETEKSI FISIKA (NON DESTRUCTIVE)

• Deteksi dengan Sinar UV

• Keunggulan: nondestruktif, senyawa yang sudah dideteksi dapat diperoleh dan

diamati kembali melalui proses pemisahan lanjutan.

• Kelemahan: senyawa yang tidak menyerap sinar UV 254 dan 366 nm tidak tampak dan memerlukan deteksi lanjutkan dengan

pereaksi semprot.

DETEKSI KIMIA (DESTRUCTIVE)

• Deteksi dengan Pereaksi deteksi

• Terkadang pemanasan diperlukan untuk memperkuat warna yg dideteksi (dgn oven atau hair dryer).

• Keunggulan: dapat mendeteksi golongan senyawa spesifik dengan pereaksi spesifik

• Kelemahan: senyawa yang telah dideteksi tidak dapat diperoleh kembali.

(19)

(20)

lanjutan

(21)

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

PREPARATIF (KLTP)

(22)

Alat sederhana

Komponen sampel sedikit

Pemurnian senyawa Ketebalan

adsorbent 0,5- 2 mm

Jumlah sampel sedikit

(gr/mg)

KLTP

(23)

Adsorbent

• Silika gel dan alumina

• Ketebalan plat 0,5 – 2 mm

• Ukuran plat 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm

• Plat jadi ( Fertig- platen) atau

dibuat sendiri (spreader)

Penotolan sampel

• Sampel

dilarutkan dalam pelarut

• Konsentrasi sampel 5-10%

• Ditotolkan berupa pita sesempit mungkin

Fasa gerak

• Pelarut biner mis: hex-etil, CHCL3-MeOH dll

• Ditambahkan sedikit asam atau basa

• Eluasi dapat beberapa kali (plat KLT harus dikeringkan dulu)

(24)

Isolasi Senyawa Terpisah Pada KLTP

• Senyawa yang menyerap UV dideteksi dengan adsorbent yang mengandung indicator fluorescent

• Senyawa tidak menyerap sinar UV dapat dideteksi dengan :- semprot plat KLT dg

reagen penampak noda atau menambahkan zat referen

• Pita senyawa terpisah dikerok, diisolasi dari sorbent dengan pelarut yang sesuai

• Disaring

(25)

Terdapatnya impuritis

• Makin polar pelarut yang digunakan, semakin banyak impuritis yang ikut terisolasi.

• Impuritis bisa dari silika gel : ftalat dan polyester

• Disarankan untuk melakukan pemisahan impuritis menggunakan kromatografi

kolom filtrasi gel dengan fs diam

sephadex LH-20

(26)

Ulfah, et al, 2018

(27)

Chromatotron

(Centrifugal Thin-Layer Chromatography)

(28)

KLT sentrifugal

Dibuat untuk mengatasi kelemahan metode KLT preparative.

Alat KLT sentrifugal yang ada dipasaran diproduksi oleh 2 pabrik terkenal:

1. Hitachi CLC-5 Centrifugal Chromatograph

Campuran sorbent dengan solvent dapat dituang diantara dua plat horizontal dengan diameter 30 cm. Sisa solvent dihilangkan dengan proses sentrifugal. Larutan sampel dimuat dalam lapi- lapisan sorbent. Kemudian dielusi dengan fase gerak.

2. Chromatotron

Lapisan sorbent maksimal 4 mm, sedangkan CLC-5 dapat dibuat tebal.

(29)

Teknis Pelaksanaan Chromatotron

– Pemisahan dimana rotor pada posisi miring.

– Untuk pembuatan sorbent, plat ditempatkan pada cetakan yang ketebalannya dapat diatur.

– Sorbent yang telah dicampur air (slurry) dituang ke cetakan dengan jarum yang dapat bergerak lingkar

seperti jarum jam, permukaan sorbent yang terbentuk dapat didatarkan.

– Plat dengan sorbent dapat diaktifkan dalam oven 105⁰ – Sorbent bisa digunakan Silika gel GF-254 & dapat ditambahkan suatu binder.

(30)

– Plat ditempatkan pada sumbu rotor, dibiarkan berotasi dengan kecepatan 800 rpm.

– Fase gerak dialirkan dengan pompa dengan flow rate 1- 10 ml/menit.

– Fase gerak mengalir melalui fase diam, dari tengah lingkaran menuju tepi lingkaran sorbent.

– Sorbent dibasahkan beberapa menit dengan fase gerak untuk menghilangkan impuritis.

– Bagian atas alat ditutupi plat quartz yang tembus

pandang, sehingga dapat diamati gerakan zona senyawa yang berwarna.

(31)

(32)

(33)

– Isolation of β-asaron by Chromatotron Methods

Chromatotron plate with the stationary phase silica gel 60 PF254 and 2 mm thick dried in an oven for 5 minutes at 50°C. The plates were then placed in the chamber and then the motor is turned on and the plate wetted with n-hexane stream. Eluent flow is stopped immediately after the first drops of n-hexane out. The sample chamber is inserted into the hole with the aid of a pipette and applied to the plate after the n-hexane had not come out. using the eluent n- hexane:ethyl acetate as the mobile phase with a ratio of 9: 1, obtained 65 vials were combined into 3

fractions. TLC profiles performed on each fraction using the eluent n-hexane:ethyl acetate 9: 1.

Description:

Stationary Phase: Silica Gel 60 F254

Mobile Phase : n-hexane: ethyl acetate (9:1) Plate Size : 1X7 cm

(a) Appear spotting UV254 (b) (b) Appear spotting UV366

(34)

(35)

Chromatotron

(Centrifugal Thin-Layer Chromatography)

(36)

KLT Densitometri

(37)

KLT Densitometer

– Metode analisis instrumental berdasarkan interaksi radiasi

elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT – Alat dilengkapi dengan spektrofotometer dengan Panjang

gelombang 200 – 700 nm

– Uji kualitatif dan kuantitatif dengan system absorbs sinar atau emisi sinar ( flouresensi)

– Thin layer Chromatograph Scanner popular dengan nama densitometer makin banyak dipakai

(38)

Penggunaan KLT Densitometri

– Analisis kuantitatif : analit-analit dengan kadar sangat kecil yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT

– Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola

(39)

Cara Kerja Densitometer

– Lempeng yang digunakan untuk pemisahan diuji dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu (XY) agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak

– Panjang gelombang deprogram agar terjadi serapan secara maksimum, bila belum diketahui scanning lebih dulu.

– Perhitungan luas atau tinggi puncak otomatis oleh alat

(40)