MIKROSKOP Pertemuan ke-2 MIKROBIOLOGI Dasar

(1)

Prof. Ir. H. Usman Pato, MSc. PhD.

MIKROSKOP

Pertemuan ke-2

MIKROBIOLOGI

(2)

MIKROSKOP

• Mikroskop …..mikros = kecil dan scope = tujuan,

sasaran. Mikroskop adalah alat untuk melihat benda dan mikroba berukuran kecil

• Mikroskop ditemukan oleh Antony van Leeuwenhoek 1765…jauh sebelumnya sudah ada yang mengamati benda/objek berukuran kecil

• Roger Bacon (1214-1294) pertama kali membuat lensa sederhana untuk melihat benda-benda

berukuran kecil

• Zacharias Janssen membuat suatu sistem lensa ganda pertama kali pd 1590

• Athanasius Kircher (1601-1680) mengembangkan instrumen pembesaran pertama dan diduga telah melihat bakteri dengan alat tersebut

(3)

Mikroskop

(4)

PerKembangan

(5)

Bagian

(6)

Jenis

–

Jenis

Mikroskop

• Mikroskop medan terang (bright-field)

• Mikroskop medan gelap (dark-field)

• Mikroskop fase-kontras

• Mikroskop ultraviolet

• Mikroskop Fluoresen

(7)

Mikroskop

Medan

Gelap

• Mikroskop yang digunakan untuk mengamati mikroba hidup yang tidak nampak bila menggunakan mikroskop medan terang, mikroba yang tidak dapat diwarnai

dengan metode pewarnaan standar atau mikroba akan rusak oleh pewarnaan sehingga tidak bisa

diidentifikasi

• Sebagai pengganti kondenser normal digunakan

kondenser medan gelap (darkfield condenser) yang berisi piringan gelap (opaque disk). Piringan ini akan memblok sinar yang akan masuk lensa objectif secara langsung

• OKI, hanya sinar dipantulkan oleh spesimen (sampel) yang akan masuk lensa objektif.

• Akibat tidak ada sinar langsung pada latar belakang maka spesimen nampak bercahaya dan latar

belakangnya gelap

• Mikroskop ini umum digunakan untuk mengamati sel-sel berukuran kecil seperti Treponema pallidum,

(8)

Mikroskop

Fase

-

Kontras

• Mikroskop ini diciptakan oleh Fritz Zernike dan mendapat hadiah nobel 1953

• Digunakan untuk mengamati mikroba hidup tanpa perlu fiksasi dan pewarnaan…karena menyebabkan mikroba mati

• Pada mikroskop ini, sumber iluminasi berupa

seberkas sinar yang datang melalui suatu cincin di dalam kondenser

• Pada lensa objektif dipasang cincin fase yang akan mengubah fase sinar yang melaluinya

• Sinar yang telah melewati sampel dan tidak

dibelokkan akan menembus cincin fase dan terlihat oleh mata sebagai sinar putih

• Karena perbedaan indeks refraksi antara sel mikroba dengan medium disekelilingnya, maka bayangan

(9)

Penampakan

mikroba

menggunakan

mikroskop

(10)

Mikroskop

Ultraviolet

• Mikroskop ini menggunakan sinar UV

sebagai sumber cahaya

• Menghasilkan resolusi dan pembesaran yang

lebih tinggi dibanding mikroskop

biasa….karena sinar UV mempunyai panjang

gelombang yang lebih pendek (180 – 400 nm)

• Karena sinar UV merupakan sinar tidak

tampak, maka bayangan baru dapat dilihat

setelah menghubungkan dengan layar

televisi (ditangkap oleh tabung foto atau

(11)

Mikroskop

Fluoresen

• Fluorescen = senyawa yang dapat menyerap energi dari sinar UV (tak tampak) dan mengeluarkannya sebagai sinar tampak dengan panjang gelombang lebih tinggi

• Mikroskop fluorescen dapat melihat objek yang bersifat fluorescen yang disebabkan oleh senyawa fluorescen alami atau diberi zat warna fluorescen = fluorochromes (misalnya auramin O dan fluorescein isothiocyanate)

• Untuk mengamati Mycobacterium tuberculosis,

penyebab TBC, yang akan nampak berwarna kuning cerah karena menyerap pewarna auramin O

• Untuk mengamati Bacillus anthracis, penyebab antrax, yang akan nampak berwarna hijau apel karena menyerap pewarna fluorescein

(12)

(13)

Mikroskop

Elektron

• Mikroskop elektron berbeda dengan mikroskop biasa karena

digunakan elektron sebgai pengganti sinar dan elektromagnit sebagai pengganti lensa

• Mempunyai resolusi (revolving power) sangat tinggi yaitu 0,001 mikron

Persiapan sampel:

• sel atau sampel yang tebal harus diiris tipis menggunakan “ultramikrotom”

• Diberi pewarna khusus: asam osmat, permanganat, uranium, lantanum atau plumbum (mempunyai berat atom tinggi sehingga dapat

menyebarkan elektron dengan baik dan struktur selsampel menjadi lebih kontras dan mudah dilihat

• Cara lain untuk memperoleh kontras yang baik adalah dengan

pewarnaan negatif menggunakan zat warna Nigrosin untuk mewarnai latar belakang, bukan sel atau sampelnya

Cara pengamatan

• Objek/sampel diletakkan pada kisi logam yang dilapisi kolodion, lalu dimasukkan ke dalam intrumen kemudian dibuat vakum

• Berkas elektron akan menyala dan bayangan dapat dilihat pada layar kecil.

• Usahakan buat segera fotonya karena pengamatan yang terlalu lama objek menjadi rusak karena adanya berkas elektron

(14)

(15)

Beberapa

(16)

Mikroskop

elektron

(17)

(18)

Jenis

-

jenis

Mikroskop

Elektron

• Transmission Electron Microscope (TEM): suatu jenis mikroskop elektron dimana sinar elektron bervoltase tinggi diemisikan oleh katoda yang dihasilkan oleh

lensa magnetik. Sinar elektron lalu ditransmisi melalui melalui spesimen (sampel) yang sangat tipis sehingga dapat membawa/menghasilkan informasi (image)

tentang spesimen tersebut. Selanjutnya informasi ini ditangkap oleh sensor yang sangat sensitive misalnya CCD (charge-coupled device) dan didisplay melalui

monitor atau komputer

• Scanning Electron Microscope (SEM): tidak seperti

dengan TEM dimana elektron dideteksi melalui transmisi sinar, SEM menghasilkan image melalui elektron

sekunder yang diemisikan oleh suatu permukaan

sebagai akibat excitation (benturan) dengan elektron primer. Sinar elektron selanjutnya menghasilkan image 3 D dan diamati lewat komputer atau monitor.

(19)

Jenis

-

jenis

Mikroskop

Elektron

• Scanning Transmission Electron Microscope (STEM). Tipe

mikroskop gabungan SEM & TEM. Pada mikroskop jenis ini, probe elektron kecil discan pada area yang akan diamati tanpa

memberikan iluminasi/sinar secara kontinyu. Elektron yang

ditransmisikan ditangkap bersama dengan spesimen. Selanjutnya signal yang terbentuk didisplay pada monitor atau komputer

• Reflection Electron Microscope (REM): Seperti halnya TEM, teknik ini melibatkan elektron pada permukaan spesimen, tapi sebagai pengganti transmisi (TEM) atau elektron sekunder (SEM),

mikroskop ini menggunakan sinar yang direfleksikan/dibelokkan. Sinar ini selanjutnya melalui spesimen membentuk image yang akan diamati pada kompoter atau monitor

• Scanning Tunneling Microscope (STM): Mikroskop ini menggunakan prinsip-prinsip mekanik kuantum untuk

menentukan besar/tinggi suatu permukaan. Sebuah probe tajam berukuran sangat kecil dipindahkan melalui permukaan spesimen yang akan diamati, selanjutnya dialirkan sinar elektron diantara probe dan permukaan tsb. Selanjutnya akan timbul tegangan listrik yang sangat tergantung pada jarak antara probe dan

permukaan. Selanjutnya terbentuk image yang akan dilihat pada layar monitor atau komputer

(20)

Mekanisme

Kerja

Mikroskop

Objek kecil & mikroba dapat dilihat karena

2 sistem yang bekerja pada mikroskop:

1. Sistem optik/pembesaran

Pembesaran terjadi karena adanya lensa

objektif yang terletak dekat objek dan lensa

okuler (eyepiece lens)

2. Sistem Iluminasi

Sinar/Cahaya (yang berasal dari sinar

matahari atau lampu tungsten) dan

kondenser mengatur iluminasi dari objek

secara tepat

(21)

Fakultas Pertanian Universitas Riau

Cara

Kerja

Mikroskop

• Lensa objektif bekerja untuk

mengatur fokus sinar lampu pada objek yg ditempatkan di belakang titik fokal (titik api) F1 dan

memperbesar objek sehingga menghasilkan bayangan nyata yang selanjutnya diproyeksikan pada bidang fokal dari lensa okuler

• Bayangan nyata yang

diproyeksikan pada bidang fokal F1 dari lensa objektif diperbesar oleh lensa okuler sehingga

membentuk bayangan maya (semu) yang dapat dilihat oleh mata

• Total pembesaran merupakan hasil pembesaran lensa objektif dan lensa okuler

• Contoh:

lensa objektif 40 x lensa okuler 10 x

(22)

Resolving Power

• Karena total pembesaran merupakan hasil

dari pembesaran 2 buah lensa, maka

seharusnya total pembesaran dapat

dinaikkan dengan cara menambah lebih

banyak lensa!

• Kenyataannya tidak bisa…karena suatu

lensa dibatasi oleh sifatnya yang disebut

“Resolving Power”

• Resolving Power = kemampuan suatu lensa

untuk melihat 2 buah objek yang berdekatan

sebagai objek yang terpisah secara jelas

• Resolving power dari mata manusia pada

jarak 25 cm adalah 0,1 mm (100 mikron)

(23)

Resolving Power

• Sifat lensa tergantung pada panjang gelombang

sinar dan “numerical aperture” (NA) dari lensa,

dimana NA = n sin θ dan θ = ½ α, (n = indeks

refraksi dan α = sudut apertur) sehingga

• Resolving power = diameter dari objek

yang terlihat

= panjang gelombang/NA

• Salah satu cara menaikkan NA dari lensa

adalah menggunakan kondenser…kondenser

yang baik menghasilkan persamaan:

(24)

Mengapa

perlu

minyak

imersi

?

• Udara mempunyai indeks refraksi (n) = 1 sedangkan gelas n = 1,5 sehingga

sinar lampu yang datang akan dibelokkan

(direfraksi)…karena n udara < n gelas

• Akibatnya NA dan resolusi lensa objektif menurun! • Jika antara lensa objektif

dan gelas objek diberi minyak imersi yang

mempunyai n = 1,5, maka kehilangan sinar dapat dicegah….dampaknya

resolusi lensa objektif menjadi tinggi dan

(25)

Jenis

-

jenis

lensa

• Lensa okuler

: pembesaran yang umum

10x

• Lensa objektif

(LO)ada 3 jenis:

1. LO berkekuatan rendah: 10x

2. LO berkekuatan tinggi:

40x

, 43x, 45x

3. LO minyak imersi: 95x,97x dan

100x

Misal menggunakan lensa okuler 10x dan lensa objektif 100x, maka pembesaran objek yang diamati = 1000 kali

(26)

Lensa

(27)

Lensa

Positif

_Positif

(

(28)

(29)

(30)

Lensa

(31)

(32)

(33)

(34)

ILUMINASI

• Selain lensa okuler dan lensa objektif, elemen lain yang penting dari mikroskop adalah sinar dan

kondenser

• Lampu tungsten lebih baik digunakan sbg sumber sinar dibanding cahaya matahari karena warna, suhu dan intensitasnya bersifat stabil dan mudah

dikontrol

• Sinar dan kondenser akan mengatur “ILUMINASI” dari objek/spesimen secara tepat

• Bertambahnya pembesaran lensa objektif..akan

menurunkan jarak kerja lensa dan sudut aperture (α) dari lensa objektif bertambah besar

• Besarnya sinar yang masuk diatur oleh diafragma iris yang terletak antara kondenser dan lensa