BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat deskriptif, dengan design study case series, pada penelitian ini akan diperiksa ekspresi TNF-α pada polip hidung.
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di SMF THT-KL RSUP H. Adam Malik Medan dan untuk pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Departemen Patologi
Anatomi FK USU pada Januari 2015 sampai Juni 2015.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalahseluruh penderita polip hidung yang ditegakkan berdasarkan anamnesis, pemeriksaan fisik, pemeriksaan nasoendoskopi dan hasil biopsi histopatologi yang berobat ke divisi Rhinologi SMF THT-KL RSUP H. Adam Malik Medan sejak Agustus 2013 sampai Maret 2015.
3.3.2 Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah sebagian dari populasi yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
Kriteria Inklusi:
1. Penderita yang didiagnosis polip hidung, laki-laki dan perempuan dewasa ( ≥ 18 tahun ).
20
Kriteria Eksklusi:
1. Penderita yang sudah pernah mendapatkan pengobatan dengan kortikosteroid.
2. Penderita polip antrokoanal.
3.3.3 Tehnik pengambilan sampel
Teknik pengambilan sampel dilakukan secara non probability consecutive sampling.
3.3.4 Besar sampel
Besar sampel pada penelitian ini adalah total populasi penelitian.
3.4 Variabel Penelitian 1. Polip hidung 2. Umur
3. Jenis kelamin 4. Tipe histopatologi
5. Pemeriksaan imunohistokimia 6. Ekspresi TNF-α
3.5 Definisi Operasional
- Polip hidung ialah massa lunak yang mengandung banyak cairan di dalam rongga hidung, berwarna putih keabu-abuan dimana diagnosa ditegakkan secara histopatologi oleh dokter spesialis patologi anatomi.
- Skor Intensitas (Intensitas pewarnaan) TNF-α dinilai :
0 : berarti negatif
1 : berarti lemah
2 : berarti sedang
3 : berarti kuat
- Skor luas TNF-α dinilai:
0 : berarti negatif
1 : pewarnaan positif < 10% jumlah sel 2 : pewarnaan positif 10-50% jumlah sel
3 : pewarnaan positif > 50% jumlah sel
22
- Skor intensitas dan skor luas dikalikan untuk memperoleh skor akhir (skor imunoreaktif). Skor imunoreaktif 4 atau lebih dinilai positif atau overexpression TNF-α.
Hasil ukur : 0 – 9
Ekspresi TNF-α negatif : 0 – 3 Ekspresi TNF-α positif / overekspresi : 4 – 9 (Tan & Putti, 2005)
- Usia adalah umur individu yang terhitung mulai saat dilahirkan sampai berulang tahun. Usia dihitung dalam tahun menurut ulang tahun terakhir.
Dibagi menjadi : - < 40 tahun - ≥ 40 tahun
- Jenis kelamin adalah ciri biologis yang membedakan orang yang satu dengan lainnya, terdiri atas :
Laki-laki Perempuan
3.6 Alat dan Bahan Penelitian 3.6.1 Alat penelitian
Penelitian ini membutuhkan beberapa peralatan sebagai berikut: 1. Status penelitian
2. Sistem visualisasi immunohistokimia (Envision kit), mesin pemotong jaringan (microtome), silanized slide, mikroskop cahaya (Olympus®), Tissue Processing, Tissue Embedding, Retrivel PT. Link.
3.6.2 Bahan penelitian
1. Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah
2. Untuk pemeriksaan hispatologi Formalin 10%, blok parafin, aqua destilata, hematoxyllin-eosin.
3. Untuk pemeriksaan immunohistokimia Xylol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%,H202 0,5% dalam methanol, Phosphat Buffer Saline (PBS), antibodi TNF-α (The
Envision + Dual link system dari Santa Cruz®), antibodi sekunder, Envision, Choromogen Diamino Benzidine (DAB), Lathium Carbonat jenuh, Tris EBTA, Hematoxylin, aqua
destillata.
4. Sebagai kontrol positif dalam pemeriksaan Imunohistokimia ini
digunakan jaringan adenokarsinoma kolon pada manusia (human colon adenocarcinoma tissue) yang dilakukan pemeriksaan imunohistokimia.
3.6.3 Prosedur kerja pewarnaan TNF-α
1. Deparafinisasi slide (Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3) @ 5menit 2. Rehidrasi (Alkohol absolute, Alkohol 96%,
Alkohol 80%, Alkohol 70%)
@ 4menit
3. Cuci dengan air mengalir 5 menit
4. Masukkan slide ke dalam PT Santa Cruz Epitope Retrieval : set up Preheat 65°C, Running time 98°C selama 15 menit.
± 1 jam
5. Pap Pen. Segera masukkan dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4
5 menit
6. Blocking dengan peroxidase block 5-10 mnt 7. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 5 menit 8. Blocking dengan Normal Horse Serum (NHS)
3%
15 menit
9. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 5 menit
10. Inkubasi dengan Antibodi TNF-α dengan pengenceran 1:40
1 jam
24
/Tween 20
12. Santa Cruz Real Envision Rabbit/Mouse 30 menit 13. Cuci dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4
/Tween 20
5-10 menit
14. DAB + Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20 µL DAB : 1000 µL substrat (tahan 5 hari di suhu 2-8°C setelah dicampur)
5 menit
15. Cuci dengan air mengalir 10 menit
16. Counterstain dengan Hematoxylin 3 menit
17. Cuci dengan air mengalir 5 menit
18. Lithium carbonat (5% dlm aqua) 2 menit
19. Cuci dengan air mengalir 5 menit
3.8 Cara Pengumpulan Data
Data yang dikumpulkan adalah data primer yang diperoleh dari pemeriksaan langsung ekspresi TNF-α polip hidung dengan pemeriksaan imunohistokimia. Data akan dianalisa secara deskriptif untuk menjelaskan distribusi frekuensi polip hidung berdasarkan karakteristik dan untuk data numerik akan dihitung nilai rerata serta standard deviasi.
3.9 Cara Analisis Data
Data yang diperoleh akan disajikan dalam bentuk tabel dan diagram. Data yang diperoleh dianalisis secara statistik untuk mengetahui ekspresi
TNF-α dan akan diolah dengan komputer.
BAB 4
HASIL PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian yang bersifat deskriptif. Sampel penelitian dikumpulkan dengan mengambil jaringan polip hidung melalui tindakan biopsi pada penderita polip hidung di poliklinik T. H. T. K. L RSUP H. Adam Malik Medan. Sampel yang telah terkumpul dikirim ke Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara (FK USU) untuk pemeriksaan histopatologi serta pemeriksaan immunohistokimia. Data penelitian ini seluruh kasus polip hidung yang
telah memenuhi kriteria inklusi.
4.1 Hasil Statistik Deskriptif
Berdasarkan tabel di atas dijumpai skor imunoreaktif TNF-α (skor luas dikalikan dengan skor intensitas) pada penderita polip hidung terbanyak pada kelompok ekspresi positif (overexpression) yaitu sebanyak 28 penderita (84,8%) sedangkan kelompok ekspresi negatif yaitu sebanyak 5 penderita (15,2%).
Tabel 4.1.2 Distribusi frekuensi usia penderita polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α. sebanyak 11 penderita (39,3%). Umur termuda pada penelitian ini adalah 18 tahun dan yang tertua adalah 78 tahun dengan rerata umur adalah 46 tahun.
28
Dari tabel di atas didapatkan ekspresi TNF-α positif terbanyak dijumpai pada laki-laki sebanyak 19 penderita (67,9%) sedangkan pada perempuan sebanyak 9 penderita (32,1%). Sedangkan dari 5 orang penderita polip dengan ekspresi TNF-α negatif dijumpai pada laki-laki sebanyak 3 penderita (60%) dan pada perempuan sebanyak 2 penderita (40%).
Tabel 4.1.4 Distribusi frekuensi tipe histopatologi polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α
Gambaran histopatologi
Ekspresi TNF-α
(+) (-)
N % n % Total
Tipe 1 Tipe 2
18 10
64,3 35,7
5 100 - -
23 10
Tabel 4.1.5 Distribusi frekuensi stadium polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α
Stadium Polip
Ekspresi TNF-α
(+) (-)
n % n % Total
Stadium 1 Stadium 2 Stadium 3
1 13 14
3,6 46,4 50,0
- 5 -
- 1 100 18 - 14
BAB 5 PEMBAHASAN
5.1 Distribusi frekuensi penderita polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α.
Dari penelitian ini diperoleh kelompok terbanyak dijumpai ekspresi positif (overexpression) TNF-α pada polip hidung yaitu sebanyak 28 orang (84,8%) sedangkan ekspresi negatif sebanyak 5 orang (15,2%).
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Chengsua et al. (2001) yang mendapatkan ekspresi TNF-α meningkat
pada polip hidung.
Studi menunjukkan bahwa terdapat jumlah yang tinggi dari sel-sel
radang pada lamina propria polip hidung, diantaranya adalah eosinofil, neutrofil dan limfosit. Eosinofil merupakan sel radang yang paling banyak dijumpai. Histopatologi polip hidung ditandai dengan hiperplasia sel goblet dan penipisan membran basal dengan infiltrasi eosinofil yang dominan. Berdasarkan histopatologi sekitar 85-90% adalah polip eosinofilik. Hal ini disebabkan meningkatnya migrasi eosinofil kedalam jaringan, bertambah lamanya usia eosinofil atau keduanya. Disebutkan bahwa TNF-α meningkatkan produksi VCAM-1 dan RANTES pada fibroblast hidung dan mengaktivasi transmigrasi dari eosinofil di mana lebih lanjut akan memproduksi TNF-α dan mempercepat penumpukan dari eosinofil pada polip hidung. Selain itu TNF-α juga meregulasi infiltrasi dari neutrofil dengan meningkatkan produksi selektin pada endotel. Dalam hal ini peningkatan dari TNF-α dikaitkan dengan peningkatan dari infiltrasi eosinofil dan neutrofil pada polip hidung (Ferguson and Orlandi 2006, Peric et al. 2010, Peric et al. 2012, Baratawidjaja & Rengganis 2012). Dari hasil penelitian ini terlihat TNF-α dijumpai meningkat (overexpression) pada polip hidung sebanyak 84,8%, yang menggambarkan bahwa TNF-α memiliki peranan penting dalam terbentuknya suatu polip hidung.
Pada penelitian ini diperoleh kelompok usia yang terbanyak dengan ekspresi TNF-α positif adalah ≥ 40 tahun sebanyak 17 orang (60,7%). Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian sebelumnya oleh Munir, yang dalam penelitiannya di RS H. Adam Malik Medan melaporkan insiden polip tertinggi pada rentang usia 35 dan 44 tahun. Pada penelitian sebelumnya oleh Bruunsgaard, dkk. disebutkan bahwa usia berhubungan dengan peningkatan proses inflamasi di sirkulasi darah. Di mana penuaan dikaitkan dengan peningkatan dari beberapa sitokin pro-inflamasi di dalam sirkulasi darah, diantaranya IL-6, sitokin antagonis, protein fase akut, neopterin dan termasuk di dalamnya peningkatan dari level TNF-α
maupun reseptor TNF terlarut di dalam sirkulasi darah. Peningkatan dari aktivitas inflamasi pada usia lanjut telah merefleksikan suatu proses patologis yang terkait usia (Bruunsgaard et al. 2000, Bruunsgaard et al. 2003, Munir 2008).
Selain itu, hal yang perlu diperhatikan adalah bahwa pada penelitian ini secara keseluruhan dari 33 total sampel dijumpai kelompok umur tertinggi adalah ≥ 40 tahun sebanyak 20 orang (60,6%).
5.3 Distribusi frekuensi jenis kelamin penderita polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α
Dari hasil penelitian ini diperoleh kelompok polip dengan ekspresi
TNF-α positif tertinggi dijumpai pada laki-laki yaitu sebanyak 19 orang (67,9%). Hasil penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya oleh Busaba dkk. (2008) dari 514 pasien dewasa diperoleh diagnosis terbanyak pada 273 pasien perempuan adalah RSK tanpa polip hidung sedangkan pada 241 pasien laki-laki diperoleh diagnosis terbanyak adalah RSK dengan polip hidung. Munir dalam penelitiannya mendapatkan polip hidung terbanyak dijumpai pada laki-laki sejumlah 17 orang (65%). Bachert (2011) melaporkan bahwa prevalensi polip hidung cenderung meningkat dengan bertambahnya umur dan hampir dua kali lipat lebih
32
karena laki laki lebih sering terpapar asap rokok, debu dan bahan-bahan kimia lainnya.
Hal yang juga perlu diperhatikan pada penelitian ini, secara keseluruhan dari 33 total sampel dijumpai laki-laki sebagai kelompok terbanyak yaitu 22 orang (66,7%).
5.4 Distribusi frekuensi tipe histopatologi polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α
Pada penelitian ini, polip hidung terbanyak dengan ekspresi TNF-α positif dijumpai pada polip tipe 1 (Eosinophilic/Allergic polyp) sebanyak 18 jaringan (64,3%) diikuti dengan tipe 2 (Fibroinflammatory polyp) sebanyak 10 orang (35,7%). Tidak dijumpai tipe 3 (Polyp with Hyperplasia of Seromucinous Glands) maupun tipe 4 (Polyp with Stromal Atypia) pada
penelitian ini.
TNF-α merupakan sitokin pro-inflamasi dengan efek biologis pada bermacam jenis sel. Pada eosinofil, TNF-α meningkatkan rekrutmen dari eosinofil ke jalan nafas dengan diperantarai oleh pelepasan dari mediator kimia seperti yang juga didapatkan pada penelitian sebelumnya oleh Yoshifuku dkk. mendapatkan TNF-α meningkatkan sekresi dari Vascular Cell Adhesion Molecule One (VCAM-1) dan Regulated on Activation Normal T-Cell Expressed and Secreted (RANTES) oleh fibroblas yang berasal dari polip hidung yang kaya eosinofil (phE) maupun polip hidung non-eosinofilik (phNE). Munir melaporkan polip alergi lebih dominan (62%) di RSUP H. Adam Malik Medan. Studi histomorfolologis oleh Kahveci dkk., diperoleh jaringan polip dari semua tipe terdiri dari eosinofil, sel plasma dan limfosit. Percobaan oleh Ohori dkk. seperti yang dikemukakan oleh Peric dkk., mengemukakan bahwa TNF-α meningkatkan produksi VCAM-1 pada fibroblast hidung dan mengaktivasi transmigrasi dari eosinofil di mana lebih lanjut akan memproduksi TNF-α dan mempercepat penumpukan dari eosinofil pada polip hidung
ini dimana polip tipe 1 (Allergic polyp) dengan eosinofil sebagai sel yang dominan, dijumpai sebagai kelompok yang paling tinggi dengan ekspresi TNF-α positif sebanyak 64,3%.
Baratawidjaja & Rengganis (2012) dalam bukunya menulis TNF-α dan IL-1 yang dilepas oleh makrofag pada daerah inflamasi akan mengaktifkan sel endotel untuk memproduksi selektin (ligan integrin dan kemokin) yang berperan dalam meregulasi migrasi neutrofil dari vaskular ke daerah inflamasi. Hal ini menunjukkan bahwa TNF-α juga berperan penting dalam meregulasi infiltrasi netrofil. Pada penelitian ini diperoleh polip tipe 2 yaitu Fibroinflammatory polyp dengan netrofil sebagai sel yang dominan,
sebanyak 10 sampel di mana keseluruhannya dengan ekspresi TNF-α positif (overexpression).
5.5 Distribusi frekuensi stadium polip hidung berdasarkan ekspresi TNF-α
Dari hasil penelitian ini diperoleh polip hidung dengan ekspresi TNF-α positif dijumpai terbanyak pada stadium 3 sebanyak 14 sampel (50,0%) diikuti stadium 2 sebanyak 13 sampel (46,4%) dan stadium 1 sebanyak 1 sampel (3,6%).
34
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil analisis data dan pembahasan maka dapat diambil kesimpulan bahwa :
1. Pada penelitian ini, penderita polip hidung di RSUP H. Adam Malik, Medan sejak Juli 2013 sampai Januari 2015 dijumpai ekspresi positif (overexspression) TNF-α (84,8%).
2. Ekspresi TNF-α positif lebih banyak dijumpai pada kelompok
umur ≥40 tahun (60,7%)
3. Ekspresi TNF-α positif lebih banyak dijumpai pada penderita
polip laki-laki (67,9%).
4. Ekspresi TNF-α positif lebih banyak dijumpai pada polip hidung tipe alergi (64,3%).
Ekspresi TNF-α positif lebih banyak dijumpai pada polip hidung stadium 3 (50%)
6.2 Saran