HIJAU KLOROFIL. Klorofil

(1)

Pewarna Alami untuk Pangan_____________________________________________________

HIJAU KLOROFIL

Klorofil

Klorofil adalah pigmen berwarna hijau yang terdapat dalam kloroplas bersama-sama dengan karoten dan xantofil pada semua makhluk hidup yang mampu melakukan fotosintetis. Pada semua tanaman hijau, sebagian besar klorofil berada dalam dua bentuk yaitu klorofil a dan klorofil b. Klorofil a bersifat kurang polar dan berwarna biru hijau, sedangkan klorofil b bersifat polar dan berwarna kuning hijau. Klorofil berwarna hijau karena menyerap secara kuat daerah merah dan biru dari spektrum cahaya visibel.[87,b]

Rumus empiris klorofil a adalah C55H72O5N4Mg, sedangkan

klorofil b adalah C55H70O6N4Mg. Pigmen tersebut merupakan suatu

porfirin yang mengandung cincin dasar tetrapirol. Keempat cincinnya berikatan dengan ion Mg2+. Cincin isosiklik yang kelima berada dekat dengan cincin pirol ketiga. Subtituen asam propionat diesterifikasi oleh diterpen alkohol fitol (C20H39OH) yang bersifat

hidrofobik dalam cincin keempat (Gambar 10).[87]

Seperti pigmen alami lainnya, klorofil juga mudah terdegradasi akibat paparan panas, cahaya, oksidator, dan kondisi pH lingkungan. Gambar 11 memperlihatkan mekanisme degradasi klorofil.

Secara umum terdapat tiga reaksi yang dapat menjelaskan degradasi pigmen klorofil, yaitu reaksi peofitinasi, pembentukan klorofilid, dan oksidasi. Reaksi peofitinasi adalah reaksi pembentukan peofitin. Peofitin adalah bentuk klorofil yang

©SEAFAST

Center

(2)

kehilangan ion Mg2+_{sehingga warna yang diekspresikan bukan}

hijau melainkan hijau kecoklatan. Klorofil a diketahui mengalami reaksi peofitinasi lima sampai sepuluh kali lebih cepat dibandingkan dengan klorofil b. Reaksi peofitinasi ini dapat terjadi ketika klorofil diperlakukan dengan asam. Ion Mg2+ yang berada di tengah-tengah molekul akan lepas dan digantikan oleh ion hidrogen. Di larutan HCl 13%, reaksi peofitinasi dapat terjadi hanya dalam waktu 1-2 menit. Reaksi ini akan berjalan lebih cepat lagi jika terkena panas.[88]

Panas mempercepat reaksi peofitinasi karena panas dapat mendenaturasi protein. Pada matriks tanaman, klorofil terdapat dalam bentuk berikatan dengan molekul protein. Ketika daun dipapar dengan panas, misalnya direbus, protein yang melindungi klorofil akan terdenaturasi sehingga klorofil berada dalam bentuk bebas. Klorofil bebas bersifat tidak stabil dan mudah diserang oleh asam. Akibatnya Mg2+ yang terdapat di dalam molekul klorofil dapat dengan mudah digantikan oleh ion hidrogen.[90]

Gambar 10. Rumus struktur klorofil.[71]

©SEAFAST

Center

(3)

Gambar 11. Bagan reaksi degradasi klorofil.[39]

©SEAFAST

Center

(4)

Penggunaan garam alkali seperti magnesium karbonat dan kalsium hidroksida pada pengolahan sayur hijau diketahui dapat mencegah ion magnesium di klorofil lepas dan digantikan oleh ion hidrogen. Meskipun metode ini menghasilkan produk dengan warna yang menarik, namun warna tersebut tidak bertahan lama selama penyimpanan. Hasil penelitian Harborne (1973) menunjukkan bahwa klorofil dapat diekstrak dari daun segar dengan menggunakan aseton 80% atau metanol dengan sedikit penambahan CaCO3 untuk mencegah terbentuknya peofitin. Selain

itu, garam seng juga dapat menstabilkan klorofil. Seng akan membentuk komplek dengan peofitin sehingga warna hijau tetap stabil. Food and Drug Administration (FDA) telah mengatur batas penggunaan garam seng di produk sayur kaleng, yaitu 75 ppm. Pada prakteknya, untuk membentuk kompleks dengan peofitin, dibutuhkan minimal 25 ppm garam seng atau 100 ppm untuk hasil yang maksimal.[91,92]

Reaksi jenis kedua yaitu reaksi pembentukan klorofilid. Klorofilid dapat terbentuk dari reaksi hidrolisis pada suasana asam maupun basa. Biasanya reaksi pembentukan klorofilid terjadi akibat aktivitas enzim klorofilase. Enzim klorofilase yang terdapat hampir di semua tanaman mampu menghidrolisis rantai fitol dari klorofil sehingga terlepas membentuk klorofilid dan fitol. Pada kondisi normal, enzim klorofilase diduga terikat kuat secara fisik pada lipoprotein lamela sehingga tidak bereaksi menghidrolisis klorofil. Enzim ini akan aktif pada temperatur kamar jika berada pada pelarut organik atau pada temperatur 65-75 oC pada pelarut air.[87,93]

Berbeda dari reaksi peofitinasi, klorofilid yang dihasilkan pada reaksi hidrolisis ini masih mengekspresikan warna hijau seperti

©SEAFAST

Center

(5)

klorofil tetapi lebih larut air.[93]_{Lebih lanjut klorofilid dapat}

menjadi peoforbid, yaitu senyawa klorofilid yang kehilangan ion Mg2+ dan digantikan dengan ion hidrogen. Meskipun demikian, perubahan klorofilid menjadi peoforbid relatif lebih sulit dibandingkan klorofil menjadi peofitin. Oleh karena itu salah satu usaha untuk menstabilkan warna hijau adalah dengan mengubah klorofil menjadi klorofilid.

Reaksi oksidasi klorofil menghasilkan produk yang tidak berwarna akibat dari teralomerasinya klorofil dan pecahnya cincin tetrapirol.[93] Reaksi oksidasi ini dapat terjadi secara enzimatis maupun non enzimatis. Oksidasi secara enzimatis melibatkan enzim lipoksigenase (linoleat oksidoreduktase) yang terdapat di sebagian besar sayuran dan buah-buahan. Enzim ini mengkatalisa reaksi oksidasi ketika terdapat oksigen dan lemak, terutama asam lemak linoleat dan linolenat. Blansir dapat dilakukan terhadap bahan untuk menginaktivasi enzim lipoksigenase. Waktu pemblansiran penting untuk diperhatikan karena blansir yang terlalu lama tidak hanya akan menginaktivasi enzim lipoksigenase, namun juga menginduksi terjadinya reaksi oksidasi non enzimatis. Menurut Eskin (1979) pemblansiran selama 45 detik sampai 1 menit cukup untuk menginaktivasi enzim lipoksigenase.[94] Selain disebabkan oleh panas, reaksi oksidasi non-enzimatis juga dapat terjadi secara spontan oleh oksigen yang terdapat di atmosfer selama penyimpanan meskipun dalam kondisi gelap. Proses oksidasi klorofil ini dapat dihambat dengan karotenoid.[87]

Klorofil yang disubtitusi dengan tembaga (Cu) atau klorofilin merupakan bentuk klorofil yang stabil jika dibandingkan dengan klorofil alami. Klorofilin cukup stabil di kondisi netral dan basa. Kelemahan klorofilin adalah menimbulkan sensasi rasa logam

©SEAFAST

Center

(6)

akibat keberadaan ion Cu. Flavor yang mengganggu ini dapat ditutupi dengan menambahkan flavor pada makanan seperti flavor buah sehingga off flavor dapat tertupi. Klorofilin cocok digunakan sebagai pewarna pada permen dengan flavor jeruk. Flavor jeruk dapat mengaburkan rasa logam yang ditimbulkan klorofilin.[38]

Daun Suji

Tanaman suji atau Pleomela angustifolia merupakan tanaman perdu dari keluarga Liliaceae yang banyak tumbuh liar di Pulau Jawa. Tinggi tanaman ini dapat mencapai 2-7 meter dan jika hanya tumbuh

sendiri dapat

berbentuk pohon kecil

yang banyak

cabangnya. Daun

tanaman suji berwarna hijau gelap, berbentuk lancet garis, kaku, dan meruncing dengan panjang rata-rata 10-25 cm dan lebar 0,9-1,5 cm.

Warna hijau pada daun suji merupakan manifestasi dari keberadaan pigmen klorofil. Hasil penelitian Prangdimurti et al. (2006) menunjukkan bahwa daun suji segar yang memiliki kadar air basis basah sebesar 73,25%, mengandung 3.773,9 ppm klorofil

©SEAFAST

Center

(7)

yang terdiri atas 2.524,6 ppm klorofil a dan 1.250,3 ppm klorofil b.[95]

Klorofil daun suji dapat diekstrak dengan menggunakan larutan NaHCO3. Semakin tinggi konsentrasi NaHCO3 yang

ditambahkan menyebabkan semakin banyak klorofil yang dapat diekstrak dan semakin basa larutan yang didapat. Rufaida (2008) menyatakan bahwa ekstraksi klorofil daun suji optimum dilakukan dengan menggunakan NaHCO3 pada konsentrasi 0,5% (b/v). Hasil

ekstrak dengan metode tersebut menghasilkan ekstrak dengan kandungan klorofil sebesar 3,069 mg/10 mL dan pH larutan 8,02.[96]

Penambahan logam Cu2+ ketika mengekstrak klorofil dari daun suji diketahui dapat meningkatkan kestabilan warna hijau klorofil. Tembaga atau Cu merupakan salah satu logam yang termasuk dalam golongan logam transisi. Logam transisi cenderung membentuk kompleks dengan molekul lain dan bertindak sebagai atom pusat dari kompleks tersebut. Oleh karena itu Cu cenderung akan menggantikan Mg pada pusat porfirin klorofil. Ikatan antara atom Cu dengan inti porfirin dari molekul klorofil jauh lebih kuat dan stabil dibandingkan dengan Mg-porfirin.[97]

Hasil penelitian Rufaida (2008) menunjukkan bahwa secara visual semakin banyak ion Cu2+ yang ditambahkan maka warna hijau ekstrak klorofil semakin stabil. Pada hari pertama penyimpanan ekstrak klorofil di temperatur ruang, ekstrak tanpa penambahan ion Cu2+ terlihat memiliki endapan berwarna hijau di bagian bawah tabung. Sebaliknya, pada ekstrak yang ditambahkan ion Cu2+ sebesar 50, 100, dan 150 ppm tidak terlihat endapan dan warna hijau masih terlihat stabil. Setelah tujuh hari penyimpanan pada temperatur ruang, endapan pada ekstrak tanpa penambahan

©SEAFAST

Center

(8)

Cu2+_{berubah warna menjadi coklat. Endapan juga terbentuk pada}

ekstrak dengan penambahan Cu2+ sebesar 50 ppm walau warna endapan masih hijau. Supernatan pada ekstrak tanpa Cu2+ dan ekstrak yang mengandung 50 ppm Cu2+ berubah warna menjadi coklat zaitun. Pada ekstrak dengan penambahan ion Cu2+ sebesar 100 dan 150 ppm tidak terdapat endapan dan warna hijau masih terlihat stabil.[96]

Pembentukan klorofilid juga dapat dilakukan untuk meningkatkan kestabilan ekstrak klorofil daun suji. Pembentukan klorofilid melibatkan enzim klorofilase. Ekstraksi yang melibatkan enzim klorofilase membutuhkan waktu inkubasi agar enzim tersebut dapat bekerja secara optimum karena reaksi enzim ini berlangsung lambat.[98] Kecepatan reaksi yang lambat ini disebabkan oleh ukuran molekul enzim yang besar sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama agar terjadi interaksi substrat dan enzim.[99] Namun demikian, waktu inkubasi juga tidak boleh terlalu lama karena dapat menurunkan laju reaksi dan penyimpangan terhadap aktivitas yang diperoleh. Laju reaksi menurun karena selama hidrolisis terbentuk fitol yang bertindak sebagai inhibitor reaksi.[100] Masa inkubasi optimum menurut Hakim (2005) adalah 30 menit pada temperatur 75 oC.[101] Temperatur 75 oC merupakan temperatur aktivitas maksimum dari enzim klorofilase. Merujuk pada penelitian Prangdimurti et al. (2005), larutan pengekstrak klorofil dari daun suji yang optimum yaitu 0,75% Tween 80 dalam larutan natrium sitrat 12 mM. Tween 80 bersifat emulsifier sehingga dapat membantu klorofil yang bersifat hidrofobik untuk larut air. Natrium sitrat 12mM diduga dapat meningkatkan aktivitas enzim klorofilase dalam menghidrolisis rantai fitol.[102] Lopez et al. (1992) melaporkan

©SEAFAST

Center

(9)

bahwa tanpa kehadiran natrium sitrat dalam uji aktivitas enzim klorofilase, aktivitasnya turun sampai 50%.[103]

Daun Pandan

Pandan (Pandanus amaryllifolius) merupakan tanaman perdu menjalar

yang memiliki daun

berwarna hijau, berbetuk tipis memanjang, bertepi rata, ujungnya berduri halus dan kalau diremas berbau

wangi. Panjang daun

pandan berkisar antara 40-80 cm dengan lebar sekitar 4,5 cm. Jika dibiarkan,

tanaman pandan dapat mencapai ketinggian 1,75 m dengan batang menjalar dan pada pangkalnya keluar akar. Tanaman ini digolongkan sebagai keluarga Pandanaceae.[104] Di Indonesia, umumnya pandan ditanam di pekarangan rumah dan digunakan sebagai penyedap, pewangi masakan, dan pewarna hijau pada makanan. Sebutan untuk tanaman pandan ini beragam di berbagai daerah, seperti seuke bangau (Aceh), pandan jau (Batak), pandan harum (Sumatra Tengah), pandan musang (Minang Kabau), ponda (Gorontalo), bonak (Timor), dan nao moni (Ambon).[105]

Seperti daun suji, warna hijau di daun pandan juga merupakan akibat dari keberadaan pigmen klorofil. Penggunaan daun pandan

©SEAFAST

Center

(10)

bersama-sama dengan daun suji telah diaplikasikan di masyarakat untuk memberikan warna hijau pada kue basah dan diketahui memberikan efek sinergis. Secara tradisional penggunaan warna hijau ini didapat dengan menumbuk daun pandan dan daun suji. Hasil tumbukan ditambah air dan kemudian diperas. Air yang didapat akan berwarna hijau dan dapat langsung dicampurkan ke dalam adonan makanan seperti dadar gulung, kue apem, kue talam susun, dan kue bikang.[106] Jika air ekstrak tersebut tidak langsung digunakan, pengawetan dapat dilakukan dengan menambahkan kapur sirih ke dalam larutan dan disimpan di dalam refrigerator.

Peningkatan umur simpan larutan pandan dapat dilakukan dengan metode pasteurisasi. Vongsawasdi et al. (2010) meneliti pengaruh pasteurisasi terhadap degradasi klorofil pada jus pandan. Sebelum daun pandan dibuat jus, daun dicuci dan direbus selama 4 menit. Daun kemudian dipotong kecil-kecil dan dicampur air dengan perbandingan 1:4 (w/w). Campuran tersebut dihomogenisasi dan disaring untuk mendapatkan larutan pandan dengan total padatan 12±2 oBrix. Pasteurisasi dilakukan selama 30 menit pada empat temperatur yang berbeda, yaitu 63, 70, 80, dan 90 oC. Dari hasil penelitian tersebut diketahui bahwa kandungan klorofil pada jus semakin menurun dengan meningkatnya temperatur pasteurisasi. Akibatnya warna hijau jus mengalami pemudaran seiring dengan rusaknya klorofil. Degradasi klorofil ini mengikuti reaksi orde pertama dengan kecepatan degradasi 0,0282-0,0429 menit-1.[107]

Untuk skala komersial, pandan dalam bentuk larutan kurang disukai karena sulit dalam transportasi dan memiliki umur simpan yang pendek. Pembuatan tepung pandan merupakan salah satu

©SEAFAST

Center

(11)

solusi untuk meningkatkan keawetan dan memperluas aplikasi daun pandan sebagai pewarna dan pemberi aroma. Untuk memperoleh mutu tepung pandan dengan warna dan aroma yang baik, pengeringan harus dilakukan pada temperatur serendah mungkin. Menurut Buckle et al. (1987), semakin lama dan semakin tinggi temperatur pengeringan, kadar air akan semakin rendah dan intensitas warna hijau semakin menurun. Penurunan intensitas warna tersebut terjadi karena pigmen pada daun pandan teroksidasi selama pengeringan. Jika melalui pengeringan dengan oven vakum, dapat digunakan temperatur pengeringan sebesar 60

o

C dengan lama pengeringan 1,5-3,5 jam. Pengeringan dengan oven konveksi harus menggunakan temperatur yang lebih rendah, yaitu berkisar antara 30-50 oC dengan lama pengeringan 3,5-6,5 jam.[108,105]

Mikroenkapsulasi pigmen klorofil daun pandan dapat dilakukan untuk mendapatkan pewarna hijau dalam bentuk kering dan mengandung pigmen yang lebih banyak dibandingkan dengan tepung daun pandan. Mikroenkapsulasi dibuat dengan menggunakan pengering spray dryer. Ekstrak klorofil dibuat dengan metode Senklang dan Anprung (2010) dengan menggunakan enzim pektinase.

Pada metode Senklang dan Anprung (2010), klorofil direaksikan dengan logam sehingga membentuk komplek logam-klorofil untuk meningkatkan kestabilannya. Pandan yang telah dicuci dan dipotong kecil dihancurkan dan dicampur air dengan perbandingan pandan:air sebesar 1:4. Campuran ini kemudian direaksikan dengan 300 ppm ZnCl3 pada pH 5 dan temperatur 110 o

C selama 15 menit. Komplek Zn-klorofil diekstrak secara enzimatis dengan 2,5% (v/w) enzim pektinase.[109]

©SEAFAST

Center

(12)

Metode pembuatan mikroenkapsulasi komplek Zn-klorofil dilaporkan oleh Porrarud dan Pranee (2010). Pada penelitian tersebut digunakan tiga macam zat penyalut, yaitu gum arab, maltodekstrin, dan pati modifikasi octenyl succinic anhydride

(OSA). Sebagai emulsi digunakan Tween 80. Campuran dikeringkan dengan spray dryer pada temperatur inlet 150±5 οC dan temperatur outlet 90±5 οC. Dari hasil pengamatan, diketahui bahwa penggunaan pati modifikasi OSA menghasilkan bubuk yang lebih bulat dan halus jika dibandingkan dengan bubuk dari gum arab dan maltodekstrin. Penggunaan pati modifikasi OSA juga menghasilkan bubuk Zn-klorofil dengan intensitas warna hijau dan total klorofil paling tinggi serta waktu paruh paling lama, secara berturut-turut yaitu -14,64, 187,34 mg/100g formula, dan 462 hari.[110]

©SEAFAST

Center