6
DETEKSI PATOGEN BAKTERI DALAM
22 Pengantar diagnosis penyakit tanaman
C. Tempatkan setetes air di setiap petri yang tersisa piring.
d. Gunakan pisau bedah steril untuk mengambil sepotong kecil jaringan yang sakit dari tanaman yang terkena dan letakkan jaringan tersebut di salah satu tetes pada cawan petri pertama.
e. Gunakan pisau bedah untuk m e n g h a n c u r k a n jaringan yang sakit dalam setetes air.
f. Setelah 5-10 menit (agar bakteri terpisah dari jaringan tanaman), gunakan loop transfer yang telah dibakar dan didinginkan untuk memindahkan segumpal air dan bakteri dari tetes pertama ke tetes kedua di piring yang sama. Tetesan kedua tercampur dengan baik dengan loop transfer, dan tanpa menyalakan api pada loop, satu putaran dipindahkan dari tetesan kedua ke tetesan ketiga di piring. Operasi ini diulangi secara berurutan dari tetes ke tetes dan dari cawan ke cawan dan menghasilkan pengenceran jumlah bakteri dalam suspensi asli.
g. Tambahkan nutrient agar yang telah didinginkan dan dilelehkan ke dalam setiap cawan, lalu aduk cawan untuk mendistribusikan bakteri secara merata ke seluruh bagian agar.
h. Simpan pelat pada suhu kamar (25-30°C).
Pada cawan yang disiapkan dengan pengenceran yang lebih tinggi, bakteri akan tumbuh sebagai koloni yang berbeda; ini mungkin berkembang dari sel bakteri tunggal.
Ketika koloni bakteri muncul di c a w a n , pindahkan sel dari satu koloni bakteri ke tabung miring nutrient agar atau kaldu nutrisi.
k. Setelah 24 hingga 48 jam pertumbuhan, tambahkan air suling steril ke dalam media nutrient agar miring dan cuci sel ke dalam suspensi dengan jarum inokulasi yang menyala.
l. Goreskan suspensi dari nutrient agar miring atau nutrient broth pada 2-3 lempeng agar, dan amati koloni setelah menginkubasi lempeng tersebut pada suhu kamar selama 24- 48 jam. Jika semua koloni pada lempeng identik dalam penampilan dan karakteristik kultur dan morfologi, kultur murni telah diperoleh. Patogenisitas dan tes lainnya kemudian diperlukan untuk mengkonfirmasi identitas bakteri yang diisolasi.
Deteksi patogen bakteri pada tisma yang terinfeksi 23 PENGAMATAN BAKTERI HIDUP
Bakteri hidup agak sulit untuk diamati karena sel-selnya kecil dan hanya sedikit berbeda dengan lingkungannya. Namun, mereka dapat diamati, dan motilitasnya dapat dipelajari, dengan menggunakan dudukan tetes gantung.
Prosedurnya adalah sebagai berikut:
a. Oleskan sedikit garis dasar di sekeliling depresi depre+
slide geser.
b. Dengan menggunakan loop inokulasi, secara aseptik pindahkan satu tetes kecil kultur ke bagian tengah cover slip persegi yang bersih.
C. Balikkan slide depresi dan pusatkan di atas penurunan budaya.
d. Tekan ke bawah pada bagian tepi slip penutup supaya Vaseline merekat dengan kuat.
e.Balikkan slide dengan cepat dan hati-hati sehingga tetesan air tertahan di cekungan slide. Penurunan tidak boleh menyentuh bagian bawah cekungan.
f. Periksa bakteri dalam tetesan dengan terlebih dahulu memfokuskan pada bagian tepi tetesan dengan objektif daya rendah. Kemudian, alihkan ke high dry dan fokuskan kembali pada tetesan. Bakteri sekarang seharusnya terlihat bergerak di d a l a m tetesan.
NODA GRAM UNTUK BAKTERI
Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan diferensial yang membagi bakteri menjadi dua kelompok. Kelompok pertama diwarnai ungu oleh Pewarnaan Gram dan disebut Gram Positif, sedangkan kelompok kedua diwarnai merah muda dan disebut Gram Negatif. Teknik ini sangat berguna dalam patologi tanaman karena hampir semua genera bakteri fito-patogen kecuali Corynebacterium dan Nocardia adalah Gram Negatif.
Empat larutan digunakan dalam Pewarnaan Gram:
a. Kristal violet b. Yodium Gram c. 95% alkohol d. Safranin
24 Pengantar tentang dia$rtosis penyakit tanaman Metode untuk menyiapkan solusi ini dijelaskan di bagian akhir prosedur.
a, Tempatkan satu lingkaran kultur bakteri pada slide kaca yang bersih.
b. Oleskan tetesan untuk membentuk lapisan tipis.
C. Biarkan film mengering di udara.
d. Lewati slide dengan cepat melalui nyala api Bunsen sekitar tiga kali (sisi film menghadap ke atas). Hal ini akan melekatkan bakteri p a d a slide.
e. Pewarnaan dengan kristal violet selama 30 detik, baik dengan menambahkan tetesan noda ke noda, atau dengan mencelupkan slide k e d a l a m noda.
f. Cuci dengan air keran sampai noda berhenti mengalir dari slide.
g. Tutupi film dengan yodium Gram dan biarkan selama 30 detik.
h. Bilas dengan air keran.
i. Bilas dengan alkohol 95% selama 10 kali tetesan dari slide tidak berwarna).
Bilas dengan air keran.
k. Pewarnaan dengan safranin selama 10 detik.
l. Bilas dengan air keran dan keringkan.
hingga 20 detik (yaitu hingga
m.
Periksa di bawah lensa immenion minyak pada mikroskop.n. Tentukan reaksi Gram dengan mencatat warna dinding sel.
Reagen untuk Pewarnaan Gram
Kristal Violet. Satu volume larutan alkohol jenuh kristal violet dalam empat volume amonium oksalat encer. Diamkan larutan amonium oksalat semalaman atau panaskan perlahan sampai larut.
Kemudian campur dengan larutan kristal violet.
Yodium gram. Kristal yodium 1,0 gram, H20 suling 300 ml, kalium iodida 2,0 gram. Campur semua bahan menjadi satu.
Safranin. 100 ml larutan alkohol jenuh safranin-0 dalam satu liter air suling.
DETERMINASI DARI POPULASI BAKTERI DARI JARINGAN YANG TERINFEKSI
Populasi bakteri pada jaringan tanaman yang terinfeksi dapat diketahui dengan memodifikasi teknik hitung cawan lempeng pengenceran. Jaringan diukur (baik berdasarkan berat atau luas), kemudian permukaannya didesinfestasi
Deteksi patogen bakteri dalam jaringan yang terinfeksi 25 dan digiling dalam mortar atau blender dengan sedikit air suling steril. Satu mililiter suspensi ditransfusikan ke dalam 9 ml air suling steril, dan suspensi yang dihasilkan
sion tercampur rata. Satu ml suspensi ini adalah serial.
dipindahkan ke 9,0 ml air suling steril untuk mendapatkan 10
pengenceran suspensi asli. Ambil 1 ml suspensi dari setiap pengenceran dan letakkan di dalam cawan petri steril. Tambahkan 15 ml media agar ke setiap cawan dan inkubasi cawan petri pada suhu kamar. Setelah 48 hingga 72 jam pada suhu kamar, hitung jumlah koloni bakteri pada setiap cawan. Tentukan jumlah sel yang dapat hidup dalam sampel asli dengan mengalikan jumlah koloni pada cawan yang memiliki antara 30 dan 300 koloni, dengan faktor pengenceran. Hasilnya diberikan sebagai jumlah bakteri per gram atau cm jaringan.