Dalam beberapa kasus, keberadaan patogen jamur pada jaringan yang terinfeksi t e r l i h a t dari adanya struktur reproduksi atau vegetatif jamur pada permukaan jaringan tersebut, misalnya spora embun tepung pada daun mentimun. Namun, dalam kasus lain, diperlukan pembesaran spesimen. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan lensa tangan sederhana (pembesaran 15-20 x) atau dengan mikroskop (baik stereoskopik m a u p u n majemuk).
Banyak jamur menghasilkan unit reproduksi yang disebut spora atau konidia pada struktur seperti tangkai yang muncul dari jaringan tanaman.
Spora memiliki bentuk, ukuran, dan warna yang beragam. Contohnya termasuk: spora Helminthosporium y a n g besar, gelap, dan berbentuk cerutu yang menyebabkan lesi pada daun sereal dan rumput; spora Botrytis berbentuk oval atau bulat hialin kecil yang diproduksi dalam kelompok seperti anggur pada bunga selama periode basah; spora hialin berbentuk tong dari jamur cendawan Erysiphe yang diproduksi secara b e r a n t a i di daun sereal, selada, dan tanaman tertentu lainnya. Banyak jamur yang menghasilkan spora mereka dalam struktur berbentuk labu kecil yang disebut piknidia.
Ketika kondisi lembab, spora-spora tersebut keluar dalam matriks berlendir dan muncul sebagai tetesan berkilau d i atas piknidium kecil.
Terkadang patogen jamur tidak terlihat ketika jaringan yang sakit diperiksa secara mikroskopis. Dalam kasus seperti itu, jika bahan tanaman dicuci dengan larutan deterjen, dibilas dengan baik dengan air dan kemudian ditempatkan dalam wadah tertutup (cawan petri, tabung reaksi, toples, dll.) Yang berisi kertas saring lembab atau handuk kertas, patogen biasanya akan tumbuh dari jaringan yang sakit dan menghasilkan struktur reproduksinya di permukaan.
Miselium pada jaringan tanaman mudah dibedakan dengan menggunakan pewarnaan diferensial, biru kapas, dalam laktofenol.
Larutan laktofenol dibuat dari 20 gram fenol (dihangatkan hingga meleleh), 20 ml asam laktat, 30 ml gliserin, dan 20 ml akuades. Ke dalam setengah bagian larutan laktofenol ditambahkan 2,5 ml larutan biru kapas (biru anilin) I,09o dalam air suling. Bagian yang diiris tipis atau
Deteksi patogen jamur pada jaringan tanaman yang terinfeksi 17 potongan jaringan yang sakit ditempatkan pada slide, dan beberapa tetes noda ditambahkan. Slide dihangatkan dalam nyala api hingga larutan mengepul. Bahan tanaman kemudian dibilas dengan larutan laktofenol jernih, dipindahkan ke 1-2 tetes larutan laktofenol pada slide mikroskop yang baru, ditutup dengan penutup dan diamati dengan mikroskop. Miselium jamur diwarnai biru sementara jaringan tanaman tetap tidak ternoda. Berhati-hatilah agar objek mikroskop tidak menyentuh larutan laktofenol, sehingga menyebabkan kerusakan pada objek. Hati-hati dalam menangani fenol karena dapat menyebabkan luka bakar y a n g parah.
MENGISOLASI PATOGEN JAMUR
Bakteri dan jamur ada di mana-mana sebagai kontaminan pada jaringan tanaman. Karena tujuannya adalah untuk mengisolasi jamur patogen dari jaringan yang sakit dan menumbuhkannya sebagai kultur murni, maka penting untuk menyingkirkan bakteri dan jamur yang ada sebagai kontaminan di permukaan area kerja, pada peralatan yang akan digunakan, dan pada permukaan jaringan yang sakit.
Permukaan area kerja dapat dengan mudah dibersihkan dengan kain yang dibasahi dengan air, atau dengan disinfektan seperti merkuri klorida (1:1000) atau larutan natrium hipoklorit.
Sebelum menggunakan p i s a u bedah, jarum bedah, tang, dll., instrumen harus dicelupkan ke dalam etanol 70% dan kemudian dilewatkan melalui nyala api untuk menghilangkan kontaminan dari bagian instrumen yang akan digunakan untuk menangani jaringan yang sakit. Instrumen harus didinginkan dengan udara selama satu menit sebelum digunakan.
Kontaminan pada permukaan bagian tanaman berkayu seperti ranting dan akar mudah dihancurkan dengan mencelupkan bagian tanaman tersebut ke dalam etanol 70%, melewatkan bahan tersebut melalui nyala api dan membiarkan alkoholnya terbakar. Perlakuan ini biasanya terlalu drastis untuk jaringan sukulen, seperti daun, pucuk, bagian bunga atau jaringan bibit. Untuk ini, pemutih rumah tangga digunakan, sering kali dikombinasikan dengan bahan pembasah jika permukaan jaringan tanaman sulit dibasahi.
Bahan aktif dalam sediaan pemutih rumah tangga adalah natrium hipoklorit dengan konsentrasi sekitar 5,25% berat. Larutan pemutih diencerkan dengan air (10:90) untuk menghasilkan larutan disinfektan 10% (volume). Kadang-kadang perlu untuk memastikan disinfestasi permukaan secara menyeluruh dengan membilas bahan tanaman yang sulit dibasahi dengan etanol 70%
atau dengan larutan bahan pembasah (Agral, 1-2 tetes/1000 cc air) atau larutan Decon 90 2% sebelum dicelupkan ke dalam disinfektan.
Jika area yang sakit kecil, seperti pada bercak daun atau lesi batang, jaringan yang sakit dan sejumlah kecil jaringan yang berdekatan dipotong, dibilas dengan bahan pembasah dan direndam dalam disinfektan. Jika area yang terkena melibatkan sebagian besar daun, pucuk, dll., Seperti pada beberapa penyakit hawar,
18 Pengantar diagnosis penyakit tanaman
sebagian jaringan tanaman, yang sebaiknya mencakup jaringan yang sakit dan jaringan sehat yang berdekatan dengan batas area yang sakit, dibuang, dibilas dengan bahan pembasah dan direndam dalam disinfektan. Sekitar 1 cm2 jaringan tanaman dapat ditangani dengan mudah dengan cara ini dan menyediakan jaringan yang cukup untuk mencegah disinfektan menembus jaringan dan membunuh patogen. Waktu yang dibutuhkan untuk membiarkan jaringan di dalam disinfektan bervariasi sesuai dengan jenis jaringan yang terlibat dan dapat berkisar antara 1-2 menit untuk jaringan yang tipis dan sangat segar hingga 10-15 menit untuk biji yang keras.
Desinfektan tambahan adalah:
a. Alkohol 95% - celupkan selama 3 detik.
b. 50% hidrogen peroksida - celupkan selama 15 detik hingga 5 menit.
c. 0,47" Formalin - celupkan selama 15 detik hingga 5 menit.
MELAPISI JARINGAN YANG TERINFEKSI
Jaringan yang telah didesinfeksi dapat dikeringkan di antara tisu dan kemudian dipotong kecil-kecil berukuran 1-2 mm yang kemudian dipindahkan ke permukaan media agar dalam cawan petri.
Tutup cawan petri harus dinaikkan secukupnya agar potongan- potongan jaringan dapat dengan mudah diletakkan di atas agar. Empat atau lima potongan jaringan harus diberi jarak kira-kira sama di atas cawan. Kulit jaringan berkayu dibuang menggunakan forsep steril, dan potongan-potongan kecil atau potongan jaringan dipindahkan ke media dalam c a w a n petri, seperti yang dijelaskan untuk jaringan yang lebih segar.
Cawan biasanya disimpan pada suhu 25-30°C selama beberapa hari u n t u k memungkinkan patogen tumbuh dari jaringan dan berkembang pada media agar. Ketika jenis pertumbuhan jamur dari jaringan konsisten untuk beberapa bagian jaringan, dapat diasumsikan bahwa patogen telah diisolasi.
MEMBANGUN KULTUR MURNI
Beberapa pertumbuhan jamur dari masing-masing koloni harus dipindahkan ke tabung individu dari media agar yang sama untuk menghasilkan kultur murni patogen. Hal ini paling mudah dilakukan dengan m e n g g u n a k a n jarum transfer. Jarum dipanaskan d a l a m n y a l a api hingga berwarna merah, lalu didinginkan dengan menyentuhkannya ke bagian media agar yang bebas dari pertumbuhan mikroba. Sebagian kecil dari media dan pertumbuhan jamur kemudian diambil dari koloni jamur dan dipindahkan ke titik
tengah permukaan miring
Deteksi patogen jamur pada jaringan tanaman yang terinfeksi 19
media dalam tabung. Patogen biasanya dapat dipertahankan dalam kultur murni untuk waktu yang lama dengan menyimpannya pada suhu sekitar 5 ° C dan kemudian memindahkannya ke tabung media segar dengan cara yang sama d e n g a n interval 2-3 bulan.
MENENTUKAN KARAKTERISTIK JAMUR YANG DIISOLASI Karakteristik pertumbuhan koloni jamur yang tumbuh di atas media agar dalam cawan petri dapat diamati melalui mikroskop dengan meletakkan cawan petri yang tidak tertutup di atas panggung mikroskop dan dengan hati-hati meletakkan cover slip di atas tepi koloni jamur. Karakteristik m i s e l i u m dan spora dapat diamati dengan menggunakan jarum pembedah atau jarum transfer untuk memindahkan potongan-potongan pertumbuhan jamur dari kultur ke setetes kecil air pada slide mikroskop, meletakkan cover slip secara perlahan pada tetesan air dan melihat material melalui mikroskop.
Teknik kultur slide sangat berguna untuk menentukan cara sporulasi patogen jamur. Cawan petri dilengkapi dengan dua lembar kertas saring berdiameter 9 cm, batang kaca yang dibengkokkan, slide mikroskop, dan slip penutup berukuran 22 x 30 mm. Cawan petri dan
konten disterilkan pada tekanan 15 lbs. dan suhu
121 C selama 15-20 menit. Agar air steril atau PDA (2-3% agar) dalam Cawan petri dipotong dengan pisau bedah steril menjadi kotak- kotak yang lebih kecil dari cover slip. Blok agar kemudian dipindahkan ke slide steril di c a w a n petri, dan slip penutup diletakkan di atasnya dengan penjepit steril. Potongan miselium dan spora Jor dipindahkan dari kultur jamur ke titik tengah masing-masing dari empat sisi blok agar. Kertas saring di cawan dibasahi dengan larutan gliserin 5% untuk menjaga kelembaban cawan. Cawan disimpan pada suhu 25-30°C selama beberapa hari agar jamur dapat tumbuh dan berspora. Kultur slide dipindahkan ke panggung mikroskop untuk pengamatan. Untuk banyak jamur, karakteristik miselium, cara produksi spora, dan karakteristik spora dapat ditentukan.
Struktur jamur dapat terlihat lebih jelas jika mereka
diwarnai dengan larutan 1% asam fuchsin atau kapas biru dalam lakto-fenol. Satu atau dua tetes pewarnaan ditambahkan k e slide mikroskop, dan miselium jamur dipindahkan ke tetesan tersebut, yang kemudian ditutup dengan cover slip. Jika bahan jamur dipasang di dalam air, noda dapat ditambahkan ke mount dengan menempatkan setetes noda pada slide di tepi slip penutup dan kemudian menarik setetes noda di bawah slip penutup dengan membawa selembar kertas saring ke dalam kontak dengan air di tepi yang berlawanan dari slip penutup.
20 Pengantar diagnosis penyakit tanaman
MENGAMATI PERKEMBANGAN JAMUR PADA PERMUKAAN DAUN Perkecambahan spora jamur pada permukaan daun, dan penetrasi ke dalam jaringan daun, dapat diikuti dengan mudah dengan apa yang disebut teknik whole-mount. Pada interval (misalnya 6, 18, 32 dan 48 jam) setelah tanaman diinokulasi dengan spora patogen jamur, daun dikumpulkan dan ditempatkan dalam larutan Carnoy (campuran asam asetat glasial dan etil alkohol absolut 2: 1) selama 24 jam, kemudian dipindahkan ke larutan laktofenol selama 24 jam, diwarnai dengan 0,1% asam fuchsin dalam larutan laktofenol selama 8-10 jam, dibilas dengan larutan laktofenol, dan akhirnya dipasang pada larutan laktofenol.