BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Faktor yang mempengaruhi Fermentasi oleh S. cerevisiae
18
dengan cara aerasi dan pemberian substrat dengan konsentrasi gula rendah.
Proses aerasi cenderung menyebabkan penurunan produksi etanol, karena khamir akan mengoksidasi karbohidrat melalui respirasi sehingga tingkat multiplikasi sel lebih tinggi (Vasconelos, 2015).
Tahap awal dimulai dengan interaksi awal ragi dengan media fermentasi yang ditandai dengan dihasilkannya kabondioksida, sedikit gelembung, sedikit peningkatan temperatur di lingkungan fermentasi, dan sedikit pembentukkan etanol. Tahap ini singkat dan merupakan tahapan di mana khamir mengalami fase adaptasi terhadap lingkungan barunya. Selanjutnya yaitu tahap utama yang ditandai dengan meningkatnya produksi etanol, karbondioksida, dan panas.
Tahap ini merupakan tahap terlama dari ketiga tahapan fermentasi. Pada tahap ini juga terjadi pembentukan gelembung dan peningkatan keasaman serta reduksi dari densitas lingkungan sebagai akibat dari konversi gula menjadi etanol. Tahap terakhir yaitu tahap komplementer di mana tingkat produksi CO2 dan suhu menurun serta tidak terdapat gelembung sebagai akibat dari habisnya asupan gula yang dapat difermentasi (Vasconcelos, 2015).
Jika fermentasi etanol normal, aroma yang dihasilkan berpenetrasi, enak, dan menyengat, tergantung pada bahan baku yang dimanfaatkan sebagai media.
Jika bau tidak enak dan diluar pola ini maka dapat diindikasikan kemungkinan terjadinya kontaminasi (Vasconcelos, 2015). Faktor yang mempengaruhi fermentasi diantaranya yaitu konsentrasi substrat, suhu fermentasi, keberadaan inhibitor, lama fermentasi, serta adanya nutrisi tambahan yang diperlukan oleh khamir (Jin, 2012).
19
terhambat sedangkan rerata tingkat penyerapan substrat, produktivitas etanol, dan yield etanol akan meningkat (Jin, 2012). Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi sumber gula 15% dan 20% dengan jumlah inoculum yang sama, sel mengalami pertumbuhan secara signifikan. Namun, pada konsentrasi sumber gula 25% tingkat pertumbuhan sel sangat rendah karena tingginya kandungan sumber gula mengakibatkan viskositas dan tekanan osmotik dalam medium meningkat sehingga sel mengalami stres dan metabolisme sel menurun (Wardani, 2013). Kadar gula yang sesuai untuk fermentasi etanol dengan medium tetes tebu yaitu 18-20o Brix (Laluce, 2016). Jika media mengandung konsentrasi gula yang terlalu tinggi dapat menyebabkan proses fermentasi tidak berjalan sempurna karena dapat memakan waktu dan menyebabkan kehilangan kandungan gula sehingga tingkat efisiensi lebih rendah dalam proses distilasi.
Apabila kondisi bahan baku medium fermentasi sesuai untuk khamir maka efisiensi fermentasi akan meningkat.
Total gula reduksi dalam beberapa konsentrasi dapat memberikan efek penghambatan yang sinergis untuk metabolisme ragi. Konsentrasi gula dapat mempengaruhi pertumbuhan ragi dan produksi etanol, jika tujuannya memperbanyak jumlah sel maka konsentrasi gula yang dibutuhkan rendah dan diberi aerasi. Sebaliknya, walaupun terdapat oksigen, jika konsentrasi gula tinggi maka respirasi sel akan ditekan (efek Crabtree) dan terjadi proses fermentasi dengan tujuan produksi etanol. Namun kadar gula yang terlalu tinggi dapat meningkatkan konsentrasi etanol secara signifikan dan dapat menyebabkan tidak rampungnya proses fermentasi akibat osmotic stress yang dialami oleh yeast sehingga efisiensi fermentasi berkurang. Osmotic stress pada khamir dapat menyebabkan metabolism terhambat. Jika tingkat konsumsi gula yang dihasilkan terlalu cepat atau terlalu lambat maka adanya kemungkinan ketidakseimbangan diantara penambahan gula dan konsumsi gula oleh yeast (Vasconcelos, 2015).
b. Suhu fermentasi
Suhu sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzimatis dan turgiditas membran sel yeast. Yeast mikroorganisme mesofil dan suhu yang memenuhi syarat pada praktek industri berkisar antara 30oC hingga 35oC, dengan batasan suhu maksimal 38-40oC. Literatur menyatakan bahwa semakin tinggi suhu maka semakin tinggi pula efek penghambatan etanol karena kecepat produksi etanol
20
lebih tinggi dibandingkan dengan kecepatan difusi melalui membran (Vasconcelos, 2015). Yeast yang aktif dan toleran terhadap suhu tinggi sangat ideal untuk industri bioetanol. Pada penelitian Ortiz-Muñiz B (2010) menyatakan bahwa ragi S. cerevisiae ITV-01 yeast yang diisolasi dari tetes tebu menghasilkan kadar etanol (58.4 g/l) optimal pada 30oC dengan pH 3.5. Selain itu riset lain menunjukkan bahwa S. cerevisiae BY4742 optimal pada suhu 30-40oC di mana semakin tinggi suhu maka fase eksponensial sel yeast akan lebih singkat.
Produksi etanol dapat berkurang pada suhu 50oC, hal ini dapat terjadi karena perubahan sistem transportasi sel yang dapat meningkatkan akumulasi toksin termasuk etanol dalam sel. Selain itu suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi enzim dan ribosom serta dapat menyebabkan ketidakstabilan membran yang dapat mengganggu proses fermentasi oleh yeast (Lin, 2012).
c. Keberadaan Inhibitor
Salah satu inhibitor yang dapat menghambat proses fermentasi tetes tebu adalah ion logam mineral dan pengotor yang terdapat pada tetes tebu. Kadar abu pada tetes tebu yaitu 10.21%, jenis abu yang terkandung dalam tetes tebu diantaranya yaitu kalsium, kalium, magnesium. Selain itu terdapat beberapa anion seperti SO42-, PO42- dan Cl- serta beberapa komponen senyawa organik yaitu asam dan zat pewarna (Godbole, 2002). Kalsium merupakan salah satu mineral yang banyak ditemukan pada tetes tebu setelah kalium yaitu sekitar 0.8% dari berat tetes tebu (Basso, 2011). Pada saat fermentasi, yeast mengkonversi sukrosa menjadi gula reduksi dengan memanfaatkan enzim invertase yang disekresi dari yeast itu sendiri. Berdasarkan penelitian Chotineeranat (2010) mengenai efek ion kalsium pada produksi etanol dari tetes tebu oleh yeast, dijelaskan bahwa semakin banyak kandungan ion logam seperti tembaga, kalsium, dan kalium dapat menghambat aktivitas enzim invertase. Pada penelitiannya dilakukan penambahan kalsium sebagai kalsium klorida pada tetes tebu dengan penambahan 0.18%, 0.72%, dan 2.16% (b/v), terjadi penurunan yang semakin signifikan terhadap produksi etanol seiring dengan besarnya penambahan kalsium. Selain sebagai inhibitor, ion logam dapat menjadi toksik untuk yeast dan mempengaruhi kekuatan ionik dan pH dari medium fermentasi. Maka dari itu perlu dilakukan proses pretreatment asam sulfat untuk pengurangan kalsium (dekalsifikasi) dan abu serta pengotor lain agar pertumbuhan yeast dan produksi
21
enzim invertase lebih optimal. Selain itu proses pretreatment juga dapat mengurangi kontaminasi mikroorganisme yang terdapat pada tetes tebu (Pradeep dan Reddy, 2010).
d. Lama fermentasi
Lama waktu yang digunakan untuk fermentasi tergantung pada jenis substrat, suhu, pH dan mikroorganisme yang digunakan (Muslihah, 2012). Waktu fermentasi juga sangat berpengaruh pada proses fermentasi, semakin tinggi konsentrasi sel menyebabkan waktu fermentasi lebih rendah, sebaliknya konsentrasi sel yang rendah menyebabkan waktu fermentasi yang tinggi atau lebih lama (Vasconcelos, 2015). Penelitian Pradeep dan Reddy (2010) tentang bioetanol daun pisang dengan bakteri C. thermocellum menunjukkan bahwa kadar bioetanol tertinggi 22% dicapai pada lama fermentasi 5 hari. Sedangkan penelitian tentang bioetanol kulit nanas dengan perlakuan awal hidrolisis menggunakan enzim xilanase oleh S. cerevisiae dengan kadar bioetanol tertinggi 5.22% dicapai pada lama fermentasi 1 hari (Bries, 2008).
e. pH
Khamir adalah mikroorganisme yang bekerja optimum pada kisaran pH yang luas, kisaran pH terbaik untuk yeast adalah 4.0-4.5 (Vasconcelos, 2015).
Berdasarkan penelitian Lin (2012) menyatakan bahwa pH optimum untuk S.
cerevisiae BY4742 yaitu pada kisaran 4.0-5.0. Jika pH lebih rendah dari 4.0 maka waktu inkubasi dapat lebih lama walaupun konsentrasi etanol tidak berkurang secara signifikan, sedangkan jika pH di atas 5.0 maka konsentrasi etanol dapat berkurang cukup banyak. Pembentukan asam asetat meningkat jika pH di bawah 4.0 dan pada pH di atas 5.0 asam butirat akan diproduksi. Tingkat pH sangat penting diperhatikan pada proses fermentasi karena digunakan sebagai kontrol kontaminasi bakteri, efek pertumbuhan khamir dan tingkat fermentasi. Fermentasi sukrosa lebih dipengaruhi oleh pH daripada glukosa, karena aktivitas invertase pada ragi lebih dipengaruhi oleh tingkat pH rendah daripada potensi fermentasi.
f. Suplementasi eksternal sumber nitrogen S. cerevisiae
Konsentrasi dari penambahan nutrisi untuk media fermentasi adalah salah satu faktor penting untuk membentuk kondisi optimal proses fermentasi etanol.
Yeast membutuhkan kondisi media fermentasi yang mengandung sumber karbon seperti glukosa dan fruktosa, selain itu dibutuhkan pula kandungan vitamin,
22
nitrogen, fosfor, sulfur, kalium, magnesium, kalsium, seng, zat besi, tembaga dan lain lain dalam jumlah yang sangat kecil. Sumber nitrogen yang memadai penting untuk sintesis asam amino dan protein dan untuk pertumbuhan dan fisiologi ragi (Vasconcelos, 2015). Unsur karbon dapat meningkatkan energi dan biosintesis, sedangkan sumber nitrogen digunakan untuk mempercepat pertumbuhan sel dalam fermentasi (Muslihah, 2012). Penambahan nutrisi berupa sumber nitrogen eksternal seperti yeast extract, malt extract, pepton, dan ammonium sulfat atau (NH4)2SO4 pada media pertumbuhan dapat meningkatkan produksi etanol oleh S.
cerevisiae (Harde, 2014). Penambahan nutrisi dapat meningkatkan pemanfaatan gula sehingga kemungkinan kadar etanol yang dihasilkan akan lebih tinggi apabila medium substrat disuplementasi (Sankh, 2011). Yeast extract diproduksi dengan cara memecah sel yeast dengan menggunakan enzim endogen ataupun eksogen (Chae, 2000). Kandungan asam amino, peptida, nukleotida, dan kofaktor penting seperti vitamin B (biotin dan riboflavin) yang terdapat pada yeast extract dapat mengoptimalkan pertumbuhan yeast sehingga produksi etanol pun dapat meningkat (Ortiz-Muniz, 2010), oleh karena itu yeast extract baik digunakan sebagai suplemen pada media kultur (Bekatorou, 2006).