Pelaksanaan Penelitian

BAB III METODE PENELITIAN

3.4 Pelaksanaan Penelitian

Pelaksanaan penelitian dibagi menjadi dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan terdiri dari analisis bahan baku yang meliputi pengukuran total padatan terlarut (%brix) awal tetes tebu, total gula, kadar gula reduksi, total abu dan jumlah mineral (Ca). Sedangkan penelitian utama

27

berupa produksi bioetanol dari tetes tebu yang meliputi beberapa tahapan, yaitu persiapan medium fermentasi (tanpa pretreatment asam sulfat dan dengan pretreatment asam sulfat), pembuatan starter/seed culture, fermentasi tetes tebu oleh Saccharomyces cerevisiae. Selama tahapan proses fermentasi dilakukan analisis pH, total padatan terlarut (%brix), kadar gula reduksi dengan metode DNS, total gula dengan metode anthrone, OD (optical density) sel, jumlah sel dengan metode TPC (total plate count) dan kadar etanol menggunakan Densitymeter.

3.4.1 Analisis Bahan Baku

Tetes tebu awal dianalisis total padatan terlarut dengan menggunakan hand refraktometer, total gula dengan metode anthrone, kadar gula reduksi dengan metode DNS (dinitro salicylicacid), total abu dengan metode pengabuan basah dan kadar mineral Ca menggunakan AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer). Selain itu dilakukan juga analisis total gula, kadar gula reduksi, total abu dan kadar mineral pada tetes tebu (dengan pretreatment asam sulfat dan tanpa pretreatment asam sulfat) yang sudah diencerkan dengan perbandingan air (v/v) dan bahan baku (b/v) 1:1 kemudian disterilisasi.

3.4.2 Pembuatan Seed culture

3.4.2.1 Pembuatan Seed culture kultur PT PSA Palimanan (Penelitian Pendahuluan)

Pada proses fermentasi tetes tebu menggunakan kultur yang berasal dari PSA Palimanan perlu dilakukan perbanyakan sel terlebih dahulu sebanyak dua tahap sebelumnya. Tahap pertama yaitu dilakukan perbanyakan sel dari 1 ose kultur yang berasal dari agar miring diinkubasi dalam 10 ml media PDB (Potato Dextrose Broth) selama 24 jam pada suhu 30^oC 125 rpm. Tahap ke dua yaitu 10 ml kultur tersebut disentrifugasi dan diambil endapan sel yang selanjutnya diinkubasi dalam 100 ml PDB selama 24 jam pada suhu 30^oC, dengan agitasi 125 rpm. Kemudian dimasukkan larutan dari hasil perbanyakan sel untuk pembuatan seed culture pada larutan medium tetes tebu konsentrasi gula 2,5% brix sebanyak 10% (v/v) dan diaerasi selama 24 jam pada suhu ruang. Proses aerasi dilakukan dengan cara pemberian gelembung-gelembung udara menggunakan air pump untuk respirasi sel karena volume seed culture yang cukup besar.

28

3.4.2.2 Pembuatan Seed culture kultur Instant Dry Yeast (Penelitian Utama) Pembuatan seed culture dengan cara dicampurkan 2900 ml larutan tetes tebu kadar gula 2,5% (b/v) dengan yeast extract 0,5% (b/v) dan pepton 0,5% (b/v) hingga homogen. Kemudian disterilisasi suhu 121^oC selama 15 menit. Larutan yang sudah diterilisasi dan didinginkan lalu ditambahkan Instant Dry Yeast sebanyak 1% (b/v) dan tween 20 (anti buih) sebanyak 0,1% untuk mencegah terbentuknya buih. Larutan kemudian diaerasi selama 24 jam pada suhu ruang.

Pada jam ke 0 dan 24 dilakukan pengukuran pH, total padatan terlarut (%brix), OD sel dan jumlah sel.

3.4.3 Pembuatan Medium Fermentasi

3.4.3.1 Medium Fermentasi Tanpa pretreatment asam sulfat

Ditimbang tetes tebu (b/v) dan dilarutkan dalam air keran (v/v) dengan perbandingan 1:1. Ditambahkan air kran sejumlah penambahan H2SO4 (asam sulfat) dan NaOH pada medium fermentasi dengan pretreatment asam sulfat.

Dilakukan pengenceran dengan menambahkan air keran pada tetes tebu tanpa pretreatment asam sulfat hingga mencapai konsentrasi gula 20%; 25%; dan 30%.

Masing-masing medium fermentasi tetes tebu tersebut ditambahkan 0,1% (b/v) yeast extract dan 0,1% (b/v) pepton. Kemudian larutan tersebut disterilisasi 121⁰C 15 menit.

3.4.3.2 Medium Fermentasi Dengan pretreatment asam sulfat

Ditimbang tetes tebu (b/v) dan dilarutkan dalam air keran (v/v) dengan perbandingan 1:1. Ditambahkan larutan H2SO4 pekat (96,1%) hingga pH 3,9 dan dipanaskan di atas kompor listrik hingga suhu 100^oC selama 30 menit. didiamkan selama 24 jam untuk memisahkan fase larutan dan endapan. Lalu endapan yang terbentuk dibuang. Kondisi pH dikembalikan pada pH awal dengan penambahan NaOH 50%. Dilakukan pengenceran dengan menambahkan air keran pada larutan tetes tebu dengan pretreatment asam sulfat hingga mencapai konsentrasi gula 20%; 25%; dan 30%. Masing-masing medium fermentasi tetes tebu tersebut ditambahkan 0,1% (b/v) yeast extract dan 0,1% (b/v) pepton. Kemudian disterilisasi 121^oC 15 menit.

29 3.4.4 Fermentasi (Produksi Bioetanol)

Dimasukkan seed culture 200 ml ke dalam toples kaca 2 l dan ditambahkan pada masing-masing toples 400 ml tetes tebu medium fermentasi sesuai perlakuan (konsentrasi kadar gula 20%, 25%, dan 30%) (feeding 1) kemudian dimasukkan ke dalam inkubator dan diinkubasi pada suhu 32^oC selama 6 jam.

Proses awal feeding 1 merupakan proses awal fermentasi jam ke 0. Ditambahkan lagi pada masing-masing toples 400 ml larutan tetes tebu medium fermentasi sesuai perlakuan (konsentrasi kadar gula 20%, 25%, dan 30%) (feeding 2) sehingga total larutan fermentasi yaitu 1l. kemudian dimasukkan kembali dalam inkubator pada suhu 32^oC dan dilakukan fermentasi selama 48 jam. Dilakukan pengamatan analisis kimia dan mikrobiologi setiap 12 jam meliputi total padatan terlarut (%brix), kadar gula reduksi, total gula, pH, OD sel dan jumlah sel serta kadar etanol akhir fermentasi.

3.4.5 Analisis Kimia dan Mikrobiologi

Analisis kimia dan mikrobiologi dilakukan selama tahapan proses pembuatan bioetanol tetes tebu. Analisis tersebut meliputi:

1. Konsentrasi gula (%brix) menggunakan hand refraktometer (atago) dianalisis setiap 12 jam

2. pH, menggunakan pH meter(crison) dianalisis setiap 12 jam

3. Kadar gula reduksi menggunakan metode DNS (dinitro salicylicacid) dianalisis setiap 12 jam

4. Total gula menggunakan metode anthrone

5. OD sel, menggunakan spektrofotometer dianalisis setiap 12 jam

6. Jumlah sel khamir, menggunakan metode SPC (Standard Plate Count) dianalisis setiap 12 jam

7. Kadar etanol di akhir proses fermentasi menggunakan Densitymeter.

Kemudian dilanjutkan dengan perhitungan yield etanol (%) dan efisiensi fermentasi (%).

3.4.6 Analisis Data

Data hasil pengamatan dianalisis statistik menggunakan Analysis of Varian (ANOVA) dengan selang kepercayaan 95%. Apabila faktor yang diteliti berbeda

30

nyata, maka dilakukan uji lanjut DMRT (Duncan Multiple Range Test) dengan selang kepercayaan 95%. Penentuan perlakuan terbaik dengan menggunakan metode Multiple Attribute (1982).

31