BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Landasan Teori
2.1.9 LC – MS/MS (Liquid Chromatography – Mass
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) adalah salah satunya teknik analisis yang paling umum digunakan dalam bidang farmasi industri untuk penentuan dan kuantifikasi zat obatdan zat terkaitnya. Karena reproduktifitas dan akurasi yang tinggi, HPLC secara rutin digunakan dalam bidang farmasi, kimia dan pestisida industri. Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS) adalah teknik analisis tanda hubung yang merupakan kombinasi dari Kromatografi Cair (LC) dan Spektrometri Massa (MS). HPLC (LC) memisahkan komponen- komponen campuran dengan melewatinya kolom kromatografi. Umumnya komponen dipisahkan tidak dapat diidentifikasi secara positif LC saja.
Spektrometri Massa juga digunakan untuk identifikasi senyawa yang tidak diketahui, senyawa yang diketahui dan untuk menjelaskan strukturnya.
Spektrometri massa tidak sendirian baik untuk mengidentifikasi campuran karena campuran spektrum massa sebenarnya kompleks spektrum yang tumpang tindih dari individu yang terpisah komponen. Sulitnya menghubungkan Kromatografi
cair (LC) dengan Spektrometri massa (MS). Hubungan digunakan untuk mentransfer eluen cair dari LC ke MS. LC-MS lebih banyak digunakan dalam mengundang studi disolusi, bioavailabilitas, bioekivalensi dan farmakodinamik . Sistem LC-MS preparatif dapat digunakan untuk pemurnian zat tertentu secara massal dan cepat dari zat tersebut campuran yang penting dalam penelitian dasar, farmasi,agrokimia, makanan dan industri lainnya.
Kromatografi Cair (LC) adalah kromatografi cair kinerja tinggi yang pemisahan komponen campuran dapat dilakukan dengan menggunakan fase diam bergerak cair dan fase diam padat. Ada berbagai jenis kromatografi seperti kromatografi cair fase normal, Terbalik kromatografi fasa, kromatografi cair penukar ion, Pemisahan kiral dan kromatografi cair afinitas. Dengan menggunakan pengepakan kolom yang berbeda dengan efisiensi tinggi dalam jumlah kecil campuran kompleks dapat dipisahkan.
2.1.9.1 Komponen LC – MS/MS a. Pompa
Terdiri dari bahan yang bersifat inert pelarut atau komposisi campuran buffer berair dan Pelarut organik. Ini memberikan peningkatan fase seluler dalam jumlah besar hingga 10mL/menit. Ada tiga jenis pompa utama yang digunakan yaitu pompa reciprocating, pompa Syringe dan tekanan konstan pompa.
b. Sampel Injektor
Ini digunakan untuk memperkenalkan volume sampel ke dalam sistem kromatografi. Umumnya volume sampel dari 1µL hingga 100µL dapat disuntikkan. Volume injeksi bisa ditingkatkan dengan loop injektor hingga volume 2mL. Ada dua jenis injektor utama yang digunakan yaitu injektor otomatis dan Injektor manual. Injektor otomatis lebih nyaman dan ramah pengguna serta lebih akurat dan tepat dibandingkan ke injektor manual.
c. Kolom
Merupakan fasa diam yang terdiri dari silika bahan dalam kombinasi dengan rantai karbon. Umumnya panjang kolom yang digunakan sekitar 50mm hingga 300mm. Kolom yang digunakan dalam HPLC terdiri dari Octadecyl
(C18), Octyl (C8), Cyano, Amino, pengepakan Phenyl. Kolom digunakan berdasarkan sifat senyawa yang akan dipisahkan.
d. Detektor dan Recorder
Detektor adalah yang paling penting bagian dari HPLC. Ada berbagai jenis detektor yang digunakan Detektor UV-Visible, Detektor PDA, Indeks Bias (RI) detektor, Detektor elektrokimia, Detektor fluoresensi dan detektor konduktivitas. Sinyal diterima dari detektor dapat direkam sebagai puncak dan masing-masing data dapat disimpan dalam perangkat lunak.
2.1.9.2 Prinsip LC – MS/MS
Prinsip dari Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC- MS/MS) adalah pemisahan anali-analit berdasarkan dari kepolarannya, alatnya terdiri dari atas kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya tekanan tinggi digunakan untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai ke detector (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Kemudian bantuan dari pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran, karena perbedaan kekuatan interaksi antara larutan terhadap fase diam. Larutan yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya larutan yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka larutan tersebut akan keluar kolom, kemudian dideteksi oleh detector dan direkam dalam bentuk kromatogram. (Prinsip lc ms)
2.1.9.3 Kelebihan LC-MS/MS
Menurut (26) Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC- MS/MS) merupakan satu-satunya teknik kromatografi cair dengan detektor spektrometer massa. Penggunaan LC-MS/MS untuk penelitian bio-analisis dimulai pada akhir 1980-an. Kelebihan dari teknologi LC-MS/MS meliputi:
a. Spesifitas. Hasil Analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan spectrometer massa sebagai detector.
b. Aplikasi yang luas dengan sistem yang praktis Berbeda dengan GC-MS sebagai spektrometer musa "klasik", penerapan LC-MS/MS tidak terbatas untuk molekul volatil (biasanya dengan berat molekul dibawah 500 Da).
Mampu mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi.
c. Fleksibilitas. Pengujian yang berbeda dapat dikembangkan dengan tingkat fleksibilitas yang tinggi dan waktu yang singkat.
d. Kaya Informasi. Sejumlah data kuantitatif maupun kualitatif dapat diperoleh.
Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat cepat dengan banyak parameter.
2.1.9.4 Spektrofotometer Massa
Spektrofotometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi mereka. Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang akan menghasilkan ion, dan analisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion . Menurut Komponen dari spektrometri massa yaitu :
1) Ion Source (Sumber Pengion)
Ada berbagai macam teknik ionisasi yang digunakan pada spektrometri massa. Hal yang harus dipertimbangkan dalam pemilihan teknik ionisasi antara lain energi internal yang dipindahkan pada saat proses ionisasi dan sifat fisikokimia dari analit yang dapat diionisasi. Metode ionisasi yang berkembang antara lain; electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), Atmospheric pressure photo-ionization (APPI), dan matrix- assisted laser desorption/ionization (MALDI).
a. Electrospray ionization (ESI)
Ionisasi dengan ESI melalui 3 tahap; produksi tetesan bermuatan, pengurangan ukuran tetesan bermuatan dan fase gas pembentukan ion.
Tahap pertama, analit bersama dengan eluen dari Kromatografi cair dipompa masuk menuju kapiler. Di dalam kapiler terdapat anoda (kutup negatif) pada taylor cone dan katoda (kutup negatif) pada kapiler. Kutup ini
berfungsi agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetesan) tidak bergabung menjadi tetesan yang lebih besar lagi. Didalam kapiler yang sangat sempit dan bertegangan tinggi akan terjadi nebulasi, analit berinteraksi dengan lapisan permukaan pelarut menghasilkan tetesan bermuatan positif/negatif. Tahap kedua, tetesan bermuatan ini akan mengalami pengurangan ukuran karena menguapnya pelarut, meningkatnya kerapatan muatan pada partikel sehingga meningkatkan tegangan permukaan dan tetesan akan pecah menjadi tetesan-tetesan lebih kecil (a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion), b. Satu analit bersama solven yang diliputi muatan positif, c. Beberapa analit bersama beberapa solven diliputi beberapa analit). Tahap terakhir, analit ion akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas nitrogen, gas ini berfungsi agar analit yang terbentuk stabil dan tidak terganggu oleh gas oksigen. Tetesan tersebut ditransfer melalui lubang kapiler penganalisis massa.
b. Atmospheric pressure chemical (APCI)
Teknik ionisasi yang menggunakan reaksi fase gas ion-molekul pada tekanan atmosfer. Secara umum digunakan untuk senyawa polar dan relatif non polar, dengan berat molekular sedang sekitar 1500 Da dan memberikan ion muatan tunggal. Analit dalam larutan dimasukkan ke dalam nebulizer, larutan dirubah menjadi uap tipis oleh nitrogen berkecepatan tinggi.
Kemudian diteruskan ke korona dan terjadi ionisasi, ion-ion dari sumber ion bereaksi dengan analit dan mengionisasi melalui transfer muatan.
c. Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)
APPI Merupakan salah satu perkembangan terakhir dari sumber ion yang memanfaatkan tekanan atmosferik. Prinsipnya adalah dengan menggunakan foton untuk mengionisasi molekul fase gas. Sampel dalam larutan diuapkan dengan pemanasan nebulizer mirip dengan metode pada APCI. Setelah penguapan, analit berinteraksi dengan foton yang dipancarkan oleh lampu pelepas. Foton ini memicu rangkaian reaksi fase gas yang mengarah pada proses ionisasi molekul sampel. Perbedaan dari metode
APCI adalah adanya penggunaan lampu pemancar foton. Manfaat dari metode ini adalah metode ini mempunyai potensi untuk mengionisasi senyawa non-polar, efisien untuk analisis senyawa kelas flavonoid, steroid, pestisida, hidrokarbon poliaromatik.
2) Mass Analyzer (penganalisis massa)
Setelah terbentuk ion fase gas, maka ion-ion dipisahkan berdasarkan massa masing-masing, sifat fisika ion yang diukur oleh mass analyzer adalah rasio massa terhadap muatan (m/z). Karenanya, untuk ion bermuatan ganda, nilai m/z adalah bagian farksional dari massa aktual. Mass analyzer yang umum digunakan meliputi quadrupole, ion trap, time-of-flight (TOF), fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR).
a. Quadrupole
Sebuah analisis massa quadrupole terdiri dari empat batang paralel diatur dalam persegi. Ion analit diarahkan ke bagian tengah persegi.
Tegangan yang dialirkan pada batang menghasilkan bidang elektromagnetik. Bidang ini menentukan rasio masa yang dapat melewati filter pada waktu tertentu. Quadrupoles cenderung merupakan analisis massa yang paling sederhana dan paling murah.
b. Time-of-Flight (TOF)
Pada analisis massa time-of-flight (TOF), sebuah gaya elektromagnetik yang seragam diterapkan untuk semua ion pada waktu yang sama. Hal ini menyebabkan ion akan dipercepat menyusuri tabung penerbangan. Ion yang lebih ringan berjalan lebih cepat dan tiba pada detektor paling awal, sehingga rasio fragmentasi ion / itentukan oleh waktu kedatangan mereka. Analisis massa (TOF) memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat pada pengukuran massa suatu senyawa.
c. Perangkap Ion
Analisis massa perangkap ion massa terdiri dari elektroda melingkar cincin dua penutup di kedua ujungnya yang bersama-sama membentuk sebuah ruang. Ion memasuki ruang dan terjebak oleh medan elektromagnetik. Bidang lain digunakan untuk mengeluarkan dengan
selektif dari dalam perangkap. Perangkap ion memiliki kelebihan dapat melakukan beberapa tahapan pengukuran spektrometer massa tanpa analisis massa tambahan.
d. Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR)
Analisis massa FT-ICR merupakan jenis lain dari analisis massa perangkap ion. Ion memasuki ruangan dan terjebak dalam lingkaran orbit oleh medan listrik dan medan magnet yang kuat. Ketika terjadi eksitasi oleh frekuensi radio (RF) pada medan listrik, ion menghasilkan arus yang bergantung pada waktu. Arus ini dikonversi oleh fourier menjadi frekuensi orbital dari ion yang sesuai dengan rasio muatan massa senyawa. Seperti perangkap ion, analisis massa FT-ICR dapat melakukan beberapa tahapan spektrometri massa tanpa analisis massa tambahan.
FT-ICR juga memiliki rentang massa yang lebar dan resolusi massa yang sangat baik. FT-ICR merupakan analisis massa termahal diantara yang lain.
2.1.9.5 Detektor
Detektor merupakan alat penting spektrometer massa itu menghasilkan arus yang sebanding dengan jumlah ion serang itu. Setelah ion-ion terbentuk dilewatkan dari analisa yang dimilikinya untuk dideteksi dan diubah menjadi sinyal. Terdapat dua jenis detektor yang umum digunakan. Detektor Kolektor Ion Titik Dalam hal ini pengumpul ion ditempatkan pada titik massa yang tetap spektrometer. Semua ion terfokus pada detektor yang terletak pada satu titik.
Kedatangan ion dapat dicatat dengan aliran arus listrik dan data dapat direkam.
Arus listrik aliran sebanding dengan ion yang tiba di titik detektor ion. Detektor Array Detektor Array adalah kumpulan pengumpul titik yang ditempatkan di dalamnya pesawat. Ion-ion tersebut tiba pada suatu titik atau melintasi bidang secara berurutan detektor. Ion-ion dengan nilai massa terhadap muatan (m/z) dipisahkan dan direkam sepanjang bidang menggunakan pengumpul ion titik.
Secara spasial ion-ion yang terdiferensiasi dengan rentang massa terdeteksi secara bersamaan pada saat yang sama di detektor array.