BAB III METODE PENGUJIAN
3.3 Skema Kerja
Spektrometri massa (Micromass Quattro Micro LC) yang dilengkapi dengan ionisasi electrospray (ESI) menggunakan elektroda penghitung aliran silang dijalankan dalam mode positif (ESI+), dan diatur dalam Multiple Reaction Monitoring (MRM), memantau transisi 137,00 → 93,00 untuk Asam Salisilat dan 379,92 → 316,00 untuk IS (Celecoxib).
Tegangan kapiler, waktu tinggal, tegangan cone, dan laju alir gas adalah 1.5 kV, 0.20 detik, 5 V, 650 L/Jam, energi tumbukan 20 eV. Akuisisi dan analisis data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak MassLynx 4.1 dari waters Crp., Milford, MA, USA.
c. Larutan Kurva Kalibrasi 1-8
d. Larutan LLOQ (Low Limit of Quantification)
Dipipet masing-masing sebanyak 180 µL plasma darah
Dimasukkan ke dalam masing-masing microtube sesuai etiket
Ditambahkan 20 µL larutan WS 1 ke dalam microtube KK 1, WS 2 ke dalam microtube KK 2, dan seterusnya sampai WS 8
Ditambahkan 20 µL larutan kerja internal standar 100.000 ng/mL, masukkan ke dalam masing-masing microtube
Dimasukkan ke dalam microtube yang bersih dan kering Gambar 3. Skema Pembuatan Larutan Blanko + Insternal Standar
Gambar 4. Skema Pembuatan Larutan Kurva Kalibrasi
Disiapkan sebanyak 8 microtube yang baru dan bersih, diberikan etiket
Dipipet sebanyak 180 µL plasma darah, dimasukkan ke dalam microtube yang bersih dan kering
e. Larutan QC-L (Quality Control Low)
f. Larutan QC-M (Quality Control Medium)
Ditambahkan 20 µL larutan QC-M, dimasukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan kerja internal standar 100000 ng/mL, masukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan WS 1, dimasukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan kerja internal standar 100000 ng/mL, masukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan QC-L, dimasukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan kerja internal standar 100000 ng/mL, masukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan QC-H, dimasukkan ke dalam microtube yang sama
Ditambahkan 20 µL larutan kerja internal standar 100000 ng/mL, masukkan ke dalam microtube yang sama
Dipipet sebanyak 180 µL plasma darah, dimasukkan ke dalam microtube yang bersih dan kering
Gambar 5. Skema Pembuatan Larutan LLOQ
Dibuat 5 kali pengulangan larutan LLOQ
Gambar 6. Skema Pembuatan Larutan QCL Dibuat 5 kali pengulangan larutan QC-L
Dipipet sebanyak 180 µL plasma darah, dimasukkan ke dalam microtube yang bersih dan kering
Gambar 7. Skema Pembuatan Larutan QCM
Dibuat 5 kali pengulangan larutan QC-M
Gambar 8. Skema Pembuatan Larutan QCH Dibuat 5 kali pengulangan larutan QC-H
Dipipet sebanyak 180 µL plasma darah, dimasukkan ke dalam microtube yang bersih dan kering
32
g. Larutan QC-H (Quality Control High)
2. Preparasi Larutan Sampel
3.4
Alat dan Bahan 3.4.1
Alat
a. Instrument Xevo TQ-S Micro Watters LC – MS/MS b. Timbangan Analitik ( Mettler Toledo)
c. Mikropipet (Eppendrof, Socorex)
d. Ultrasonic cleaner (Bransonic PC620E-2) e. Voretx Mixer (Vortex Genie 2)
f. Centrifuge (Hettich Micro 220R)
g. Pemurni air (Arium 611UV Ultrapure water system) h. Alat-alat gelas
3.4.2 Bahan
a. Plasma darah b. Asam Salisilat
Disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 5֩c dengan kecepatan putaran 14.000 rpm
Ditambahkan 800 µL 0,10% Asam Format dalam Asetonitril tiap masing- masing larutan sampel, lalu dikocok selama 5 menit
Dikocok larutan blanko, larutan blanko+IS, larutan kurva kalibrasi, larutan LLOQ, larutan QC-L, larutan QC-M, dan larutan QC-H selama
10 detik
Gambar 9. Skema Pembuatan Larutan Sampel
Dipindahkan supernatan yang bening ke dalam vial LC-MS yang kering dan bersih
Diukur larutan dalam instrument LC-MS/MS
c. Celecoxib d. Metanol
e. 0,10% Asam Format dalam Asetonitril 3.4.2.1 Data Baku
Baku yang digunakan sebagai Working Standar (WS) adalah Asam Salisilat.
Tabel 7. Data Baku Asam Salisilat
Data Keterangan
Nama Asam Salisilat
No.Batch R153JO
Exp. Date -
Kemurnian Baku 99,90%
Tabel 8. Data Penimbangan Baku Asam Salisilat
Keterangan Bobot (mg)
Asam Salisilat 5
3.4.2.2 Data Internal Standar
Senyawa yang digunakan sebagai Internal Standar (IS) adalah Etoricoxib Tabel 9. Data Internal Standar Celecoxib
Data Keterangan
Nama Celecoxib
No.Batch 3
Exp. Date -
Kemurnian Baku 99,90 %
Tabel 10. Data Penimbangan Internal Standar Celecoxib
Keterangan Bobot (mg)
Celecoxib 5
3.5 Rumus Perhitungan
3.5.1 Penimbangan Asam Salisilat
BP= 100 %
Kemurnian Baku x Bobot Prosedur Asam Salisilat 3.5.2 Penimbangan Celecoxib
BP= 100 %
Kemurnian Baku x Bobot Prosedur Celecoxib 3.5.3 Persamaan Regresi Liniear
a. Konsentrasi Rata Rata Yw ,mean=
∑
yix Wi∑
Wib. Respon Rata Rata Xw , mean=
∑
Xix Wi∑
Wic. Swxy
(
Xi−Xw , mean)
X(¿Yi−Yw , mean)X Wi Swxy=∑
¿d. Swxx
Swxx=
∑ (
Xi−Xw ,mean)
2 X Wie. Nilai Slope (b) b=Swxy
Swxx f. Nilai Intersep (a)
a=Yw ,mean−Gradient x Xw ,mean g. RSS
RSS=
∑
(Yi−Yi , pred)2x Wih. CSS
CSS=
∑
(Yi−Yw ,mean)2x Wii. Nilai Koefisien Korelasi (r)
R2=(CSS−RSS) CSS 3.5.4 Akurasi (% Deviasi)
% Dev = (C3−C2)
C1 x100 % Keterangan :
C3 = Kosentrasi Analit dalam campuran sampel sejumlah tertentu analit C2 = Konsentrasi analit dalam sampel
C1 = Konsentrasi analit yang ditambah ke dalam sampel 3.5.5 Presisi
3.5.5.1 Simpangan Baku (SD) x−´x¿2
¿¿
∑
¿SD=¿ √¿
3.5.5.2 Koefisien Variasi (%CV)
%CV= SD
%rata−rata x100 % 3.6 Persyaratan
Persyaratan parameter verifikasi akurasi dan presisi yang digunakan dalam pengujian ini mengacu pada Europan Medicines agency tahun 2011 mengenai peraturan metode validasi bioanalisis.
Tabel 11. Persyaratan
No. Parameter Kriteria
1. Kurva Kalibrasi
r2 ≥ 0.9900
% Dev LLOQ ≤ 20%
% Dev non-LLOQ ≤ 15%
Akurasi % Dev LLOQ ≤ 20%
2. % Dev non-LLOQ ≤ 15%
3. Presisi % CV LLOQ ≤ 20%
% CV non-LLOQ ≤ 15%
BAB IV
HASIL PENGUJIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengujian 5 Organoleptik
Sampel yang digunakan adalah cairan plasma yang di dapatkan dari Palang Merah Indonesia (PMI) yang diproduksi pada dengan golongan darah.
Tabel 12. Data Organoleptik Plasma
Pemerian Hasil Pengamatan
Bentuk Cair
Warna Kuning
Bau -
Rasa -
6 Data Verifikasi
a. Data Kurva Kalibrasi
Pada pengujian ini, kurva kalibrasi dibuat sebanyak 8 titik kurva dengan konsentrasi 50 ng/mL; 100 ng/mL; 1000 ng/mL; 2000 ng/mL; 4000 ng/mL; 6000 ng/mL; 8000 ng/mL; 10000 ng/mL.
Tabel 13. Data Pengukuran Kurva Kalibrasi
Calibration Curve Cons. (ng/mL)
Std Cons. (ng/mL)
% Dev Curve
50 52,68 5,4
100 90,05 -9,9
1000 892,62 -10,7
2000 2048,95 2,4
4000 4167,10 4,2
6000 5857,34 -2,4
8000 8140,51 1,8
10000 10932,08 9,3
r² 0,9939
b. Data Akurasi dan Presisi
Tabel 14. Data Pengukuran Akurasi dan Presisi
Statistical Variable
Standard Concentration (ng/mL)
LLOQ QC Low QC Medium QC High
49,90 149,70 4990,02 7485,03
Measured Data
47,84 146,25 4739,63 7128,78
56,67 159,36 5517,97 7043,28
36,07 133,16 5236,77 7618,48
43,45 151,56 5243,81 7746,00
47,14 131,50 4966,00 7523,29
Within day Mean 46,234 144,366 5140,836 7411,966 Within day (%CV) 16,16 8,27 5,78 4,21 Within day (%Dev) 7,34 3,56 3,02 0,97
6.1 Perhitungan
7 Penimbangan
4.2.1.1 Penimbangan Asam Salisilat BP= 100 %
Kemurnian bakux Bobot Prosedur SA
BP= 100 %
99,90 %x5mg
BP=5,00mg
4.2.1.2 Penimbangan Celecoxib
BP= 100 %
Kemurnian bakux Bobot Prosedur CLX
BP= 100 %
99,90 %x5mg BP=5mg
8 Persamaan Regresi Liniear
Tabel 15. Data Perhitungan Regresi Liniear
Area SA
Area is
Xi (Cons)
Yi (Response)
Wi (1/X^2
)
Xi*
Wi
Xi- XW,mean
Yi*Wi Yi- YW, mean
Swxy Swxx CSS Yi
pred = axi+b
Yi-Yi
predic RSS 173,76 14480,18 50
0,0119 998508
0,0004 0000
0,0200 00
-14,1082 02190
0,0000 047999
- 0,0011 416997
0,000 0 06443
0,0796 16548
0,0000
00000521 0,0117 322880
0,0002 675628
0,0000 000000286
235,9 14993,41 100
0,0157 335790
0,0001 0000
0,0100 00
35,8917 97810
0,0000 015734
0,0025 920284
0,000 0 09303
0,1288 22115
0,0000
00000672 0,0167 267677
- 0,0009 931887
0,0000 000000986
1245,61 12988,48 1000
0,0959 011370
0,0000 0100
0,0010 00
935,8917 97810
0,0000 000959
0,0827 595864
0,000 0 77454
0,8758 93457
0,0000
00006849 0,1066 274020
- 0,0107 262650
0,0000 000001151
3255 15396,89 2000
0,2114
063295 0,0000
0025 0,0005
00 1935,8917
97810 0,0000
000529 0,1982 647789 0,000
0 95955
0,9369
19263 0,0000
00009827 0,2065 169958
0,0048 893337
0,0000 000000060
8439,66 19952,50 4000
0,4229 875955
0,0000 0006
0,0002 50
3935,8917 97810
0,0000 000264
0,4098 460450
0,000 1 00819
0,9682 02765
0,0000
00010498 0,4062
961833 0,0166
914123 0,0000 000000174 10330,7
8 17455,82 6000
0,5918 243887
0,0000 0003
0,0001 67
5935,8917 97810
0,0000 000164
0,5786 828381
0,000 0 95417
0,9787 44762
0,0000
00009302 0,6060 753707
- 0,0142 509821
0,0000 000000056
9914,87 12092,94 8000
0,8198 891254
0,0000 0002
0,0001 25
7935,8917 97810
0,0000 000128
0,8067 475748
0,000 1 00035
0,9840 37166
0,0000
00010169 0,8058 545582
0,0140 345672
0,0000 000000031 17373,6
3 15812,38 10000
1,0987 359272
0,0000 0001
0,0001 00
9935,8917 97810
0,0000 000110
1,0855 943766
0,000 1 07863
0,9872 19458
0,0000
00011785 1,0056 337457
0,0931 021815
0,0000 000000867
Sum
0,0005 0137
0,0321 42
0,0000 065887
3,1633 455285
0,000 5 9329
5,9394 55535
0,0000
00059625 0,0000
000003611
a. Nilai Slope (b) b=Swxy
Swxx
b= 0,00059329 5,939455535 b=0,000099890 b. Nilai Intersep (a)
a=Yw ,mean−Gradient x Xw ,mean
a=0,0131415506−(0,000099890.64,108202) a=0,0131415506−0,006403768
a=0,006737808
c. Nilai Koefisien Korelasi (r) R2=(CSS−RSS)
CSS
R2=(0,000000059625−0,0000000003611) 0,000000059625
R2=0,99394 3 9 Akurasi (% Deviasi)
a. Kurva Kalibrasi
% Dev KK 1 = (52,68−50)
50 x100 %=5,4 %
% Dev KK 2 ¿(90,05−100)
100 x100 %=−9,9 %
% Dev KK 3 ¿(892,62−1000)
1000 x100 %=−10,7 %
% Dev KK 4 ¿(2048,95−2000)
2000 x100 %=2,4 %
% Dev KK 5 ¿(4167,10−4000)
4000 x100 %=4,2 %
% Dev KK 6 ¿(5857,34−6000)
6000 x100 %=−2,4 %
% Dev KK 7 ¿(8140−8000)
8000 x100 %=1,8 %
% Dev KK 8 = (10932,08−10000)
10000 x100 %=9,3 % b. Low Limit of Quantification (LLOQ)
% Dev LLOQ ¿(46,234−49,90)
49,90 x100 %=−7,34 % c. Quality Control Low
% Dev QCL ¿(144,366−149,70)
149,70 x100 %=−3,56 % d. Quality Control Medium
% Dev QCM ¿(5140,836−4990,02)
4990,02 x100 %=3,02 % e. Quality Control High
% Dev QCH ¿(7411,966−7485,03)
7485,03 x100 %=−0,97 % 10 Presisi
a. Simpangan Baku (SD) x−´x¿2
¿
¿
∑
¿SD=¿√¿
b. Koefisien Variasi (%CV)
%CV= SD
%rata−rata x100 %
Low Limit of Quantification (LLOQ)
Tabel 16. Data Presisi Low Limit Of Quantification
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 47,84 1,606 2,579236
2 56,67 10,436 108,910096
3 36,07 10,164 103,306896
4 43,45 2,784 7,750656
5 47,14 0,906 0,820836
� 231,17 25,896 223,36772
�̅ 46,234 5,1792 44,673544
SD=
√
223,367724 %CV=7,47274581446,234 x100 %
¿
√
55,84193 ¿16,162%= 7,472745814
Quality Control Low (QCL)
Tabel 17. Data Presisi Quality Control Low
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 146,25 1,884 3,549456
2 159,36 19,994 224,8200
3 133,16 11,206 125,5744
4 151,56 7,194 51,7536
5 131,50 12,866 165,5339
� 721,83 48,144 571,231356
�̅ 144,366 9,6288 114,24627
SD=
√
571,2313564 %CV=11,95022339144,366 x100 %
¿
√
142,807839 ¿8,27 % = 11,95022339Quality Control Medium (QCM)
Tabel 18. Data Presisi Quality Control Medium
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 4739,63 401,206 160966,2544
2 5517,96 377,134 142230,054
3 5236,77 95,934 9203,3323
4 5243,81 102,974 10603,644688
5 4966,00 174,836 30567,6269
� 25704,18 1152,084 353570,9123
�̅ 5140,836 230,4168 70714,18246
SD=
√
353570,91234 %CV=297,30914
5140,836 x100 %
¿
√
88392,72808 ¿5,78 % = 297,30914Quality Control High (QCH)
Tabel 19. Data Presisi Quality Control High
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 7128,78 283,186 80194,3106
2 7043,28 368,686 135929,3666
3 7618,48 206,514 42648,0322
4 7746,00 345,034 119048,4612
5 7523,29 111,324 12393,03298
Σ 37059,83 1314,744 390213,2036
x̅ 7411,966 262,9488 78042,64072
SD=
√
390213,20364 %CV=312,335238
7411,966 x100 %
¿
√
97553,3009 ¿4,21 % = 312,33523811 Persyaratan dan Hasil
Tabel 20. Persyaratan dan Hasil Penelitian
No. Parameter Kriteria Hasil
1. Kurva Kalibrasi r2 ≥ 0.9900 r2 0,9939
% Dev LLOQ ≤ 20% % Dev LLOQ : 5,4%
% Dev non-LLOQ ≤ 15% % Dev non-LLOQ : -10,7% - 9,3 %
2. Akurasi
% Dev LLOQ ≤ 20% LLOQ : -7,34%
QCL : -3,56%
% Dev non-LLOQ ≤ 15% QCM : 3,02%
QCH : -0,97%
3. Presisi
% CV LLOQ ≤ 20% LLOQ : 16,16%
QCL : 8,27%
% CV non-LLOQ ≤ 15% QCM : 5,78%
QCH : 4,21%
Kesimpulan VERIFIKASI MEMENUHI SYARAT
11.1Pembahasan
Verifikasi metode bioanalisis merupakan metode yang digunakan untuk memastikan atau memvalidasi ulang metode yang digunakan dalam pengujian agar dapat digunakan dan menghasilkan data yang valid. Verifikasi metode ini biasanya akan dilakukan jika metode yang sudah tervalidasi akan digunakan kembali namun terdapat perbedaan pada penggunaan alat maupun reagennya.
Verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat menggunakan parameter akurasi dan presisi yang dilakukan pengujian dalam plasma darah manusia dengan menggunakan intrumen LC-MS/MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry). Pengujian ini dilakukan di Laboratorium PT Biometrik Riset Indonesia dengan metode yang beracuan dari European Medicines agency (EMA) tahun 2011. Pengujian ini menggunakan metode preparasi sampe Protein Precipitation Extraction (PPE) dengan menggunakan methanol sebagai pelarut dan asam format 0,1% dalam asetonitril sebagai pengendap protein. Metode ini dipilih dengan tujuan untuk meminimalkan jumlah zat aktif Asam Salisilat yang akan hilang pada saat proses preparasi sampel karena semakin banyak tahap preparasi yang dilakukan maka akan semakin banyak juga kadar zat aktifnya berkurang.
Hasil dari ektraksi Asam Salisilat dalam sampel plasma yang sudah ditambahkan dengan asam format 0,1% dalam asetonitril yang bertujuan untuk
mengendapkan protein didalam sampel plasma (pengendapan protein) kemudian di vortex selama 5 menit, hal memiliki tujuan untuk memecahkan ikatan asam salisilat didalam sampel plasma. Kemudian sampel yang sudah di vortex dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm pada suhu 5°C selama 10 menit, hal ini bertujuan untuk memisahkan protein dengan lapisan supernatannya yang dimana nanti akan mengendap dibawah dan lapisan supernatannya akan di pindahkan ke mikkrotube baru yang bersih, kemudian hasil sentrifugasi dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm pada suhu 5°C selama 5 menit dan kemudian larutan supernatannya dipindahkan ke dalam vial untuk dilakukan penginjekkan larutan sampel, tujuan dari sentrifugasi kembali ini untuk memastikan larutan supernatant yang dipindahkan ke dalam vial tidak ada lagi terdapan endapan proteinnya karena akan mengganggu hasil dari penginjekan sampel pada alat LC-MS/MS.
Pada pengujian ini fase gerak aygn digunakan yaitu ammonium asetat 5mM : asetonitril dengan perbandingan 25:75 dan dengan system isokratik. Yang dimaksut dengan system isokratik proses pemisahan senyawa dengan menggunakan larutan fase gerak yang sama dan dengan perbandingan yang tetap selama proses pemisahan hingga proses selesai.(system isokratik) Sebelum digunakan fase gerak disaring dengan menggunakan penyaring vakum dengan membrane filter yang memiliki tujuan untuk menyaring zat zat lain didalam larutan aquadest, kemudian setelah disaring larutan didegas yang bertujuan untuk menghilangkan gas didalam larutan fase gerak yang jika terdapat gas oksigen dan nitrogen yang akan berpotensi menggangu pompa dan detector pada instrument yang nantinya akan mempengaruhi hasil analisis.(system isokratik) Penggunaan fase gerak ammonium asetat 5mM dan asetonitril dipilih karena diperoleh kondisi optimum setelah dilakukan optimasi berbagai fase gerak, hasil optimasi dipilih berdasarkan munculnya puncak spektrum masing -masing senyawa dan konsentrasi analit dengan standar internal.
Standari internal pada pengujian ini digunakan untuk meningkatkan akurasi, presis, dan kekuatan metode analisis karena selama perawatan dan analisis sampel biologis kehilangan kosentrasi senyawa dapat terjadi. Dengan menambahkan standar internal dengan jumlah yang sama begitu dengan sifat fisika kimia yang
serupa dengan zat aktif kehilangan konsentrasi analit dapat dikoreksi. Sehingga dapat disimpulkan bahwa standar internal berfungsi sebagai kontrol kerja dalam bioanalisis, standar internal yang digunakan dalam bioanalisis ini yaitu Celecoxib yang memiliki kesamaan struktur dan profil kromatografi yang baik dengan zat asam salisilat.
Pengukuran kurva kalibrasi bertujuan untuk mengetahui linearitas konsentrasi larutan. Kurva kalibrasi dibuat dengan berbagai macam konsentrasi yang diencerkan dari larutan stok standar. Pada pengujian ini, dibuat sebanyak 8 titik kurva kalibrasi dengan konsentrasi terendah yaitu 500,00 ng/mL dan konsentrasi tertinggi yaitu 100000,00 ng/mL. hasil pengukuran akan berbanding lurus antara konsentrasi larutan dengan luas area sehingga didapatkan hasil kurva yang linear. Kurva kalibrasi menunjukkan linearitas yang baik pada rentang konsentrasi 500,00 ng/mL sampai 100000,00 ng/mL. Pada pengujian ini, kurva kalibrasi memiliki koefisien regresi 0,9939 dengan persamaan garis y = 0,006737 + 0.000099890x. Hasil ini menunjukkan bahwa linieritas dari metode yang digunakan sangat baik dimana syarat dari linieritas yang baik adalah koefisien korelasi mendekati 1.
Pada uji akurasi, masing-masing konsentrasi (LLOQ, QC Low, QC Medium, dan QC High) dibuat menjadi 5 larutan. Menurut Food and Drug Administration (FDA), untuk analisis dalam matriks biologis, akurasi harus diukur pada minimum lima kali pengukuran per konsentrasi. Rata-rata % dev dari lima larutan LLOQ yaitu -7,34 %, lima larutan Quality Control Low yaitu -3,56 %, lima larutan Quality Control Medium 3,02 %, lima larutan Quality Control High -0,97 %.
Semua hasil pengujian ini memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh Europan Medicines Agency yaitu akurasi dalam proses harus ditentukan dengan menganalisis dalam sekali proses minimal 5 sampel tiap level dengan minimal 4 level konsentrasi yang mencakup rentang kurva kalibrasi, yaitu Low Limit of Quantification (LLOQ), tiga kali dari LLOQ (Quality Control Low), 30 – 50%
dari rentang kurva kalibrasi ( Quality Control Medium). Dan 75% dari rentang kurva kalibrasi atas (Quality Control High). Konsentrasi rata-rata harus berada dalam 15% dari nilai nominal untuk sampel Quality Control, kecuali untuk LLOQ harus berada dalam 20% dari nilai nominal.
Pada uji presisi, masing-masing konsentrasi (LLOQ, Quality Control Low, Quality Control Medium, dan Quality Control High) dibuat menjadi 5 larutan.
Menurut Food and Drug Administration (FDA), untuk analisis dalam matriks biologis, akurasi harus diukur pada minimum lima kali pengukuran per konsentrasi. Rata-rata % dev dari lima larutan LLOQ yaitu 16,16 %, lima larutan Quality Control Low yaitu 8,27 %, lima larutan Quality Control Medium 5,78
%, lima larutan Quality Control High 4,21 %. Semua hasil pengujian ini memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh Europan Medicines Agency yaitu akurasi dalam proses harus ditentukan dengan menganalisis dalam sekali proses minimal 5 sampel tiap level dengan minimal 4 level konsentrasi yang mencakup rentang kurva kalibrasi, yaitu Low Limit of Quantification (LLOQ), tiga kali dari LLOQ (Quality Control Low), 30 – 50% dari rentang kurva kalibrasi ( Quality Control Medium). Dan 75% dari rentang kurva kalibrasi atas (Quality Control High). Konsentrasi rata-rata harus berada dalam 15% dari nilai nominal untuk sampel Quality Control, kecuali untuk LLOQ harus berada dalam 20% dari nilai nominal. Hasil akurasi dan presisi ini bermakna bahwa kadar asam salisilat yang diperoleh memiliki kedekatan dengan kadar yang diketahui serta pengujian dari tiap keberulangannya memiliki kedekatan satu dengan yang lainnya.
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
Berdasarkan hasil pengujian verifikasi metode penetapan kadar Asam Salisilat dengan parameter akurasi dan presisi dalam plasma darah secara LC MS/MS (Liquid Chromatrography Mass Spectrometry) didapat kesimpulan bahwa parameter yang di uji yaitu kurva kalibrasi, Low Limit of Quantification (LLOQ), akurasi dan presisi menunjukkan bahwa masing-masing telah memenuhi syarat yang sudah ditetapkan berdasarkan Europan Medicines Agency tahun 2011 dan dapat digunakan untuk analisis rutin dan dari hasil pengujian yang sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode bioanalisis asam salisilat dengan parameter akurasi dan presisi dalam plasma darah menggunakan LC-MS/MS (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) dapat digunakan untuk analisis rutin.
5.2 Saran
Perlu dilakukan pengujian verifikasi dengan parameter lainnya seperti spesifitas untuk melengkapi parameter verifikasi.
DAFTAR PUSTAKA
1. BPOM RI. (2022). Peraturan Badan Pengawas Obat Dan Makanan Nomor 11 Tahun 2022 Tentang Tata Laksana Uji Bioekivalensi. Bpom Ri, 1–95.
2. Eropa, A. U. (2012). Pedoman validasi metode bioanalitik Pedoman validasi metode bioanalitik Daftar Isi. 44(0), 1–23.
3. European Medicines Agency. (2012). EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev.
1 Corr. 2** - Guideline on bioanalytical method validation. EMA Guidance
Document, June 2011, 1–23.
https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline- bioanalytical-method-validation_en.pdf
4. Fathia Faza Rahmadanita, S. (2020). Aspirin-exacerbated respiratory disease (AERD). Laryngoscope Investigative Otolaryngology, 5(3), 360–367.
https://doi.org/10.1002/lio2.387
5. Ginting, M. K. (2012). Validasi metode..., Maris Karisma Ginting, FMIPA UI, 2012.
6. Isman Maulia Reza A, Andri Nopriansyah, Reza Nurwahyuni, Sri Novi Mutmainah, Adela Nursya’bani, Humairani Rahman, S. S. A. (2016).
Farmakokinetika Sediaan Intravena (Mono Kompartemen Dan Multi Kompartemen). 1–23.
7. Kartika, R. (2021). Verifikasi Dan Validasi Metode Uji Kualitas Udara. In Gastronomía ecuatoriana y turismo local. (Vol. 1, Issue 69).
8. Kulzumia, C. J., Dina Qoyima, D., Wasito, H., & Susilowati, S. S. (2017).
Spektrofotometri dengan Pendekatan Kemometrika untuk Analisis Asam Benzoat dan Asam Salisilat Secara Simultan dalam Sediaan Larutan. MPI (Media Pharmaceutica Indonesiana), 1(3), 164–173.
https://doi.org/10.24123/mpi.v1i3.269
9. Lestari, R. A. (2017). Pengendapan Protein Plasma. september 2016, 1–6.
10. Lintong, P. M., Loho, L. L., & Anggran, H. (2013). Gambaran Histopatologik Lambung Tikus Wistar Setelah Diinduksi Dengan Aspirin. Jurnal Biomedik (Jbm), 5(1), 210–226. https://doi.org/10.35790/jbm.5.1.2013.2044
11. Mangurana, W. O. I., Yusnaini, Y., & Sahidin, S. (2019). ANALISIS LC- MS/MS (Liquid Crhomatogaph Mass Spectrometry) DAN METABOLIT SEKUNDER SERTA POTENSI ANTIBAKTERI EKSTRAK n-HEKSANA SPONS Callyspongia aerizusa YANG DIAMBIL PADA KONDISI TUTUPAN TERUMBU KARANG YANG BERBEDA DI PERAIRAN TELUK STARING. Jurnal Biologi Tropis, 19(2), 131–141.
https://doi.org/10.29303/jbt.v19i2.1126
12. Meri Susanti, D. (2014). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Issue september 2016).
13. Nurhidayati, A. P. D., & Ashuri, N. M. (2019). Struktur Hewan. 1–211.
14. Pratima, N. A. (2018). Liquid Chromatography-Mass Spectrometry and Its Applications: A Brief Review. Archives of Organic and Inorganic Chemical Sciences, 1(1), 26–34. https://doi.org/10.32474/aoics.2018.01.000103
15. Sarah Swasti P. (2017). Dasar Teori Asam Salisilat. 32.
16. Sirok, D., Pátfalusi, M., Szeleczky, G., Somorjai, G., Greskovits, D., &
Monostory, K. (2018). Robust and sensitive LC/MS-MS method for simultaneous detection of acetylsalicylic acid and salicylic acid in human
plasma. Microchemical Journal, 136, 200–208.
https://doi.org/10.1016/j.microc.2016.11.005
17. Siswanto, A., Fudholi, A., Nugroho, A. K., & Martono, S. (2016). Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam Plasma Kelinci ( Lepus curpaeums ) secara Simultan Validation of A High Performance Liquid Chromatography Method for The Simultaneous Determination of Aspirin and Salisylic Acid In Rabb. Jurnal Kefarmasian Indonesia, 6, 68–78.
18. Siswanto, A., Fudholi, A., Nugroho, A. K., & Martono, S. (2017). Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam Plasma
Kelinci (Lepus curpaeums) secara Simultan. Jurnal Kefarmasian Indonesia, 6(2), 68–78. https://doi.org/10.22435/jki.v6i2.6221.68-78
19. Subhan, A., Fajar, D. R., & Sari, I. W. (2021). Tingkat Pengetahuan Masyarakat Terhadap Penggunaan Obat Analgetik Antipiretik Secara Swamedikasi Di Kelurahan Balocci Baru Kabupaten Pangkep. Jurnal Farmasi Pelamonia, 12–22.
20. Yunjeong Kim, Ji-Young Jeon, Song-Hee Han, Na Ha, K. J. and M.-G. K.
(2018). Quantitative analysis of acetylsalicylic acid in microsampling. 26(1), 32–38.
L
A
M
P
I
R
A
N
Ditimbang Ammonium asetat sebanyak 192,70 mg dengan menggunakan wadah timbang
Disaring larutan Ammonium asetat 2 mM menggunakan penyaring vakum
Dimasukkan selang fase gerak pada instrument LC-MS/MS ke dalam botol fase gerak Ammonium Asetat
Dimasukkan filtrat ke dalam botol berukuran 500 mL, Disonikasi selama 3 menit
Lampiran 1. Pembuatan Fase Gerak 1. Fase Gerak
a. Ammonium Asetat 2mM sebanyak 500 mL
Dimasukkan 250 mL aquadest ke dalam labu ukur 500 mL Dilarutkan dengan aquadest, lalu homogenkan dengan spatel
Ditepatkan dengan aquadest hingga tanda batas, homogenkan Dipindahkan larutan ammonium asetat ke dalam labu ukur 500 mL yang
sudah ditambahkan aquadest
Dimasukkan selang fase gerak pada instrument LC-MS/MS ke dalam botol fase gerak asetonitril
Diukur sebanyak 350 mL asetonitril ke dalam gelas ukur
Diukur sebanyak 500 mL asetonitril ke dalam gelas ukur
Ditimbang setara sebanyak 5 mg standar Asam Salisilat b. Asetonitril 100 % sebanyak 350 mL
Lampiran 2. Pembuatan Asetonitril dalam Asam Format 0,1%
2. Pembuatan Asetonitril dalam Asam Format 0,1% sebanyak 500 mL
Lampiran 3. Pembuatan Larutan Stock Standar Carvedilol 1000 µg/mL 3. Larutan Stock Standar Asam Salisilat 1000 µg/mL
Dimasukkan ke dalam botol cokelat dan disonikasi selama 3 menit
Dipipet 500 µL asam format 0,1% dengan mikropipet, Dipindahkan ke gelas ukur yang berisi asetonitril
Dimasukkan ke dalam botol cokelat dan homogenkan
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dipipet sebanyak 500 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 1000 µg/mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Lampiran 4. Larutan Kerja Standar Asam Salisilat
4. Larutan Kerja Standar Asam Salisilat
a. Larutan Kerja Standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Lampiran 5. Pembuatan Larutan Standar Asam Salisilat (Working Standar) 5. Pembuatan Larutan Standar Asam Salisilat (Working Standar)
WS 1 (Konsentrasi 500 ng/mL)
Ditepatkan dengan metanol hingga tanda batas, homogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dilarutkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril sebanyak ¾ labu ukur, lalu disonikasi selama 2 menit
Dipipet sebanyak 25 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
WS 2 (Konsentrasi 1000 ng/mL)
WS 3 (Konsentrasi 10000 ng/mL)
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 200 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 50 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
WS 4 (Konsentrasi 20000 ng/mL)
WS 5 (Konsentrasi 40000 ng/mL) Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 40 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 80 µL dari larutan stock Asam Salisilat 100000 µg/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
WS 6 (Konsentrasi 60000 ng/mL)
WS 7 (Konsentrasi 80000 ng/mL)
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 120 µL dari larutan stock Asam Salisilat 100000 µg/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 160 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik