BAB III. METODE PENELITIAN
3.6 Produksi P(3HB) dengan Isolat Bakteri
3.6.1 Penyiapan Medium Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB) 1. Sumber Karbon
Sumber karbon yang digunakan dalam penelitian ini adalah CPO dengan konsentrasi 4,6 g/L (Djamaan, 2014).
2. Sumber Nitrogen
Sumber nitrogen dibuat dengan melarutkan 1,1 (NH4)2HPO4 kedalam 1 liter air suling. Sumber nitrogen disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan, 2015).
3. Pembuatan Larutan Mikroelemen
Pembuatan larutan mikroelemen dilakukan dengan cara melarutkan sebanyak 2,78 g FeSO4.7H2O; 1,98 g MnCl2.4H2O; 2,81 g CuSO4.7H2O;
1,67 g CaCl.2H2O; 0,17 g CuCl2 dan 0,29 g ZnSO4.7H20 kedalam 1 liter HCL 0,1 N. Larutan mikroelemen ini disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.
28 4. Pembuatan Larutan MgSO4.7H2O 1 M
Larutan MgSO4.7H2O 1 M dibuat dengan melarutkan 5 g MgSO4.7H2O 1 M ke dalam 20 mL air suling. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan, 2015).
5. Pembuatan Larutan Dapar Posfat pH-7
Larutan Dapar Posfat pH-7 dibuat dengan cara melarutkan 3,7 g KH2PO4
dan 5,8 K2HPO4 ke dalam 1 liter air suling, pH larutan diatur hingga mendekati 7. Jika pH kurang dari 7 maka menaikinya dengan cara penambahan NaOH 0,1 M. Kemudian larutan dapar ini disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 15 lbs selama 15 menit (Djamaan, 2015).
3.6.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Penghasil Biopolimer P(3HB)
Pembuatan suspensi bakteri bakteri penghasil P(3HB) dilakukan dengan cara mengambil 1-2 ose koloni bakteri uji dari stok agar miring lalu dimasukan kedalam 10 mL Na. Fisiologis 0,85% steril lalu divortex sampai homogen.
3.6.3 Pembuatan Inokulum Isolat Bakteri Penghasil P(3HB)
Kemudian isolat bakteri dibuat stok agar miring dan diinokulasikan 1-2 ose ke dalam 10 mL medium NaCl 0,85% steril untuk produksi P(3HB), selanjutnya di shaker selama 24 jam dengan kecepatan 200 rpm. Setelah 24 jam, sebanyak 3 mL kultur benih dipindahkan ke dalam 100 mL medium mineral yang mengandung CPO 4,6 g/L di shaker kembali selama 24 jam pada suhu 30°C dengan kecepatan 200 rpm di dalam labu erlemeyer.
29 3.6.4 Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri Penghasil Bioplastik
P(3HB)
Medium pengkulturan bakteri yaitu medium mineral spesifik dengan komposisi untuk 1 liter medium adalah sebagai berikut : KH2PO4 3,7 g/L (NH4)2HPO4 1,1 g/L, MgSO4.7H2O 0,25 g/L dan larutan mikroelemen 10 mL.
3.6.5 Pemisahan Biomassa dan Supernatan
Proses pemisahan biomassa dan supernatan dilakukan dengan proses sentrifugasi, 100 mL sampel dengan menggunakan alat sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Lapisan bening supernatan dipisahkan dari endapan biomassa dengan cara pemipetan. Lapisan supernatan digunakan untuk menentukan pH, sedangkan biomassa yang dikeringkan dengan menggunakan oven untuk menentukan berat kering dari kandungan P(3HB) (Djamaan, 2016).
3.7 Karakterisasi Penghasil P(3HB) Menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra-Red Analysis)
Sebanyak 1 mg sel kering bakteri dilarutkan dalam 5 mL kloroform.
Kloroform untuk memperbanyak PHB yang ada di dalam selnya. kloroform kemudian diuapkan untuk mendapatkan bubuk P3HB, yang menjadikan sasaran analisis FTIR menggunakan spektrofotometer FTIR. Spektrum direkam dalam rentang 4000 cm-1 hingga 500 cm-1.
3.8 Karakterisasi Bakteri Panghasil Biopolimer 3.8.1 Makroskopik
Dilakukan identifikasi secara makroskopis dengan cara mengamati warna koloni, bentuk koloni, pinggir koloni, permukaan koloni, dan elevasi koloni, kemudian dicatat hasil pengamatan dalam bentuk tabel.
30 3.8.2 Mikroskopik
Dilakukan karakterisasi secara mikroskopis dengan cara mengamati bentuk Sel, Pewarnaan Gram, dan Pewarnaan Endospora.
3.8.3 Pewarnaan Gram
Dilakukan pewarnaan gram dengan cara menyiapkan kaca objek bersih, kemudian teteskan Nacl 0,85% steril diatas kaca objek tersebut, secara aseptis diambil inokulum bakteri yang akan di periksa lalu difiksasi diatas nyala api spiritus. Kemudian diteteskan kristal violet diatas sediaan dan ditunggu selama 10 menit lalu dibilas dengan aquadest, kemudian diteteskan larutan iodine pada sediaan tersebut dan didiamkan selama 10 menit lalu di bilas dengan aqudest, kemudian ditetesi dengan alkohol 96% dan dibiarkan selama 10 menit. Lalu di bilas dengan aquadest. Kemudian di teteskan larutan safranin dan di diamkan selama 3 menit lalu di bilas dengan aquadest. Kemudian dikeringkan lalu diperiksa dibawah mikroskop. Bila sel bakteri bewarna unggu maka bakteri tersebut merupakan kelompok bakteri Gram positif. Apabila sel bakteri tersebut berwarna merah atau merah muda maka bakteri tersebut merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Dengan pewarnaan ini juga dapat terlihat bentuk sel bakteri (Yulvizar, 2013).
3.8.4 Pewarnaan Endospora
Pewarnaan ini dilakukan menggunakan metode pewarnaan Klein. Kaca objek yang kering dan bebas lemak dilewatkan diatas nyala api. Kemudian diteteskan inokulum dan dikeringkan dan di keringkan dengan lampu spritus.
Kemudian diteteskan Melachit Green dan dipanaskan selama 10 menit, lalu di dibilas dengan aquadest. Kemudian diteteskan Safranin dan didiamkan selama 20
31 detik, lalu dibilas dengan aquadest. Kemudian dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop (Misnadiarly & Husjain, 2014).
3.9 Uji Biokimia
Uji biokimia bakteri berupa dilakukan di Laboratorium Biota Sumatera, Universitas Andalas. Uji yang dilakukan antara lain : uji katalase dan uji motilitas.
(Djamaan & Dewi, 2014).
3.9.1 Uji Katalase
Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan H2O2 3% pada kaca objek, kemudian diambil satu ose bakteri lalu difiksasi di kaca objek setelah itu teteskan H2O2 3% tersebut. Hasil dinyatakan positif apabila ada gelumbung atau gas yang terbentuk (Cappucino & Welsh, 2017).
3.9.2 Uji Motilitas
Pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri pada media tegak semi solid yang di inkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC.
Kemudian diamati perubahan yang terjadi. Jika bakteri tumbuh hanya di bagain inokulum saja berarti bakteri non-methyl sedangkan bakteri motil akan tumbuh dan menyebar hingga permukaan (Cappucino dan sherman, 2014).
32 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
1. Hasil isolasi dari sampel tanah tambang dengan menggunakan media CPO bakto agar di dapatkan 30 isolat bakteri. Di antaranya 4 isolat bakteri yang menghasilkan fluoresensi jingga yang berindikasi sebagai penghasil bakteri P(3HB) (Lampiran 2).
2. Hasil Karakterisasi Bakteri Penghasil P(3HB), didapatkan :
a. Pengamatan uji makroskopik hasil yang diamati berupa bentuk, warna, permukaan, elevasi, dan pinggir dari isolat bakteri penghasil P(3HB) sebagai berikut: (Lampiran 3)
- ITB 4.2 : bulat, putih, kasar, timbul, bergelombang - ITB 7.3.1 : bulat, putih, kasar, timbul, bergelombang - ITB 8.1.2 : bulat, putih, licin, timbul, bergelombang - ITB 10.1 : bulat, putih, licin, timbul, rata
b. Pengamatan uji mikroskopik berdasarkan bentuk bakteri dan pewarnaan Gram : (Lampiran 4)
- ITB 4.2 : Basil, Gram positif - ITB 7.3.1 : Basil, Gram positif - ITB 8.1.2 : Basil, Gram positif - ITB 10.1 : Basil, Gram positif
33 c. Pengamatan uji mikroskopik berdasarkan pewarnaan endospora :
(Lampiran 4).
- ITB 4.2 : positif endospora - ITB 7.3.1 : positif endospora - ITB 8.1.2 : positif endospora - ITB 10.1 : positif endospora
d. Pengamatan uji biokimia hasil yang diamati berupa karakteristik uji katalase dan uji motilitas (Lampiran 5).
e. Hasil sentrifus untuk mengetahui berat dari biomassa dan pH (Lampiran 6).
f. Hasil karakterisasi menggunakan spektroskopi FTIR ( Lampiran 7).
4.2 Pembahasan
Pada penelitian ini dilakukan, isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil P(3HB) dari tanah tambang batubara Bengkulu Utara, dimana sampel tanah di ambil di daerah tambang sebanyak 10 titik pada jarak 25-30 meter. Kemudian tanah di masukan kedalam plastik klip lalu dimasukan kedalam lemari pendingin bertujuan untuk pengawetan tanah sehingga tidak di tumbuhi oleh jamur. Sampel tanah ini diambil karena tanah mengandung unsur seperti karbon yang tinggi, hidrogen, dan oksigen dalam tanah tambang sehingga berpotensi menghasilkan bakteri penghasil P(3HB). Karena tanah tambang ini sudah memiliki unsur karbon yang tinggi sehingga media yang digunakan yaitu CPO bakto agar, CPO mengandung unsur karbon sehingga unsur nitrogen yang di dapat sangat sedikit sekali. Hal ini di dukung oleh Djamaan (2015), yang menyatakan bahwa bakteri yang ditumbuhkan dengan sumber karbon berlebih dan mengurangi unsur penting
34 lainnya, seperti nitrogen mengakibatkan pertumbuhan bakteri yang tidak seimbang, sehingga bakteri cenderung untuk mengkonsumsi sumber karbon secara berlebihan dan menyimpan sebanyak-banyaknya granul cadangan makanan di dalam selnya. Cadangan makanan ini yang merupakan biopolimer P(3HB).
Pour Plate Method, metode yang digunakan dalam penelitian untuk menumbuhkan bakteri. Tanah di suspensikan pada pengenceran 10-4, pengenceran ini bertujuan agar bakteri yang telah di inkubasi pada suhu 35-37ºC selama 24-48 jam terbentuk koloni pada cawan yang berisi media dalam jumlah yang dapat di hitung serta memudahkan pengidentifikasian. Setelah bakteri tumbuh dalam bentuk beberapa koloni yang tersebar di atas permukaan media, maka di lakukan pemurnian pada koloni berdasarkan bentuk, ukuran, permukaan, elavasi dan warna. Setelah koloni semuanya sama maka di lakukan skrining menggunkan larutan Nile Blue A dan di amati di bawah sinar UV 365 nm, jika bakteri berfluoresensi jingga maka bakteri positif penghasil P(3HB). Nile Blue A merupakan larutan senyawa yang larut dalam lipid yang berikatan dengan P(3HB) dalam sel bakteri. Butiran PHA yang terkandung dalam tubuh bakteri akan berfluoresensi jingga ketika ditetesi dengan larutan Nile Blue A dan diamati dibawah sinar Uv dengan panjang gelombang 365 nm.
Dari 30 isolat bakteri yang didapat, kemudian di lakukan penapisan dengan larutan Nile Blue A yang diamati di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 365 nm, didapatkan 4 isolat bakteri positif penghasil P(3HB) dengan kode bakteri ITB 8, ITB 15, ITB 20, dan ITB 29 yang positif menghasilkan warna fluoresensi jingga yang berindikasi sebagai penghasil bakteri P(3HB) (Lampiran 2). Hal tersebut disebabkan ke empat bakteri menghasilkan senyawa enzim
35 P(3HB) di dalam sel yang ditunjukan oleh adanya gen pha A, pha B dan pha C oleh sebab itu bakteri tersebut memiliki kemampuan untuk membentuk granula- granula cadangan makanan P(3HB) bagi bakteri yang dapat di deteksi dengan terpacarnya warna fluoresensi jingga pada saat penambahan larutan Nile Blue A yang dapat di amati di bawah sinar UV 365 nm. Ostle and Holt (1982), melaporkan bahwa larutan Nile Blue A mampu berikatan dengan senyawa P(3HB) di dalam sel bakteri. Granula P(3HB) yang terdapat dalam sel bakteri yang positif P(3HB) akan menunjukan warna fluoresensi jingga dengan pemberian larutan Nile Blue A yang dilihat dari sinar UV 365 nm. Dua puluh enam bakteri yang tidak berfluoresensi jingga munculnya warna kehitaman pada beberapa koloni.
Hal ini terjadi karena gen yang mengkode enzim PHB-synthase tidak terepreksikan sehingga enzim tersebut tidak tersintesis. Sesuai dengan pendapat Agustien dan Hakam (2002).
Bakteri positif penghasil P(3HB) yang berbeda di inokulasi kan ke dalam media CPO, lalu di fermentasi di rotary shaker inkubator pada kecepatan 200 rpm dengan suhu 30ºC. Pengoncangan dengan menggunakan rotary shaker inkubator ini adalah agar campuran dalam medium pertumbuhan bakteri menjadi homogen sehingga nutrisi yang terdapat pada medium dapat digunakan dengan efektif dan dapat digunakan secara maksimal (Djamaan, 2015). Media sumber karbon yang digunakan bakteri penghasil P(3HB) yaitu CPO, tujuannya agar bakteri penghasil P(3HB) ini dapat beradaptasi serta merangsang dan memperbanyak terbentuknya P(3HB). Di dalam sel bakteri P(3HB), biopolimer tersebut di simpan berupa granul-granul cadangan makanan yang tersebar di dalam cairan sitoplasma yang akan digunakan kembali oleh bakteri jika kondisi pada lingkungan kurang
36 mengutungkan atau kehabisan sumber makanan. Menurut Agustien (2001) bahwa strain AAP-17 mampu mengakumulasikan granul polimer P(3HB) dalam selnya sebesar 60% Alcaligenes eutropus merupakan satu dari bakteri penghasil P(3HB) yang dilaporkan mampu menghasilkan P(3HB) di dalam selnya mencapai 85%
dari berat selnya dengan menggunakan asam butirat sebagai sumber karbon tunggal.
Setelah di lakukan fermentasi selanjutnya inokulum fermentasi di sentrifugasi dengan alat sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm dalam waktu 20 menit. Untuk memisahkan antara supernatan dan biomassa, dimana lapisan bawah adalah biomassa. Larutan supernatan di ukur kadar pH. Pengukuran kadar pH menggunakan pH meter. Pengukuran pH dilakukan untuk mengetahui tingkat keasaman dari hasil akhir proses fermentasi dan melihat pengaruhnya terhadap produksi biomassa lalu dikeringkan dalam oven 70ºC hingga bobot konstan.
(Lampiran 6). Bakteri yang positif menghasilkan bakteri P(3HB) kemudian di remajakan pada stok agar miring untuk dilanjutkan uji karakterisasi berupa uji pewarnaan Gram, pewarnaan endospora, karakterisasi FTIR serta uji biokimia seperti uji katalase dan uji motilitas.
Pada pengujian karakteristik mikroskopik pewarnaan Gram ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB) yang di amati di bawah mikroskop perbesaran 10x100 pada pewarnaan Gram ini empat isolat bakteri menunjukan Gram positif, bakteri Gram positif memiliki dinding sel seperti jala yang tebal yang terbuat dari peptidoglikon yang tebal dimana kelompok bakteri Bacillus spp ini memiliki kandungan lemak yang rendah, sehingga dinding sel lebih mudah terhidrasi akibat perlakuan alkohol yang menyebabkan pori-pori sel menjadi lebih kecil dan
37 permeabilitasnya berkurang sehingga zat warna kristal violet yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel (Lampiran 4.)
Pada pengujian pewaranaan endospora ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB) positif endospora di dalam sel bakteri (Lampiran 4). Pembentukan endospora ini terjadi karena struktur bakteri dapat bertahan pada keadaan seperti kekeringan, kekurangan nutrisi, dan suhu ekstrem. Pembentukan endospora disebabkan karena adanya gen spesifik yang digunakan dalam proses sporulasi yaitu spo HA, spo HE, dan spo HG. Menurut Errington (2003), komponen regulator transkripsi sangat berperan penting dalam pembentukan spora yang disebut dengan Spo OA. Spo OA dibentuk untuk mengontrol proses transkripsi dan aktivitas protein melalui proses fosforilasi. Fosforilasi Spo OA merupakan regulator sporulasi yang sangat penting dan bekerja mengaktifkan transkripsi pada beberapa proses sporulasi. Menurut Willey (2008), endospora dapat di temukan pada bagian ujung sel vegetatif (terminal), sentral, subterminal, dan swollen sporangium.
pengujian biokimia ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB) di lakukan uji katalase dan empat isolat bakteri tersebut positif katalase (Lampiran 5).
Berdasarkan uji katalase terbentuknya gelembung udara (gas) merupakan kelompok bakteri Aerob, bakteri in menggunakan oksigen untuk menghasilkan energi. Hidrogen peroksida (H2O2) bersifat toksik sehingga dengan cepat dapat merusak komponen sel bakteri. Dengan adanya enzim superoxide dismustase sehingga memecah superoxide menjadi air. Sehingga H2O2 akan di katalis menjadi H2O menjadi O2. Pada pengujian biokimia motilitas ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB) positif motilitas (Lampiran 5). Menurut Tarigan (2008),
38 bakteri di katakan motil apabila bakteri bergerak tumbuh dan menyebar ke seluruh media dan dikatakan non motil jika tumbuh pada daerah inokulasi saja.
Pergerakan bakteri dapat disebabkan karena bakteri memiliki flagel (gerak aktif) atau pun karena faktor dari luar (gerak Brown). Gerak Brown merupakan gerakan secara acak yang disebabkan karena adanya benturan dari molekul-molekul dalam medium.
Karakterisasi menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra-Red Analysis) pada bakteri penghasil P(3HB) dihasilkan beberapa puncak bilangan di setiap rentang wilayahnya (Lampiran 7). Pada rentang wilayah I pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 8, terdapat puncak dengan bilangan gelombang 2921.63 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang 1742.34 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O dan pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1233.68 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 15, terdapat pada puncak dengan bilangan gelombang 2922.46 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang 1701.33 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O, pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1232.89 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 20 terdapat pada puncak dengan bilangan gelombang 2918.56 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang 1647.55 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O, dan pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1233.39 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Pada isolat bakteri dengan kode sampel ITB 29 terdapat pada puncak dengan bilangan
39 gelombang 2922.08 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-H, pada wilayah II rentang bilangan gelombang 1740.92 cm-1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C=O, dan pada wilayah III rentang bilangan gelombang 1233.28 cm-
1 puncak tersebut merupakan gugus fungsi C-O. Yang dapat dilihat pada tabel di bawah :
Tabel karakterisasi FTIR Gugus
Fungsi
Rentang Bilangan Gelombang
(cm-1) (Literatur)
Bilangan Gelombang cm-1
Standar ITB 4.2 ITB 7.3.1 ITB 8.1.2 ITB 10.1
C – H 1852-2976 2932 2921 2922 2918 2922
C = O 1640-1790 1719 1742 1701 1647 1740
C – O 1057-1277 1275 1233 1232 1233 1233
Hasil karakteristik dengan FTIR ini menunjukan bahwa, pada rentang FTIR standar dan FTIR sampel uji dapat terbaca dan terdapat gugus fungsi dimana C-H itu gugus (alkana), C-O terdapat gugus (Alkohol, ester, asam karboksilat), dan gugus fungsi C=O terdapat gugus (keton dan aldehid).
Pada struktur di atas merupakan struktur dari bakteri penghasil P(3HB), (Djamaan, 2015) pada struktur P(3HB) diatas menunjukan dimana terdapat gugus C-H, C=O, dan C-H.
40 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, dapat di peroleh kesimpulan sebagai berikut :
1. Dari hasil isolasi tanah tambang dengan menggunakan media CPO bakto agar ini di dapatkan 30 isolat bakteri dan yang menghasilkan bakteri penghasil P(3HB) ini ada 4 isolat diantarnya dengan kode sampel ITB 4.2, ITB 7.3.1, ITB 8.1.2 dan ITB 10.1.
2. Pada pengujian pewarnaan Gram bakteri penghasil P(3HB) memiliki karakteristik seperti bentuk koloni bulat, dinding sel tebal, membran sel selapis, dan tidak memiliki membran luar, pada ke empat isolat bakteri menunjukan bakteri Gram positif dimana secara pengamatan bentuknya basil dan menunjukan warna ungu pada selnya. Pada pengujian uji biokimia bakteri penghasil P(3HB) ke empat isolat bakteri positif katalase, positif motilitas dan berdasarkan identifikasi pewarnaan yang telah dilakukan didapatkan ke empat bakteri bentuknya basil, Gram Positif dan positif endospora. Gugus fungsi yang terdapat pada bakteri penghasil P(3HB) yang di analisis menggunakan FTIR diantaranya adalah C-H, C=O dan C-O.
5.2 Saran
Disarankan untuk melakukan optimasi fermentasi pada ke empat isolat bakteri penghasil P(3HB), uji biokimia, dan identifikasi uji molekuler pada ke empat isolat bakteri tersebut.
41 DAFTAR PUSTAKA
Afiifah, R,. Novita, I,. M. Hendra,. S. Ginting, 2015. Pengaruh berat pati dan volume Plasticizer gliserol terhadap karakteristik film bioplastik pati kentang. Jurnal Teknik Kimia USU. 4 : 35-39.
Agustien, A. Dan A. D. Hakam,. 2002. Produksi bioplastik poli (3-hidroksibutirat) dari bakteri rekombinan Escherichia coli. Jurnal Kimia Andalas Volume.
8 : 38-41.
Agustien, A,. 2001. Produksi bioplastik dan bakteri isolat lokal. JUMPA Volume 10 : 22-25.
Al-Mohanna MT,. 2016. Morphology and Classification of bacteria. University of Al-Qadisiyah.
Anam C, Sirojudin, Firdausi KS,. 2007. Analisis gugus fungsi pada sampel uji bensin dan spiritus menggunakan metode spektroskopi FTIR.
Berkala Fisika Volume. 10 : 79-80.
Arikan E, B., and Ozsoy H. D., 2015. A Review: Investigation of Bioplastics, Civil Engineering and Architecture. 9 : 188-192.
Chen J, Zhang L, Chen J, Chen G,. 2007. Biosynthesis and Characterization of polyhydroalkanoate copolyvesters in Ralstonia eutropha P3HB - 4 harboring a low-substrate-specifity PHA synthase PhaC2Ps From Pseudomonas stutzeri 1317. Chin. J. Chem. Eng. 15 : 391-396.
Capuccino J.G, Sherman N,. 2014. Microbiology: A Laboratory Manual. 10th Ed. New York : Person.
Capuccino J.G, Chad Welsh,. 2017. Microbiology: A Laboratory Manual. 11th Ed. New York : Person.
Djamaan, A. dan Dewi, A. P., 2014. Metode produksi Biopolimer dari minyak kelapa sawit, Asam Oleat, dan Glukosa. Padang : Andalas University Press.
Djamaan, A,. 2015. Konsep Produksi Biopolimer P(3HB) dan (P3HB-ko-3HV) secara Fermentasi. Padang: Andalas University Press.
Daniel RA, Errington J,. 2003. Control of cell morphogenesis in bacteria : two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 6 : 767.
Gemeidiya, R,. 2016. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Penghasil Bioplastik Poli (3–Hidroksibutirat) Dari Tanah Puncak Gunung Merapi yang Ditumbuhkan Dalam Media Minyak Kelapa Sawit-Bakto Agar. [Skripsi]. Farmasi Unand.
Padang.
42 Gill, M,. 2014. Bioplastic: A Better Alternative To Plastics, International Journal
Of Research in Applied. 2 : 115-120.
Haedar A, RB Gobel, R Umar, Ambeng,. 2013. Seleksi Bakteri dari Limbah dan Tanah Pabrik Gula Arasoe-Kab.Bone. Sebagai Penghasil Poli-B- Hidroksibutirat (Bioplastik). Bandung: Universitas Padjajaran.
Handrick, R., S. Reindart, D. Schultheiss, T. Reichart, D. Schuler, V. Jendrossek and D. Jendrossek,. 2004. Unravelling the fuction of the Rhodospirilium rubrum. Activator of Polyhydroxybutirate (PHB) Degradation: The
activator is PHB granule-bound protein (Phasin).
J. Bacteriology 186 : 2466-2475.
Harianto F,. 2011. Penapisan Bakteri Penghasil Bioplastik Poli (3-Hidroksibutirat) dari Sampel Tanah Hutan Pendidikan dan penelitian Biologi, Kampus Unand, Limau Manis, Padang. [Skripsi]. Padang. Universitas Andalas.
Irwandi, Djamaan A, Agustien A,. 2018. Produksi Bioplastik P(3HB) Dari Bahan
Dasar Minyak Kelapa Sawit dengan Isolat Bacillus sp.
Chempublish Journal, Volume 3 : 85-93.
Jaya, D,. 2017. Dewatering of Coal from Jorong Kalimantan Selatan using Residu of Cooking Oil and Kerosene. Eksergi. 14 : 35.
Kismiyati, Subekti S, Yusuf RWN, Kusdarwaty S,. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Gram Negatif pada Luka Ikan Maskoki (carassius auratus) Akibat Infestasi Ektoparasit argulus sp Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan 1: 2.
Kusuma, F., Haedar, N. dan Abdullah A,. 2014. Optimalisasi Produksi Poli-𝜷- Hidroksi Butirat (PHB) Dari Berbagai Sumber Karbon Oleh Isolat Bakteri Dari Limbah Pabrik Gula Takalar. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin. Makassar.
Lee AJ, Dawes EA,. 1990. Occurence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial of polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. 54 : 450-472.
Misnanadiarly, AS, Husjain Djajaningrat,. 2014. Mikrobiologi Untuk Klinik Dan Laboratorium. PT Rineka Cipta, Jakarta.
Nureleana H, Sarudu, Onni S, Selaman, Rubiyah Baini, and Nor Azalina Rosli,.
2015. Evaluation on factors affecting bacteria growth in collected rainwater. Journal of Faculty of Engineering. 6 : 11-17.
Ostle, G. A and Holt, J. G,. 1982. Nile Blue A as a flourescent stain for poly-β- hidroxybutyrate. Appl environ microbial. 44 : 23-241.
43 Rakesh P, Charmi P,. 2014.Quantitative Analytical applications of FTIR
Spectroscopy in Pharmaceutical and Allied Areas; J. Adv. Pharm. Edu. &
Res. 4 : 145-57.
Rohman, A,. 2012. A Review : Applications Of Fourier Transform Infrared Spectroscopy For Quality Control Of Pharmaceutical Products. 23 : 1-8.
Seon-Won Kim, Pil Kim, Jung H. Kim,. 1999. Production of Poly (3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from Methylobacterium organophilum by potassium-limited feed-batch culture. Enzyme and Microbial Technology. 24 : 555-560.
Samsul, A, Bungaran, S, Elvi, K,. 2017. Studi pembuatan bahan alternatif plastik biodegradable dari pati ubi jalar dengan plasticizer gliserol dengan metode
melt intercalation. Jurnal Teknik Mesin Universitas Bhayangkara.
06 : 79-84.
Scott, G,. 1994. Enviromental Biodegradation of hydrocarbon polymers, in Biodegradable Plastic and polymers, (Eds. Doi. Y and K. Fukuda), Amsterdam: Elsevier sciene. B. V. 79-105.
Suardi M, Hamdani AS, Ariyati B, Suci RP, Djamaan A,. 2018. Utilization of Rice Straw (Oryza sativa Linn) Agricultural Waste as Substrate for Poly (3- Hydroxybutarate) Production Using Pseudomonas aeruginosa. Journal of Pure and Applied Microbiology. 12 : 3.
Susanti, M,. 2010. Produksi Bioplastik Poli (3-Hidroksibutirat) (P(3HB)) Secara Proses fermentasi Menggunakan Bakteri Bacillus brevis FACC-20801 dari Minyak Kelapa Sawit Sebagai Sumber Karbon. [Skripsi]. Padang. Stifarm.
Swift, YA,. 1996. Bacteriacal Polyhidroxyalkanoates. Biotechnology.
Bioenginering. 49 : 1-14.
Tarigan, J,. 2008. Penghantar Mikrobiologi. Depdiknas. Jakarta.
Valappil, S.P, Misra, S.K, Boccaccini, A, R., Keshavarz, T, Bucke, C. Dan Roy, I,. 2007. Large scale production and efficient recovery of phb with desirable material properties, from the newly characterised Baccilus cereus SPV.
Journal of Biotechnology. 132 : 251-258.
Van Der Zee M, E Pras, J Van Haveren, R Van Tuil,. 2001. Recent Advencement in The Development of Material and Products from Renewble Resources.
ATO, Business Unit Renewble Resources. Department Polymer Composites and Additives Wageningen. Netherland.
Vinod PS, Kulkarni DS, Sulochana MB,. 2018. Production and Characteriization of Polyhyroxybutirate from Halophilic Bacteria. Volume 4 : 44-52.