III. METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Prosedur Penelitian Bakteri 3.4.1.1 Pembuatan Media Umum
Media umum untuk bakteri laut yang digunakan adalah marine agar (MA). Pem- buatan media dilakukan sebelum kegiatan turun lapang dilakukan. Langkah pem- buatan MA yaitu 11,05 g bubuk media MA dilarutkan ke 200 mℓ akuades di da- lam erlenmeyer. Selanjutnya larutan media dihomogenkan di atas hot plate deng- an menggunakan magnetic stirrer hingga mendidih. Bagian mulut erlenmeyer di- tutup dengan alumunium foil dan diikat menggunakan karet agar lebih kuat dan dimasukkan ke plastik tahan panas. Setelah itu, media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC. Kemudian, media diangkat dan ditunggu suhu- nya turun. Selanjutnya, media dituang secara aseptis ke dalam cawan petri. Sete- lah media mengeras cawan petri dibalik dan disimpan di dalam kulkas atau inku- bator bersuhu ˂ 28oC untuk menjaga media agar tetap keras.
3.4.1.2 Pembuatan Media Selektif
Media tumbuh selektif Vibrio sp. adalah media thiosulphate citrate bile salt suc- rose (TCBS). Langkah pembuatan media TCBS yaitu 17,816 g bubuk media TCBS dilarutkan ke 200 mℓ akuades di dalam erlenmeyer. Selanjutnya larutan media dihomogenkan di atas hot plate dengan menggunakan magnetic stirrer hingga mendidih. Bagian mulut erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan diikat menggunakan karet agar lebih kuat. Setelah media homogen, media diang- kat dan ditunggu suhunya turun. Selanjutnya, media dituang secara aseptis ke
18
dalam cawan petri. Setelah media mengeras cawan petri dibalik dan disimpan di dalam kulkas atau inkubator bersuhu ˂ 28oC untuk menjaga media agar tetap ke- ras.
3.4.1.3 Pengambilan Sampel dan Isolasi Bakteri
Sampel Vibrio diambil sekali dalam sebulan pada pukul 07.00-11.00 WIB. Sam- pel diambil dari perairan sekitar tambak menggunakan botol sampel steril seba- nyak 50 mℓ. Botol dicelupkan ke dalam air hingga kedalaman ± 20 cm dengan dimiringkan bagian leher botol ke bawah. Botol ditutup saat masih berada dalam air untuk menghindari kontaminasi. Sampel bakteri ditandai lalu disimpan dalam cool box. Setelah sampai di Laboratorium Budidaya Perikanan Universitas Lam- pung segera dilakukan isolasi bakteri. Sampel air diambil 100 µℓ untuk ditanam secara pour plate pada media TCBS dan MA pada cawan petri. Cawan petri dila- pisi dengan plastik wrap untuk menghindari kemungkinan kontaminasi dari luar.
Sampel ditandai dengan nama stasiun dan pengulangan masing-masing. Cawan petri berisi bakteri kultur diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 36oC (Chau et al., 2011).
3.4.1.4 Perhitungan Koloni Bakteri
Perhitungan koloni bakteri dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam, metode yang digunakan berupa metode perhitungan cawan petri atau total plate count (TPC). Total koloni yang tumbuh berada pada kisaran 30-300 koloni. Hasil dari perhitungan ini digunakan sebagai nilai pendugaan jumlah bakteri yang tumbuh pada perairan sekitar tambak yang diisolasi dalam media TCBS dan MA. Perhi- tungan koloni bakteri dilakukan di Laboratorium Budidaya Perikanan, Universitas Lampung.
3.4.2 Prosedur Penelitian Plankton 3.4.2.1 Pengambilan Sampel Plankton
Sampel plankton diambil sekali dalam sebulan pada pukul 07.00-11.00 WIB. Air sampel diambil dari perairan sekitar tambak menggunakan ember sebanyak 20 ℓ.
19
Air sampel disaring menggunakan plankton net. Air sampel lalu dipindahkan ke dalam botol sampel berukuran 50 mℓ. Sampel kemudian diberi pengawet forma- lin 4% sebanyak 2-3 tetes dan diberi label pada botol sampel. Tutup botol dilapisi plastik wrap untuk menghindari kebocoran. Botol sampel disimpan di dalam cool box agar sampel plankton tidak rusak. Sampel diambil sebanyak 3 stasiun dengan 3 kali pengulangan. Sampel dipindahkan ke dalam kulkas untuk menjaga kualitas- nya. Selanjutnya pengamatan sampel plankton dilakukan di Laboratorium Budida- ya Perikanan, Universitas Lampung.
3.4.2.2 Identifikasi Plankton
Proses identifikasi dilakukan dengan mengamati sampel menggunakan mikroskop di Laboratorium Budidaya Perikanan, Universitas Lampung. Botol sampel yang berisi sampel air dihomogenkan. Sampel diambil menggunakan pipet tetes. Sam- pel diteteskan pada haemocytometer dan diamati menggunakan mikroskop. Sam- pel diamati menggunakan haemocytometer secara keseluruhan pada bagian berga- ris haemocytometer. Selanjutnya didokumentasikan dan diidentifikasi plankton menggunakan buku identifikasi berdasarkan Newell & Newell (1963) dan Sahu et al. (2013).
3.4.3 Prosedur Penelitian PCR IMNV 3.4.3.1 Ekstraksi Silika
Sampel air diambil sebanyak 500 µℓ lalu dimasukkan ke microtube, lalu ditam- bahkan 900 µℓ GT Buffer. kemudian larutan di-sentrifuge 12.000 rpm selama 3 menit. Lalu supernatan diambil 600 µℓ dan dipindahkan ke dalam microtube yang telah terisi silica sebanyak 40 µℓ. Selanjutnya sampel di-vortex dan di-sentrifuge 12.000 rpm selama 20 detik. Setelah itu supernatan dibuang dan ditambahkan 500 µℓ GT Buffer, selanjutnya di-vortex hingga larut dan di-sentrifuge 12.000 rpm se- lama 20 detik. Kemudian supernatan dibuang dan ditambahkan etanol 70% seba- nyak 1000 µℓ. Selanjutnya di-vortex hingga larut dan di-sentrifuge 12.000 rpm se- lama 20 detik. Setelah itu, etanol dibuang dan pelet dikeringkan. Kemudian DEPC
20
ddH2O ditambahkan sebanyak 1000 µℓ dan di-vortex hingga larut. Selanjutnya sampel diinkubasi selama 10 menit pada suhu 55°C. Setelah itu, larutan di-vortex dan di-sentrifuge 12.000 rpm selama 2 menit. Kemudian dipindahkan 500 µℓ ke microtube baru dan lanjut ke proses selanjutnya.
3.4.3.2 Amplifikasi
Proses amplifikasi sampel mereaksikan reagen sesuai dengan standar produk (pri- mer) yang digunakan. Produk yang digunakan yaitu IQ REALTM IMNV Quanti- tative System (farming intelligene). Komposisi reagen IQ REALTM IMNV tertera pada Tabel 4.
Tabel 4. Reagen IQ REALTM IMNV
IQ REALTM IMNV Quantitative System Jumlah
1. Real-Time PreMix 20 µℓ
2. RT Enzyme Mix 1 µℓ
3. IQzyme DNA Polymerase 2 µℓ
4. Template RNA 2 µℓ
Tabel 5. Pengaturan suhu mesin RT-PCR IMNV
Proses Suhu (°C) Waktu Siklus
Amplifikasi
Pre-denaturasi 42 30 menit 1
Denaturasi 93 15 detik 40
Annealing/Ekstensi 60 60 detik 40
Langkah selanjutnya sampel di-spindown dan dimasukkan ke dalam mesin RT- PCR yang sebelumnya telah dihubungkan dengan komputer. Proses berjalan sela- ma ± 1,5 jam. Setelah proses selesai, hasil RT-PCR ditampilkan melalui monitor dalam bentuk grafik. Grafik tersebut selanjutnya dianalisis untuk menentukan po- sitif atau negatif hasil pengujian sampel.
21
3.4.4 Prosedur Penelitian Parameter Kualitas Air
Pengukuran kualitas air pada perairan sekitar tambak diperlukan sebagai gambar- an kondisi tambak udang di Kecamatan Kalianda, serta untuk mengetahui hubung- an kualitas air dengan bakteri, Vibrio, plankton, dan IMNV. Pengukuran kualitas air dilakukan saat pagi hari, tiap pengamatan dilakukan sebanyak sekali untuk tiap stasiun pengamatan. DO diukur menggunakan DO meter. pH dan suhu diukur menggunakan pH meter. Salinitas diukur dengan refraktometer. Adapun parame- ter alkalinitas, nitrit, nitrat, amonia, dan fosfat dilakukan dengan pengambilan sampel air dan diuji dengan test kit di Laboratorium Budidaya Perikanan, Univer- sitas Lampung.
3.5 Parameter Penelitian