BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Juli sampai dengan Agustus 2019, dilakukan di Laboratorium Kimia (Terapeutik) Balai Besar POM di Padang.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat
Peralatan yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi : Seperangkat alat KCKT Shimadzu LC 20 AD plus Detector PDA SPD-M20A, Kolom X-Terra RP18 5µm ukuran 4,6 x 250 mm by Waters (18600496), Stirrer hotplate Cimerec 2, Timbangan analitik digital Radwag XA 82/220/2X, Timbangan Micro Balance RADWAG MYA2, Sonikator Branson, Pompa Vakum Sartorius, Sartorius membrane filter PVDF, Sartorius minisart syringe filters PVDF, alat gelas pyrex dengan grade A yang biasa digunakan dalam laboratorium kimia farmasi.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : sampel sediaan jadi Tiamfenikol dry syrup dengan kandungan Tiamfenikol 125mg/5mL kemasan botol 60 mL. Tiamfenikol BPFI (Baku Pembanding Farmakope Indonesia) No. Kontrol 210325 (Kb:100,24%, SP:0,16%), Water for Injection Ikapharmindo Putramas, Asetonitril gradient grade for liquid chromatography by Merck, Methanol gradient grade for liquid chromatography by Merck, aquabides.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel
Sampel yang digunakan adalah sedian jadi Tiamfenikol dry syrup dengan kandungan Tiamfenikol 125mg/5mL kemasan botol 60 mL yang dibeli di Apotik di Jl.
Thamrin, Padang Selatan, Kota Padang. Sampel Tiamfenikol dry syrup diambil 10 botol yang memiliki nomor batch yang sama.
3.3.2 Pembuatan pelarut dan fase gerak a. Pembuatan Fase Gerak
Pembuatan fase gerak dengan cara mencampurkan air dengan acetronitril dengan perbandingan 4 : 1
b. Pembuatan pelarut
Pembuatan pelarut dengan cara mencampurkan air dengan acetronitril dengan perbandingan 4 : 1
3.3.3 Pembuatan larutan baku pembanding dan larutan sampel a. Pembuatan larutan baku induk
Baku yang digunakan yaitu baku tiamfenikol BPFI yang diperoleh dari PPOMN Badan POM Jakarta. Ditimbang seksama sejumlah lebih kurang 125 mg baku pembanding tiamfenikol BPFI dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, kemudian dilarutkan dengan pelarut hingga tanda. Diperoleh larutan baku 1,25 mg/mL.
b. Pembuatan larutan baku seri 0,05 ; 0,075 ; 0,100 ; 0,125 dan 0,150 mg/mL
Larutan baku 0,050 mg/mL dibuat dengan memipet 2,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan pelarut hingga tanda dan dihomogenkan. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,45 µm.
Larutan baku 0,075 mg/mL dibuat dengan memipet 3,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan pelarut hingga tanda dan dihomogenkan. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,45 µm.
Larutan baku 0,100 mg/mL dibuat dengan memipet 4,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan pelarut hingga tanda dan dihomogenkan. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,45 µm.
Larutan baku 0,125 mg/mL dibuat dengan memipet 5,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan pelarut hingga tanda dan dihomogenkan. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,45 µm.
Larutan baku 0,150 mg/mL dibuat dengan memipet 6,0 mL larutan baku induk, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, ditambahkan pelarut hingga tanda dan dihomogenkan. Larutan disaring menggunakan penyaring membran 0,45 µm.
c. Preparasi sampel tiamfenikol suspensi (larutan sampel induk)
Disiapkan sepuluh (10) botol sampel tiamfenikol suspensi kemudian masing- masingnya dilarutkan dengan aquadest hingga tanda batas pada botol kemudian dikocok homogen, semua sampel dicampurkan ke dalam beaker glass 500 mL, kemudian distirer atau diaduk selama 30 menit. Diperoleh larutan sampel dengan konsentrasi 125mg/5 mL. Kemudian dilakukan penetapan bobot jenis sampel.
d. Pembuatan larutan sampel
Ditimbang larutan sampel induk setara 5 mL sebanyak lebih kurang 5,419 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL kemudian dilarutkan dengan pelarut 50 mL dan disonikasi selama 15 menit hingga larut lalu diencerkan dengan pelarut hingga tanda. Kemudian dipipet larutan sebanyak 4,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dilarutkan dan dihomogenkan dengan pelarut hingga tanda sehingga didapat larutan sampel dengan konsentrasi 0,1 mg/mL. Larutan disaring menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm. Perlakuan ini dilakukan sebanyak 10 kali.
e. Pembuatan larutan spiked sampel seri
Pembuatan larutan spiked sampel dibuat dari seri konsentrasi 80% ; 100 % dan 120
% dengan mencampurkan larutan sampel induk dan larutan baku induk dengan perbandingan 7:3.
Larutan spiked sampel 80 % dibuat dengan menimbang larutan sampel induk sebanyak lebih kurang 0,304 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL, lalu dipipet larutan baku induk sebanyak 5,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL yang berisikan larutan sampel induk, kemudian dilarutkan dengan pelarut 10 mL dan disonikasi selama 15 menit hingga larut lalu diencerkan dengan pelarut hingga tanda.
Larutan dipipet sebanyak 4,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dilarutkan dan dihomogenkan dengan pelarut hingga tanda. Larutan disaring menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
Larutan spiked sampel 100 % dibuat dengan menimbang larutan sampel induk sebanyak lebih kurang 0,759 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL, lalu dipipet larutan baku induk sebanyak 6,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL yang berisikan larutan sampel induk, kemudian dilarutkan dengan pelarut 10 mL dan disonikasi selama 15 menit hingga larut lalu diencerkan dengan pelarut hingga tanda.
Larutan dipipet sebanyak 4,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dilarutkan dan dihomogenkan dengan pelarut hingga tanda. Larutan disaring menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
Larutan spiked sampel 120 % dibuat dengan menimbang larutan sampel induk sebanyak lebih kurang 0,910 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL, lalu dipipet larutan baku induk sebanyak 7,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL yang berisikan larutan sampel induk kemudian dilarutkan dengan pelarut 10 mL dan
disonikasi selama 15 menit hingga larut lalu diencerkan dengan pelarut hingga tanda.
Larutan dipipet sebanyak 4,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dilarutkan dan dihomogenkan dengan pelarut hingga tanda. Larutan disaring menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm.
3.3.4 Uji Kesesuaian Sistem
Pada uji kesesuaian sistem digunakan larutan baku seri 0,100 mg/mL. Cara penetapan : larutan baku seri 0,100 mg/mL diinjeksikan sebanyak 10 µL ke dalam KCKT dengan kondisi analisis yang telah ditentukan. Penyuntikan dilakukan 6 kali, kemudian diukur luas puncak atau area baku yang diperoleh, dihitung nilai simpangan baku dan simpangan baku relatifnya.
Kriteria keberterimaan:
Dari 6 kali penyuntikan larutan baku menghasilkan kromatogram dengan nilai simpangan baku relatif (SBR) waktu retensi, luas puncak dan plat teorinya ≤ 2,0 % (The United States Pharmacopeial Convention, 2019).
3.3.5 Uji Spesivisitas
Digunakan larutan sampel dan larutan baku seri dengan konsentrasi 0,100 mg/mL.
Cara penetapan :
Larutan sampel dan larutan baku seri dengan konsentrasi 0,100 mg/mL. Masing-masing diinjeksikan sebanyak 10 µL ke dalam sistem KCKT.
Kriteria keberterimaan
a. Puncak kromatogram larutan sampel memberikan waktu retensi yang sama dengan larutan baku pembanding tiamfenikol
b. Puncak kromatogram larutan sampel memberikan spektrum sama dengan puncak kromatogram baku jika dianalisis dengan detektor PDA (Photo Diode Array detector) pada alat Shimadzu LC 20 AD dan memiliki nilai purity index mendekati 1.
3.3.6 Penetapan kurva kalibrasi
Larutan baku seri 0,050; 0,075; 0,100; 0,125 dan 0,150 mg/mL diinjeksikan sebanyak 10 µL ke dalam sistem KCKT. Dilakukan perhitungan persamaan regresi dan koefisien korelasinya (r).
Kriteria keberterimaan :
Diperoleh persamaan regresi Y = bx + a, dan koefisien korelasi (r) = ≥ 0,999 (Rohman, 2009).
3.3.7 Uji Linearitas
Pada uji linearitas digunakan larutan baku seri 0,050; 0,075; 0,100; 0,125 dan 0,150 mg/mL diinjeksikan sebanyak 10 µL ke dalam sistem KCKT, kemudian dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasinya.
Kriteria keberterimaan :
Untuk pengujian dengan kisaran 50% - 150% memiliki kriteria keberterimaan koefisien korelasi (r) ≥ 0,999 (Rohman, 2014)
3.3.8 Uji batas deteksi dan batas kuantitasi
Pada uji linearitas digunakan larutan baku seri 0,050; 0,075; 0,100; 0,125 dan 0,150 mg/mL diinjeksikan sebanyak 10 µL ke dalam sistem KCKT, kemudian dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasinya. Lalu dihitung nilai batas deteksi dan batas kuantitasinya.
3.3.9 Uji penetapan kadar sampel
Digunakan larutan sampel dengan konsentrasi 0,100 mg/mL (perlakuan secara triplo).
Cara penetapan :
Larutan sampel diinjeksikan ke dalam KCKT sebanyak 10 µL, kemudian dihitung kadarnya menggunakan persamaan regresi dari baku seri 0,050; 0,075; 0,100; 0,125 dan 0,150 mg/mL.
3.3.10 Uji Akurasi
Digunakan larutan spiked sampel konsentrasi 80%, 100 % dan 120 % (masing- masing triplo).
Cara penetapan :
Larutan spiked sampel diinjeksikan secara berurutan ke dalam KCKT sebanyak 10 µL kemudian dihitung persen perolehan kembali masing-masing tiamfenikol.
Kriteria keberterimaan :
Rentang persen perolehan kembali (recovery) untuk analit pada matriks sampel > 1 % yaitu sebesar 97 % - 103 % (Latimer, 2016).
3.3.11 Uji Presisi
Digunakan larutan sampel yang dibuat sebanyak 10 x pengulangan.
Cara penetapan :
Larutan sampel 100 % diinjekesikan ke dalam KCKT sebanyak 10 µL, kemudian dihitung nilai simpangan baku dan simpangan baku relatif area atau luas puncak sampel tiamfenikol.
Kriteria keberterimaan :
Simpangan baku relatif (SBR) yang dihasilkan untuk analit pada matriks sampel > 1 % memberikan simpangan baku relatif sebesar ≤ 2,7 % (Latimer, 2016)