Metode PCR digital nanoplate pertama yang melacak makanan yang menyebabkan alergi:
Peningkatan sensitivitas untuk mendeteksi wijen
*
Alergen makanan biji wijen
Hitungan PCR digital
´
Kata kunci:
Universitas Porto, Rua de Jorge Viterbo Ferreira, 228, Porto 4050-313, Portugal REQUIMTE-LAQV, Fakultas Farmasi,
Pelat nano DIA CO6b-1
ABSTRAK INFO PASAL
Kimia Makanan
Vila Caterina , Joana Costa , Isabel Mafra
mampu mendeteksi sejumlah kecil wijen, sesuai dengan dosis referensi yang disebutkan.
Metode berbasis DNA, khususnya PCR kuantitatif waktu nyata, telah menjadi teknik pilihan untuk mendeteksi wijen dalam makanan olahan karena spesifisitas, sensitivitas, dan keandalannya yang tinggi (Villa et al., 2022).
Beberapa pendekatan telah dieksplorasi dengan menargetkan rangkaian pengkodean alergi (terutama Ses i 1 atau Ses i 4/Ses i 5) (Brzezinski, 2007;
Koppel, ¨ van Velsen-Zimmerli, & Bucher, 2012; Mustorp, Engdahl-Axelsson, Svensson, & Holck, 2008; Schoringhumer ¨ & Cichna-Markl, 2007;
Schoringhumer, ¨ Redl, & Cichna-Markl, 2009; Torricelli, Pier-boni, Rondini, Altissimi, & Haouet, 2020) atau wilayah multikopi, seperti wilayah transkripsi internal spacer (ITS) (Lopez-Calleja, de la Cruz, Martín, Gonzalez, & García, 2015; Lopez-Calleja, García, Madrid, García, Mar-tín, & Gonz´ alez, 2017) dan sitokrom c oksidase 6b- 1 (CO6b-1)
(Villa, Costa, & Mafra, 2023).
´ 1. Perkenalan
Wijen (Sesamum indicum L.) telah muncul sebagai makanan penyebab alergi yang penting di seluruh dunia karena penerapan kebiasaan makan yang lebih sehat dan sebagai konsekuensinya peningkatan makanan yang mengandung biji wijen atau minyak (Villa, Costa, & Mafra, 2022). Oleh karena itu, wijen termasuk dalam daftar empat belas makanan dan zat penyebab alergi yang harus diberi label wajib dalam daftar bahan makanan kemasan, berapa pun jumlahnya (Peraturan (UE) No 1169/2011). Tergantung pada tingkat sensitivitas individu yang alergi, jumlah makanan yang menyebabkan alergi dalam jumlah yang tidak disebutkan karena kontaminasi silang yang tidak disengaja dapat memicu reaksi alergi yang parah, seperti anafilaksis (Remington, Baumert, Blom, Houben, Taylor, & Kruizinga, 2015; Remington dkk., 2020). Oleh karena itu, penggunaan pelabelan alergen kehati-hatian (PAL) merupakan praktik umum untuk memberi saran kepada konsumen tentang produk yang berpotensi mengandung alergen yang tidak diinginkan.
Namun, penggunaannya yang berlebihan dapat sangat mempengaruhi kualitas hidup konsumen dengan menurunnya kepercayaan mereka terhadap label dan mengurangi kebebasan memilih produk yang tersedia. Dalam kasus wijen, distribusi dosis pemicu minimal, ED01 dan ED05, masing-masing diperkirakan sebesar 0,1 mg dan 2,7 mg protein, yang dapat dikonversi menjadi wijen alergenik total dengan menerapkan faktor konversi 5,9 (Rem-ington dkk. .,
2020;Waiblinger & Schulze, 2019). Oleh karena itu, verifikasi kepatuhan pelabelan harus bergantung pada teknik yang sangat sensitif beranda jurnal: www.elsevier.com/locate/foodchem
Daftar isi tersedia di ScienceDirect
´
´
Baru-baru ini, PCR digital (dPCR) telah muncul sebagai alternatif yang layak diberitakan dibandingkan PCR real-time, yang memungkinkan untuk mengatasi beberapa keterbatasan dalam hal sensitivitas dan presisi, tidak terlalu rentan terhadap inhibitor PCR dan memberikan kuantifikasi absolut tanpa menggunakan kurva kalibrasi (Demeke & Dobnik, 2018; Quan, Sauzade,
& Brouzes, 2018). Dalam dPCR, setiap reaksi dipartisi secara acak dan tinggi menjadi beberapa partisi individual, yang didefinisikan sebagai positif atau
negatif berdasarkan ada atau tidaknya DNA target, sesuai dengan sinyal fluoresensi. Angka absolut
* Penulis yang sesuai.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.138650 Diterima 10
Agustus 2023; Diterima dalam bentuk revisi 30 Januari 2024; Diterima 31 Januari 2024 Tersedia online 4 Februari 2024
Wijen (Sesamum indicum L.) merupakan makanan penyebab alergi penting yang keberadaannya dapat menjadi penyebab reaksi alergi parah pada individu yang peka. Dalam penelitian ini, PCR digital nanoplate (ndPCR) digunakan untuk mengembangkan dua metode untuk mendeteksi jumlah jejak wijen dalam makanan olahan dan membandingkannya dengan pengujian PCR real-time yang diusulkan sebelumnya.
Dua pendekatan ndPCR independen berhasil dikembangkan, mencapai sensitivitas sebesar 5 dan 0,1 mg/kg wijen dalam adonan/biskuit, masing-masing menargetkan wilayah CO6b-1 dan ITS. Sensitivitas menggunakan kedua target ditingkatkan satu kali lipat dibandingkan dengan PCR waktu nyata dan tidak terpengaruh oleh pengolahan makanan. Sistem CO6b-1 tidak dipengaruhi oleh matriks makanan, menunjukkan kinerja serupa terlepas dari penggunaan ekstrak matriks kompleks atau DNA yang diencerkan secara serial. Di sini, ndPCR diusulkan untuk pertama kalinya untuk mendeteksi makanan yang menyebabkan alergi dengan keunggulan memberikan kinerja yang lebih baik daripada PCR waktu nyata dalam hal sensitivitas dan ketahanan.
Alamat email: [email protected] (C.Vila).
0308-8146/© 2024 Para Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier Ltd. Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by- nc-nd/4.0/).
Kimia Pangan 444 (2024) 138650
2 C.Vila dkk.
DNA target dihitung berdasarkan frekuensi partisi positif dan negatif, menggunakan distribusi binomial Poisson (Demeke & Dobnik, 2018; Pinheiro et al., 2012). Sampai saat ini, PCR digital tetesan (ddPCR), berdasarkan partisi campuran reaksi dalam ribuan tetesan individu dalam emulsi air-minyak, telah diterapkan untuk mendeteksi beberapa makanan yang menyebabkan alergi, misalnya ikan ( Daga, Cau, Tilocca, Soro, Marongiu, & Vodret, 2019), kedelai (Mayer, Schuller, Viehauser, & Hochegger, 2019), kacang tanah (Eischeid, 2022) dan seledri (Cau et al., 2021) dengan hasil yang menjanjikan. Pada tahun 2020, teknik PCR digital mikrofluida nanoplate (ndPCR) baru muncul untuk mengatasi tantangan terkait dengan pembentukan tetesan yang tidak konsisten, alur kerja yang rumit dan memakan waktu (dengan beberapa langkah praktis), pembacaan tetesan yang lambat, dan keterbatasan terkait
ketidakpastian tes. NdPCR mikrofluida menggunakan partisi tetap untuk mencegah variasi dalam ukuran dan penggabungan (fenomena yang terkait dengan pembentukan tetesan). Oleh karena itu, teknologi ini memberikan prosedur yang lebih cepat dan mudah, di mana partisi, termosiklik, dan pencitraan semuanya diintegrasikan ke dalam satu instrumen yang sepenuhnya otomatis (QIAGEN, 2021).
Pengujian ndPCR dilakukan dalam 24-sumur QIAcuity Nanoplates dengan 26 k partisi (Qiagen, Hilden, Jerman), menggunakan 40 ÿL campuran reaksi yang mengandung 10 ÿL ekstrak DNA (tidak diencerkan), 1 × QIAcuity Probe Mastermix, 800 mM setiap primer (SesCtc-F2/SesCtc-R2 atau S-ITS-F/S-ITS- R), 400 mM setiap probe (SesCtc-P atau S-ITS-P) dan air bebas RNase (Qiagen, Hilden , Jerman). Program suhu terdiri dari denaturasi awal pada 95 ÿC selama 5 menit, diikuti oleh 50 siklus pada 95 ÿC selama 15 detik, ditambah anil/ekstensi pada 65 ÿC selama 30 detik (untuk primer/probe SesCtc-F2/
SesCtc-R2/SesCtc-P), atau 50 siklus pada 95 ÿC selama 10 detik, 58 ÿC selama 10 detik, dan 72 ÿC selama 30 detik (untuk primer/probe S-ITS-F/S- ITS-R/ S-ITS-F/S-ITS-R), dengan siklus ekstensi akhir pada 72 ÿC selama 5 menit.
Dalam penelitian ini, ndPCR dengan probe TaqMan, yang menargetkan gen mitokondria CO6b-1 dan wilayah ITS, diusulkan untuk pertama kalinya untuk deteksi spesifik wijen yang menyebabkan alergi pada produk makanan.
Kinerja kedua pendekatan ndPCR akan dibandingkan dengan pengujian PCR real-time yang dikembangkan sebelumnya (Villa et al., 2023) dan dinilai dalam hal sensitivitas, linearitas, presisi dan ketahanan, terkait pengaruh pemrosesan dan matriks makanan. Kedua metode ndPCR juga akan diuji dengan sampel komersial untuk menunjukkan potensi penerapannya pada makanan olahan.
Hasil ini akan menjelaskan penerapan nanoteknologi terbaru untuk dPCR yang bertujuan untuk mengukur wijen sebagai makanan yang menyebabkan alergi.
Konsentrasi primer/probe ditentukan berdasarkan instruksi pabrik (Qiagen, Hilden, Jerman), sedangkan kondisi siklus termal sebelumnya dioptimalkan dengan PCR kualitatif dan real-time (Villa et al., 2023). Data dianalisis dengan QIAcuity Software Suite EN Versi 2.1 (Qiagen, Hilden, Jerman). Konsentrasi absolut setiap sampel dinyatakan sebagai salinan/µL oleh perangkat lunak dan dihitung dengan mengalikan salinan molekul target per partisi dengan jumlah partisi yang valid. Karena molekul target terdistribusi secara acak, distribusi Poisson digunakan untuk menghitung salinan molekul target per partisi positif, dengan interval kepercayaan 95%. Untuk membedakan partisi positif/negatif (mengandung/tidak mengandung DNA target), ambang batasnya diatur secara otomatis oleh perangkat lunak. Hanya sumur dengan lebih dari 24.000 partisi valid yang dipertimbangkan. Setiap proses ndPCR diulang dua kali menggunakan dua ulangan dan kontrol non-templat di masing-masing ulangan.
2.1. Pengambilan sampel dan ekstraksi DNA
Nano, BMG Labtech, Ortenberg, Jerman) menggunakan aksesori pelat LVis dengan volume yang diperkecil (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman). Kandungan DNA dinilai dengan protokol kuantifikasi asam nukleat dengan jenis sampel yang ditentukan untuk DNA untai ganda dan data serapan dievaluasi dengan perangkat lunak analisis data MARS (BMG Labtech, Ortenberg, Jerman).
Semua ekstrak disimpan pada suhu -20 ÿC sampai analisis lebih lanjut.
2.2. Primer dan probe Oligonukleotida
Campuran model mengandung 100,000 mg/kg, 50,000 mg/kg, 10,000 mg/kg, 5000 mg/kg, 1000 mg/kg, 500 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg /kg, 1 mg/kg, 0,5 mg/kg dan 0,1 mg/kg (b/b) wijen putih dalam adonan biskuit gandum telah disiapkan.
Semua bahan yang digunakan untuk pembuatan campuran model diperoleh di pasar lokal. Sebelum pembuatan campuran model, biji wijen digiling menjadi bubuk halus menggunakan pisau laboratorium Grindomix GM200 (Retsch, Haan, Jerman). Adonan biskuit dibuat dengan perbandingan bahan sebagai berikut: 750 g tepung terigu, 750 g tepung gandum, 720 g mentega, 12 butir telur, dan 540 mL air. Campuran pertama yang mengandung 100.000 mg/kg (10%) wijen dibuat dengan mencampurkan 270 g adonan dan 30 g biji wijen bubuk. Campuran berikut ini dibuat lebih lanjut dengan penambahan adonan berturut-turut, mulai dari campuran pertama, hingga mencapai konsentrasi 0,1 mg/kg (0,00001 %) wijen dalam adonan. Setiap campuran dibagi menjadi dua bagian:
satu segera disimpan pada suhu ÿ20 ÿC (campuran mentah), sedangkan sisa adonan dipanggang dalam oven pada suhu 180 ÿC selama 30 menit untuk mensimulasikan pembuatan biskuit yang mengandung wijen. Semua bahan dan wadah sebelumnya diolah dengan larutan dekontaminasi DNA (DNA-ExitusPlus™; AppliChem, Darmstadt, Jerman) dan semua campuran model dihomogenisasi secara terpisah di pabrik pisau laboratorium, diidentifikasi dan disimpan pada suhu ÿ20 ÿC hingga DNA ekstraksi.
Satu set primer (SesCtc-F2/SesCtc-R2 – ATCTCCATC-CAGCGTTGCTGTT/
TTGGAAGCGTCAACCTCGGC) dan probe hidrolisis (SesCtc-P – FAM- TGAACAGTTTCTCCGCCGCCGCCCAA-BHQ-1) menargetkan urutan 129-bp dari gen CO6b-1 mitokondria ses-ame digunakan di sini (Villa et al., 2023).
Rangkaian primer kedua (S-ITS-F/S-ITS-R – CCAGTGGTGGTTGAACGC/
CCTTTGGGTCCAACGTGAT) dan probe hidrolisis (S-ITS-P – FAM- TCAACTCGCGTGCTGTCG-BHQ-1) menargetkan urutan 84-bp wilayah ITS juga digunakan (Lopez-Calleja et al., 2015) untuk mendeteksi wijen. Semua primer dan probe disintesis oleh Eurofins Genomics (Ebersberg, Jerman).
Spesifisitas primer sebelumnya telah dikonfirmasi dengan menggunakan 60 spesies tumbuhan dan hewan non-target yang sering digunakan dalam produk makanan (Villa et al., 2023).
Sampel komersial (n = 9) yang mengandung atau dengan “mungkin mengandung wijen” (PAL), termasuk kue kering, kerupuk, produk roti, batangan energi, dan sosis, diperoleh di pasar lokal untuk penerapan pengujian. Sampel digiling dan dihomogenisasi seperti yang dijelaskan untuk campuran model dan disimpan pada suhu ÿ20 ÿC sampai ekstraksi DNA.
Kapasitas amplifikasi ekstrak dievaluasi dengan PCR kualitatif menggunakan primer universal (18SRG-F/18SRG-R – CTGCCCTAT-CAACTTTCGATGGTA/
TTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCA) yang menargetkan urutan 113-bp dari gen nuklir 18S rRNA eu-kariota yang sangat terkonservasi ( Costa, Oliveira, &
Mafra, 2013).
DNA dari campuran model dan sampel diekstraksi menggunakan NucleoSpin® Food kit (Macherey-Nagel, Düren, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik, dengan sedikit modifikasi (Villa et al., 2023). Hasil dan kemurnian ekstrak DNA dinilai dengan spektrofotometri UV pada pembaca lempeng mikro serapan (SPECTROstar
2.3. PCR digital pelat nano
´
2.4. Analisis statistik 2. Bahan dan metode
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism versi 8.0.2 (GraphPad Software, San Diego, CA). Seluruh data yang berdistribusi normal menurut uji Shapiro-Wilk dianalisis dengan uji one sample t- test. Data yang mengikuti distribusi tidak normal diserahkan ke uji Mann-Whitney non- parametrik untuk menilai signifikansi perbedaan antara jumlah salinan/µL untuk matriks yang berbeda (adonan, oven-
Machine Translated by Google
Setiap campuran model dianalisis dalam rangkap dua dalam dua pengujian independen. Angka tersebut mewakili satu pengujian yang representatif.
Gambar 1. 1D-Scatterplot amplifikasi ndPCR yang menargetkan gen CO6b-1 (A, B) dan wilayah ITS (C, D) wijen dalam campuran model adonan (A, C) dan biskuit (B, D).
Dalam sistem yang menargetkan gen CO6b-1, perbedaan partisi positif/negatif berhasil dicapai untuk semua campuran model yang diuji (Gambar 1A dan B). Mengenai sistem yang menyasar wilayah ITS, untuk campuran mentah dan olahan yang mengandung 1.000 mg/kg wijen, kejenuhan sistem dapat diamati karena tingginya konsentrasi target (Gambar 1C dan D). Oleh karena itu, level spiking ini dihilangkan dari proses ITS dan analisis selanjutnya. Selain itu, mengenai tingkat spiking lainnya, “efek hujan” latar belakang terlihat, menunjukkan pengikatan non-spesifik atau penghambatan parsial pada beberapa partisi karena kemampuan amplifikasi sistem yang tinggi. Temuan ini menunjukkan transferabilitas sistem ITS yang kurang efektif dari PCR real-time ke ndPCR dibandingkan dengan CO6b-1 namun tetap mempertahankan sensitivitasnya yang tinggi.
Faktanya, sistem ITS tampaknya lebih disukai dengan memuat jumlah DNA yang lebih rendah, yang dapat disimpulkan dari hasil Gambar 1C dan D. Untuk meningkatkan perilaku metode yang menargetkan wilayah ITS, pengurangan lebih lanjut dalam jumlah DNA memuat DNA atau pengenceran ekstrak dapat dilakukan.
Pertama, untuk memahami kemampuan sistem dalam memisahkan partisi positif dan negatif dengan jelas, plot sebar 1D dianalisis (Gbr. 1).
Namun, penting juga untuk mempertimbangkan bahwa pengurangan berlebihan pada DNA yang dimuat dapat mempengaruhi sensitivitas sistem ITS. Oleh karena itu, untuk ndPCR ITS, kompromi antara sensitivitas dan efisiensi harus seimbang.
3.1.1. Sistem CO6b-1
Mengenai ndPCR yang menargetkan gen CO6b-1, rentang dinamis pengujiannya adalah antara 1.000 mg/kg dan 5 mg/kg, sesuai dengan kandungan DNA wijen sebesar 100,2 hingga 0,422 salinan/µL dalam adonan dan 67,2 hingga 0,262 salinan/µL dalam adonan. salinan/µL dalam biskuit (Tabel 1). LOD, yang didefinisikan sebagai konsentrasi terendah di mana 95 % ulangan terdeteksi (Bustin et al., 2009; ENGL, 2015), ditetapkan sebagai 5 mg/kg dalam campuran model mentah dan olahan. Pada tingkat ini, jumlah salinan DNA wijen adalah 0,422±0,162 untuk campuran model mentah dan 0,262±0,074 untuk campuran model yang diproses, yang berarti bahwa di bawah tingkat ini potensi amplifikasi agak rendah. Untuk memastikan hal ini, kadar 1 mg/kg juga diuji, namun pada adonan dan biskuit, tidak ada partisi positif yang konsisten untuk n = 4 proses ndPCR.
Metode ini menunjukkan presisi tinggi, dengan nilai CV di bawah 25 %, kecuali kadar spiking 10 mg/kg pada
3.1. Evaluasi kinerja ndPCR
Pengembangan dua metode ndPCR untuk mendeteksi wijen mengikuti protokol PCR real-time dengan probe Taq-Man yang dilaporkan sebelumnya, menargetkan gen mitokondria CO6b-1 dan wilayah wijen ITS (Villa et al., 2023) . Kondisi optimal dari kedua pengujian PCR real-time dicapai dengan parameter analitik yang dapat diterima, yang menjadi titik awal untuk pengembangan pendekatan ndPCR yang diusulkan. Oleh karena itu, primer dan probe yang menargetkan gen CO6b-1 dan wilayah ITS digunakan di ndPCR untuk memperkuat campuran model mentah dan olahan (adonan dan biskuit) yang mengandung wijen dalam jumlah yang diketahui dalam kisaran 1.000–0,1 mg/kg.
Pedoman Digital MIQE (Informasi Minimum untuk Publikasi Eksperimen PCR Digital Kuantitatif) telah dipertimbangkan dengan cermat, dengan memenuhi semua persyaratan untuk pengembangan jenis pengujian ini (The dMIQE Group dan Huggett, 2020; Huggett dkk., 2013 ).
3. Hasil
biskuit panggang dan pengenceran serial) pada tingkat spiking yang sama. Perbedaan statistik yang signifikan dipertimbangkan ketika p < 0,05.
Untuk evaluasi kinerja metode, beberapa parameter dinilai, termasuk rentang dinamis, linearitas, presisi, dan batas deteksi (LOD). Korelasi antara jumlah salinan/µL dan kandungan wijen efektif ditentukan dengan menggunakan campuran model mentah dan olahan. Tabel 1 menunjukkan perkiraan jumlah salinan DNA untuk setiap tingkat konsentrasi campuran model dan DNA wijen yang diencerkan secara serial untuk kedua rangkaian target, serta jumlah total partisi positif/valid yang diperlukan untuk memvalidasi pengujian.
B
D C A
4
Kimia Pangan 444 (2024) 138650
1000
4.0 67,2±3,7
0,1
tidak 1,23±0,07
Tidak ada partisi positif
50
1 0,1
Pengenceran serial dari adonan 100 4425.4±34.1
2.7
10.7 tidak
74±8 29,4 23±5
4.1 6130,0±206,7
67,2±1,8
1
0,253±0,80 1
433,0±36,4
CV (%)
25.444±41 25.453±5 25.453±13 25.570±215 25.447±10
2,40±0,16
1.265±31 583±17 791±130
tidak 0,422±0,162
1.800±192 1.253±53 143±11
8.6
4.6 Adonan
100 1
100,2±6,6
Biskuit
14.2 5
Adonan
10
660±27 130±16 6±3 DNA (salinan/ µL
± SD)a
1.8
19,7±2,2
130±17
Pengenceran serial dari biskuit 100 1876,4±85,7
7.1
5.2 DIA
5 100
6.1 0,648±0,092
10
9±1
24.727±113 25.332±161 25.449±11 25.452±15 2.1
13.4 49,1±0,9
Berarti wijen
191,2±7,9 C.Vila dkk.
28.3
0,1
0,262±0,074 1
6±2 8.0
10 500
1,36±0,19 3,54±0,32
12.9 10
100 100 50
0,1 CO6b-1
1
25.392±155 25.449±23 25.433±50 25.437±31 13,8 12±2
0,66±0,09 5
3.4 1000
31.7
18,4±0,7 1
5,3 20±3 162±57 82±21
Biskuit
23.694±299 6.817±546 843±75 36,2±0,8
7,04±0,94
10
8,7 42±3 2,24±0,19
18.781±340 3.293±168 362±39 3,95±0,28
1,23±0,36
24.646±254 25.445±17 25.452±7 25.450±3 6,45±0,69
50
5.5
5
tidak
5,6 9,8 98±10 500
100
8.4 11.4 18.1 Pengenceran serial dari adonan 500
Target Wijen (mg/kg)
50 10
1
6,6 44±3 17.476±343 3.795±417 335±67 7,00±0,26
33,3±2,9 100
6.6
221,4±31,5
14,3 12±2
Tidak. partisi d yang valid
46,2±2,6 5,32±0,52 Pengenceran serial dari biskuit
9,87±1,1 4,83±0,87
8±2
0,8
10
25.110±626 25.459±17 25.470±17 25.454±11 3,8 130±5
479,7±24,7
13,7 25±4 31,2±1,0
500
7,72±0,62
1583,8±93,4
9,2 65±6 10
0,464±0,060
25.440±53 25.383±94 25.446±19 25.465±7 25.436±37 25.458±4 25.438±14 25.398±88 25.446±30 25.366±125 25.456±26 38.4
23.912±560 7.493±297 612±57 3.2
25.476±8 25.428±98 25.446±15 25.419±70 25.459±1 25.452±7
11.1
Nilai rata-rata pengujian ulangan (n = 4) ± standar deviasi (SD) dari dua proses independen.
Jumlah partisi positif.
CV, koefisien variasi.
Tabel 1
Hasil estimasi salinan DNA ekstrak wijen dari campuran model dan pengenceran serial yang diperoleh dengan ndPCR menargetkan sekuens CO6b-1 dan ITS, dengan jumlah partisi positif/
valid masing-masing.
Jumlah partisi yang dianggap valid oleh sistem; ND Tidak terdeteksi.
B C
Machine Translated by Google
3.1.2. DIA
adonan dan 5 mg/kg wijen dalam adonan dan biskuit, sesuai dengan
konsentrasi wijen terendah, dan biasanya diharapkan memperoleh keandalan yang lebih rendah
(Tabel1). Dalam hal linearitas, dengan memplot perkiraan jumlah salinan/µL sebagai fungsi dari kandungan wijen (mg/kg), koefisien korelasi (R2 ) masing-masing sebesar 0,9735 dan 0,9980 diperoleh dalam sistem analisis adonan dan biskuit
(Gbr. 2).2A), yang mewakili linearitas yang dapat diterima/tinggi
(Bustin et al., 2009; ENGL, 2015).Kisaran dinamis ndPCR yang menargetkan wilayah ITS adalah antara 100 mg/kg dan 0,1 mg/kg, sesuai dengan kandungan DNA wijen sebesar 6130,0 dan 6,45 salinan/µL pada adonan dan 1538,8 dan 1,36 salinan/µL pada biskuit, masing-masing
(Tabel1). Oleh karena itu, LOD ditetapkan sebesar 0,1 mg/kg untuk campuran model mentah dan olahan, yang merupakan tingkat terendah yang diuji. Namun, karena pada tingkat ini, jumlah salinan DNA berkisar antara 6,45±0,69 hingga 1,36±0,19, masing- masing untuk adonan dan biskuit, maka diperkirakan akan mencapai tingkat
0,01 mg/kg wijen dalam adonan, tetapi tidak pada biskuit. . Metodenya disajikan dengan tinggi
Gambar 2. Nomor salinan DNA sebagai fungsi kandungan wijen (mg/kg) yang diperoleh dengan uji ndPCR yang menargetkan gen CO6b-1 (A, C, E) dan wilayah ITS (B, D, F). Jumlah salinan direpresentasikan sebagai rata-rata dari dua ulangan dalam dua pengujian independen (n = 4). Grafik A dan B membandingkan jumlah salinan DNA yang diperoleh dalam adonan dan biskuit untuk mengevaluasi pengaruh pemrosesan. Grafik C dan D membandingkan jumlah salinan DNA yang diperoleh dalam campuran model dengan pengenceran serial mulai dari 1000 mg/kg wijen dalam adonan dan grafik E dan F membandingkan data yang sama dalam biskuit dengan pengenceran serial untuk mengevaluasi pengaruh matriks makanan.
*Perbedaan signifikan antara matriks pengolahan makanan (adonan atau biskuit) atau antara campuran model dan pengenceran serial (p < 0,05), setelah uji satu sampel atau uji Mann- Whitney, masing-masing untuk distribusi normal dan tidak normal.
3.3. Pengaruh matriks makanan
Untuk menyelidiki pengaruh matriks makanan pada pengujian ndPCR, ekstrak DNA adonan dan biskuit dengan tingkat spiking tertinggi (1.000 mg/kg) diencerkan secara serial untuk mencapai kandungan DNA wijen yang sama seperti pada campuran model yang dianalisis di kedua sistem. Dengan cara ini, kemunculan inhibitor PCR dari matriks makanan semakin berkurang. Gambar 4 menunjukkan perbandingan jumlah salinan DNA rata-rata yang diperoleh dari ekstrak campuran model dan ekstrak yang diencerkan secara serial serta bias masing-masing. Bias yang dihitung mewakili penyimpangan persentual antara data jumlah salinan yang diperoleh di setiap tingkat pengenceran serial, yang dianggap sebagai nilai sebenarnya, dan data yang sama dari campuran model (nilai prediksi). Nilai bias antara ÿ21,8 % dan 0,1 % diperoleh dalam sistem CO6b-1 untuk campuran adonan, yang berada dalam kisaran yang dapat diterima yaitu ±25,0 % dari nilai sebenarnya, kecuali satu tingkat spiking (500 mg/kg) dengan bias sebesar 37% (Tabel 1).
Pada biskuit, data bias berkisar antara ÿ14,0 % dan 3,7 %, dengan hanya satu campuran (50 mg/kg) yang berada di luar kriteria penerimaan (-36,7 %). Dalam sistem ITS untuk campuran adonan, bias yang dihitung bervariasi antara 10,8 % dan 21,3 %, dengan dua tingkat lonjakan (100 mg/kg dan 1 mg/kg) di luar kisaran yang dapat diterima (masing- masing 38,5 % dan ÿ28,1). Dalam kasus campuran biskuit, sistem ITS menunjukkan bias antara ÿ15,6 % dan 15,8 %, dengan hanya tingkat terendah (0,1 mg/kg) di atas kriteria penerimaan (43,2%) (Gbr. 4).
Secara umum, data menunjukkan bahwa sistem ITS lebih dipengaruhi oleh matriks makanan dibandingkan dengan CO6b-1. Dalam hal sensitivitas, sistem CO6b-1 tidak terpengaruh oleh matriks makanan karena LOD dipertahankan (5 mg/kg) baik untuk campuran model maupun untuk pengenceran serial adonan dan biskuit. Jumlah salinan DNA wijen berkisar antara 0,422 hingga 0,464 atau 0,262–0,253 untuk campuran model dan pengenceran serial adonan atau biskuit, yang cukup rendah, artinya batas amplifikasi dicapai pada 5 mg/kg wijen dalam matriks . Untuk sistem ITS, sensitivitas juga dipertahankan pada 0,1 mg/kg wijen dalam matriks dan pengenceran serial (Tabel 1).
Namun, mengingat jumlah salinan DNA wijen pada tingkat ini adalah 6,45±0,69 untuk campuran mentah, maka diharapkan dapat mencapai tingkat deteksi di bawah 0,1 mg/kg wijen dalam adonan.
Gambar 2(C – F) menunjukkan grafik yang menggambarkan jumlah salinan/µL dan kandungan wijen (mg/kg) dalam campuran model atau pengenceran serial. Kurva yang diperoleh dalam sistem CO6b-1 hampir tumpang tindih, dengan kemiringan masing-masing sebesar 0,106 dan 0,099 untuk campuran adonan dan pengenceran serial yang sesuai, serta kemiringan masing-masing sebesar 0,068 dan 0,067 untuk biskuit dan pengenceran serial yang sesuai (Gbr. 2C dan E). Sistem ITS menunjukkan kemiringan yang berbeda antara campuran model (61,74) dan pengenceran serial (44,26), menunjukkan efek matriks makanan yang lebih nyata pada campuran adonan, sedangkan pada campuran biskuit, perbedaan kemiringannya minimal (18,75 vs. 15,67, untuk campuran model dan pengenceran serial, masing-masing) (Gbr. 2D dan F). Analisis statistik juga mengkonfirmasi pengaruh matriks makanan dalam sistem ITS, dengan perbedaan campuran adonan yang lebih signifikan. Linearitas pengenceran serial yang dimulai dari adonan yang mengandung 1.000 mg/kg wijen sangat tinggi, dengan R2 masing-masing sebesar 0,999 dan 1,0 pada sistem yang menargetkan rangkaian CO6b-1 dan ITS. Mengenai pengenceran serial yang dimulai dari 1.000 mg/kg wijen dalam biskuit, linearitasnya juga sangat tinggi, dengan nilai R2 masing-masing sebesar 0,998 dan 1,0 pada sistem CO6b-1 dan ITS.
sistem, tingkat degradasi rata-rata diperoleh sebesar 63%, dengan nilai berkisar antara 45% dan 79% (Gbr. 3). Selain itu, tidak dapat dikesampingkan kemungkinan pemrosesan berkontribusi terhadap ekstraksi DNA yang kurang efisien karena ekstrak biskuit menghasilkan hasil DNA yang sedikit lebih rendah (150–190 ng/µL) dibandingkan ekstrak adonan (190–220 ng/µL). Meskipun tingkat degradasi DNA tinggi dan/atau ekstraksi DNA sedikit kurang efisien dalam sampel yang diproses, kinerja kedua sistem ndPCR tidak terpengaruh oleh pemanggangan dalam oven karena LOD yang dicapai tetap tidak berubah setelah pemrosesan (5 mg/kg dan 0,1 mg/kg untuk sistem CO6b-1 dan ITS).
Untuk menganalisis pengaruh pengolahan makanan terhadap kinerja metode ndPCR, grafik yang menggambarkan jumlah salinan/µL terhadap kandungan wijen (mg/kg) dalam adonan dan biskuit dibandingkan (Gambar 2A dan 2B). Selain itu, laju degradasi DNA untuk setiap tingkat wijen yang terjadi dalam campuran model yang diproses dihitung sehubungan dengan jumlah salinan/µL yang diperoleh dalam campuran adonan (Gbr. 3), menggunakan ekspresi:
3.2. Pengaruh pengolahan makanan
presisi, dengan semua data CV di bawah nilai yang dapat diterima yaitu 25 % (Bustin et al., 2009; ENGL, 2015). Sistem ITS menunjukkan linearitas yang tinggi, dengan R2 sebesar 0,9996 dan 0,9984 seperti yang ditunjukkan oleh grafik yang memplot jumlah salinan DNA wijen/µL dan kandungan wijen sebenarnya (mg/kg) masing-masing dalam adonan dan biskuit (Gbr. 2B).
Copy numberdough - Salin nomor biskuit
Setelah pemrosesan, jumlah salinan DNA selalu lebih rendah dibandingkan yang diperoleh dalam adonan (Tabel 1), menunjukkan bahwa degradasi DNA berpotensi disebabkan oleh proses pemanggangan dalam oven. Fakta ini juga terlihat jelas pada Gambar 2A dan 2B dengan perbedaan yang cukup besar antara kemiringan kurva (masing-masing 0,1057 vs.
0,0688 dan 61,741 vs. 15,669 untuk adonan vs. biskuit dalam sistem CO6b-1 dan ITS).
Selain itu, analisis statistik menunjukkan bahwa hampir semua campuran adonan dan biskuit berbeda secara statistik untuk kandungan wijen yang sama dan bahwa degradasi DNA lebih nyata pada sistem ITS dibandingkan pada CO6b-1. Dalam sistem CO6b-1, laju degradasi bervariasi antara 33 % dan 54 %, sesuai dengan laju rata-rata degradasi DNA sekitar 43 % untuk semua campuran, tidak termasuk campuran yang mengandung 100 mg/kg wijen yang menunjukkan laju degradasi sebesar 10%. Mengenai ITS
Salin nomor adonan Tingkat degradasi DNA (%) = × 100
Gambar 3. Laju degradasi DNA wijen pada campuran model olahan diperkirakan berdasarkan kandungan relatif DNA wijen pada campuran model biskuit terhadap DNA wijen pada campuran adonan untuk sistem CO6b-1 (A) dan ITS (B). Degradasi DNA dalam campuran adonan mencapai 0% (tidak ada degradasi).
6
Kimia Pangan 444 (2024) 138650 C.Vila dkk.
Machine Translated by Google
Gambar 4. Grafik yang mewakili nilai rata-rata konsentrasi absolut uji ulangan (n = 4) dan nilai bias masing-masing (%) yang terkait dengan jumlah salinan/µL yang diperoleh dalam campuran model dan dalam DNA encer serial mulai dari spiking 1000 mg/kg level ((nilai rata-rata dari campuran model – nilai rata-rata dari pengenceran serial)/ nilai rata- rata dari pengenceran serial ×100) yang diperoleh dalam sistem CO6b-1 (A, C) dan ITS (B, D) menganalisis mentah (A, B) dan sampel yang diproses (C, D).
Baik sistem CO6b-1 maupun ITS diuji penerapannya untuk menganalisis sampel komersial dengan informasi pelabelan yang relevan, yaitu dengan wijen sebagai bahan atau dengan pelabelan pencegahan wijen. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 2. Metode yang menargetkan gen CO6b-1 mendeteksi wijen pada 3 dari 9 sampel. Sampel ini berupa roti yang mengandung 2,2 % biji wijen (#5), batangan energi dengan kacang tanah yang labelnya menyatakan “mungkin mengandung sisa wijen” (#6) dan sosis rusa merah yang dilapisi biji wijen (#9). Sistem ITS mampu mendeteksi wijen pada 5 dari 9 sampel, termasuk tiga sampel yang telah diidentifikasi dengan metode CO6b-1, dan dua sampel tambahan dengan label kehati-hatian “mungkin mengandung jejak wijen”, yaitu cookies (#1) dan bola energi (#7). Membandingkan perkiraan kandungan wijen yang diperoleh dengan kedua metode, terdapat beberapa perbedaan yang dapat dibenarkan oleh kejenuhan yang dicapai dengan penanda ITS pada sampel #5 dan #9, yang terakhir tidak mungkin untuk diukur. Oleh karena itu, estimasi kandungan yang dapat diandalkan untuk sampel #5 dan #9 masing-masing adalah 438,6 dan 3786,7 mg/kg (0,04 dan 0,4
%), yang diperoleh dengan sistem CO6b-1. Sebaliknya, estimasi kandungan yang dapat diandalkan untuk sampel #6 diperoleh dengan sistem ITS (1,13 mg/kg) karena nilai penanda CO6b-1 berada di bawah LOD (<6 partisi). Oleh karena itu, semua sampel telah sesuai dengan informasi yang tertera pada label, baik sebagai bahan wijen untuk dua sampel (#5 dan #9) maupun sebagai label pencegahan untuk sampel lainnya.
4. Diskusi
thermocycling dalam sejumlah besar partisi, memberikan kuantifikasi asam nukleat yang tepat, dengan reproduktifitas yang lebih tinggi dan kerentanan yang lebih rendah terhadap inhibitor PCR dibandingkan PCR kuantitatif waktu nyata (Huggett et al., 2013). dPCR untuk analisis makanan telah digunakan dalam deteksi GMO (Wang et al., 2019), otentikasi makanan (Kumar, Vishnuraj, Vaithiyanathan, Srini-vas, Chauhan, & Barbuddhe, 2023), deteksi patogen dalam makanan (Fang, Zhou, Wang, & Shi, 2023) dan alergen makanan, yang sebagian besar didasarkan pada teknologi droplet (ddPCR). Baru-baru ini, ndPCR mikrofluida muncul sebagai alternatif yang layak diberitakan yang
menggabungkan keunggulan dPCR yang terkenal (kuantifikasi absolut tanpa memerlukan kurva kalibrasi dan tanpa terpengaruh oleh inhibitor PCR) dengan nanopartisi yang sangat presisi dan akurat. NdPCR menyediakan analisis yang sepenuhnya terintegrasi dan otomatis, mulai dari pembagian menjadi ribuan partisi, hingga proses termosiklik dan pencitraan (QIAGEN, 2021). Karakteristik ini membuat teknik ini lebih mudah dan cepat untuk dilakukan serta tidak terlalu terpengaruh oleh manipulasi pengguna. Selain itu, migrasi kondisi thermocycling dari PCR real-time ke ndPCR juga sederhana, sehingga mengurangi biaya yang terkait dengan proses optimasi (QIAGEN, 2021).
3.4. Analisis sampel komersial
Hal penting yang harus diingat ketika menganalisis alergen makanan adalah sensitivitas metode, dengan mempertimbangkan persyaratan untuk mendeteksi dan mengukur tingkat jejak makanan yang menyebabkan alergi, sesuai dengan dosis referensi yang dilaporkan untuk menginduksi reaksi merugikan yang objektif pada pasien yang peka ( Biro Alergen , 2019;Holzhauser et al., 2020). Sensitivitas dapat dipengaruhi oleh berbagai aspek, seperti keberadaan inhibitor PCR dari matriks makanan dan perlakuan panas yang diterapkan, serta penanda molekuler spesifik yang dipilih (Holz-hauser, 2018).
Oleh karena itu, penelitian ini mengusulkan, untuk pertama kalinya, metode ndPCR dengan sensitivitas yang lebih baik untuk mendeteksi makanan yang menyebabkan alergi, dengan menargetkan wijen sebagai studi kasus. Selain itu, kemampuan transfer metode PCR real-time yang dikembangkan sebelumnya dengan probe TaqMan
Ketertarikan terhadap dPCR untuk analisis pangan berkembang pesat karena kemajuan teknologinya, menjadikannya teknologi yang praktis dan semakin terjangkau.
dPCR didasarkan pada pembagian
Kimia Pangan 444 (2024) 138650
8 (Waiblinger & Schulze, 2019), penerapan teknologi ini pada makanan komersial yang menargetkan sistem ITS akan memungkinkan perlindungan terhadap 99% populasi yang alergi wijen. Selain kesamaan antara ndPCR dan protokol PCR real-time, kedua teknik ini memerlukan waktu kurang dari 2 jam untuk thermocycling dan akuisisi data dalam satu langkah, berbeda dengan ddPCR yang jauh lebih memakan waktu dan terfraksinasi (mencakup beberapa langkah), sehingga mewakili keunggulan utama ndPCR dibandingkan ddPCR.
Saat menganalisis makanan kompleks, penting juga untuk mempertimbangkan dampak pengolahan makanan dan matriks makanan. Perlakuan termal sering digunakan dalam pembuatan produk makanan, yang dapat menyebabkan degradasi analit target, baik DNA atau protein, sehingga berdampak negatif terhadap integritasnya (Costa, Fernandes, Villa, Oliveira, & Mafra, 2017; Holzhauser, 2018 ). Pada saat yang sama, matriks makanan yang mengandung molekul target mengandung beberapa komponen (antara lain karbohidrat, lipid, protein, garam) yang dapat sangat mempengaruhi hasil dan kemurnian ekstrak DNA dan, akibatnya, bertindak sebagai PCR dalam -hibitor, yang menurunkan efisiensi PCR dan menyebabkan analisis kuantitatif tidak akurat (Holzhauser, 2018). Sistem ndPCR di sini tidak terpengaruh oleh pemrosesan makanan karena parameter kinerja linearitas, presisi, dan sensitivitas dipertahankan ketika
Di sini, sistem ndPCR yang dikembangkan dapat mendeteksi serendah 5 mg/kg dan 0,1 mg/kg wijen dalam campuran model, masing-masing menargetkan gen CO6b-1 dan wilayah ITS, sehingga memungkinkan untuk mengukur wijen dalam porsi ukuran porsi 50 g. atau 500 g (Holzhauser dkk., 2020). Mempertimbangkan dosis referensi yang direkomendasikan sebesar 0,2 mg protein (1,18 mg wijen)
menargetkan wilayah yang sama ditunjukkan sepenuhnya dengan peningkatan sensitivitas (Villa et al., 2023). Hal ini setara dengan peningkatan sensitivitas kedua sistem ndPCR sebesar 10 kali lipat dibandingkan dengan pendekatan PCR real-time sebelumnya.
Namun, temuan ini tidak terjadi ketika mentransfer uji PCR real-time multipleks untuk deteksi kacang tanah ke format ddPCR karena sensitivitasnya tidak ditingkatkan, meskipun presisinya ditingkatkan (Eischeid, 2022).
menganalisis adonan dan biskuit masing-masing sebagai makanan mentah dan makanan yang diolah secara termal. Perlu ditekankan bahwa hasil ini juga menunjukkan adanya degradasi penanda DNA target sebagaimana dicatat oleh pengurangan jumlah salinan DNA setelah pemrosesan untuk setiap tingkat spiking, dengan tingkat degradasi rata- rata sebesar 43% dan 63% untuk CO6b-1 dan 63%. sistem ITS masing-masing. Faktanya, jumlah salinan DNA yang diperoleh dengan sistem ITS pada adonan 4,7 kali lebih tinggi dibandingkan pada biskuit, sedangkan perbedaan antara matriks mentah dan matriks olahan untuk sistem CO6b-1 hanya 1,6 kali lebih tinggi pada tingkat terendah. , menunjukkan degradasi DNA yang lebih nyata dalam sistem ITS. Hasil ini menunjukkan bahwa, meskipun konsentrasi penanda DNA target lebih rendah, sensitivitasnya tetap terjaga, yang menyoroti ketahanan sistem ndPCR.
Pengaruh matriks makanan dianalisis dengan membandingkan perkiraan jumlah salinan DNA dari ekstrak campuran model wijen dan ekstrak yang diencerkan secara serial mulai dari tingkat lonjakan tertinggi (1.000 mg/kg) untuk mencapai kandungan DNA wijen yang serupa seperti pada campuran model. Hasilnya, efek potensial dari matriks makanan secara bertahap dihilangkan karena pengenceran inhibitor PCR secara berturut- turut. Hasilnya menunjukkan bahwa
ndPCR yang menargetkan CO6b-1 tidak terpengaruh oleh matriks makanan karena nilai bias antara jumlah salinan DNA dari DNA yang diencerkan secara serial dan ekstrak campuran model untuk setiap tingkat lonjakan sebagian besar berada dalam kriteria penerimaan. Sistem ITS sedikit dipengaruhi oleh matriks makanan, khususnya adonan yang memperhitungkan dua campuran model di luar kriteria penerimaan bias. Analisis statistik juga mengungkapkan bahwa untuk kandungan wijen yang sama, campuran model dan pengenceran serial koresponden yang dianalisis oleh sistem ITS lebih berbeda secara statistik dibandingkan ketika dianalisis oleh sistem CO6b-1. Temuan ini memperkuat pengaruh matriks makanan pada sistem ndPCR ITS, menyoroti pentingnya memilih penanda molekuler yang tepat untuk pengembangan metode kuantitatif.
Faktanya, dalam pengujian PCR real-time yang dikembangkan sebelumnya (Villa et al., 2023), sistem ITS telah menunjukkan akurasi yang lebih rendah dalam kuantifikasi wijen, sedangkan pengujian yang menargetkan
Nilai rata-rata pengujian ulangan (n = 4) ± standar deviasi (SD) dari dua proses independen.
Jumlah partisi yang dianggap valid oleh sistem; ND Tidak terdeteksi.
Jumlah partisi positif.
Tabel 2
Hasil penerapan sistem yang menargetkan wilayah CO6b-1 dan ITS pada sampel komersial.
24505±42 < 0,1 1 kue
25421±18
4±0 Tidak. partisi b positif
4 Roti dengan sereal dan
0,0001 Relevan
24143
tidak
25452±13
0,04 17±9
biji wijen
8 Kerupuk asin Mungkin mengandung
0,21±0,00 Wijen
(mg/kg)
wijen
1.13 Wijen (mg/kg)
tidak
5±1
25470±4
25442±12 25443±12 904,6
0 1,17±0,32
Mengandung
wijen
0 wijen
(salinan/µL ± SD)a
25382±60
±1357
wijen Mungkin mengandung jejak
Perkiraan wijen (%)
±0,069
4064±34
tidak 25437±51
wijen
kemiri
wijen
tidak
25370±95
24489
0,4 Berarti
biskuit
±10,89 0,2735 C.Vila dkk.
0
14195,30
±51,19 benih lenan
0
<0,00001 25444±27
0
Tidak.
partisi yang valid
0 DIA
3 Gandum utuh
7 Bola energi dengan kurma dan
252.5 tidak
438.6
25455±7
<0,1 0
tidak
tidak Tidak. partisi b positif
38,80±0,47 685±36
25454±19 25454±19 6 Batangan energi
dengan kacang
Dilapisi dengan 2 kue
25355±23
0 tidak
wijen dan
tidak
Mungkin mengandung jejak informasi
±102
Kejenuhan 10.8
Berarti
wijen
< 0,00001
tidak
429±60 Mungkin
mengandung jejak
5 Roti dengan
±183 (salinan/µL ±
SD)a label
25392
±614 CO6b-1
3786.7
25391±59
Mungkin mengandung jejak
9 Sosis dengan biji wijen
23,85
±3,27
jejak Mungkin mengandung biji wijen
biji
25322 Mungkin
mengandung jejak
Tidak.
partisi yang valid
wijen
0
24908
±1316
0 Sampel Sasaran
(2,2%)
wijen
C C
B A
C
Machine Translated by Google
Bustin, SA, Benes, V., Garson, JA, Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., &
Fang, Z., Zhou, X., Wang, X., & Shi, X. (2023). Pengembangan PCR digital tetesan 3-plex untuk identifikasi dan kuantifikasi absolut Salmonella dan dua serovar pentingnya dalam berbagai sampel makanan. Pengawasan Makanan, 145, Pasal 109465. https://doi.org/
10.1016/j.foodcont.2022.109465 Grup, Td, & Huggett, JF (2020). Pembaruan pedoman MIQE digital: Minimum
informasi untuk publikasi eksperimen PCR digital kuantitatif untuk tahun 2020. Kimia Klinis, 66(8), 1012–1029. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa125 Holzhauser, T. (2018). Protein atau tanpa protein? Peluang untuk deteksi makanan alergi berbasis DNA. Jurnal Kimia Pertanian dan
Pangan, 66(38), 9889–9894. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.8b03657 Cau, S., Tilocca, MG, Spanu, C., Soro, B., Tedde, T., Salza, S., & Mudadu, AG (2021).
Biro Alergen. (2019). Panduan industri makanan untuk Alergen Jejak Sukarela yang Tidak Disengaja
Deteksi alergen seledri (Apium graveolens) dalam makanan yang berasal dari hewan dan tumbuhan dengan uji PCR digital tetesan. Pengendalian Makanan, 130, Pasal 108407.
https://doi.org/ 10.1016/
j.foodcont.2021.108407 Costa, J., Fernandes, TJR, Villa, C., Oliveira, MBPP, & Mafra, I. (2017).
Kemajuan dalam analisis alergen makanan. Dalam G. Spizzirri, & G. Cirillo (Eds.), Keamanan Pangan: Alat analisis inovatif untuk penilaian keamanan (hlm. 305–360). Hoboken, New Jersey: John Wiley Program Pelabelan (VITAL) versi 3.0. Biro Alergen Terbatas, 1-18. http://allergenbureau.net/wp- content/uploads/2019/10/Food-Industry-Guide-to-the-Voluntary-Incidental-Trace-Allergen- Labelling-VITAL-Program-Version-3.0_Web. pdf.
Brzezinski, JL (2007). Deteksi DNA biji wijen pada makanan menggunakan PCR real-time.
Costa, J., Oliveira, MBP, & Mafra, I. (2013). Pengaruh pemrosesan termal pada kinerja PCR real- time bersarang satu tabung baru untuk mendeteksi alergen kenari dalam kue bolu. Penelitian Makanan Internasional, 54(2), 1722–1729. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2013.09.047 Jurnal Perlindungan Pangan, 70(4), 1033–1036. https://doi.org/10.4315/0362-028x- 70.4.1033
Daga, C., Cau, S., Tilocca, MG, Soro, B., Marongiu, A., & Vodret, B. (2019). Deteksi alergen ikan dengan PCR digital droplet. Italia. Jurnal Keamanan Pangan, 7(4). https://doi. org/10.4081/
ijfs.2018.7264
Wittwer, CT (2009). Pedoman MIQE: Informasi Minimum untuk Publikasi Eksperimen PCR Kuantitatif Real-Time. Kimia Klinis, 55(4), 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797
Demeke, T., & Dobnik, D. (2018). Penilaian kritis PCR digital untuk deteksi dan kuantifikasi organisme hasil rekayasa genetika. Kimia Analitik dan Bioanalitik, 410(17), 4039–4050. https://doi.org/10.1007/s00216-018-1010-1 Eischeid, AC (2022). PCR digital tetesan multipleks yang dioptimalkan lebih tepat, namun tidak lebih sensitif, dibandingkan PCR waktu nyata untuk mendeteksi kacang yang menyebabkan alergi. Bahan Tambahan &
Kontaminan Makanan: Bagian A, 39(11), 1797–1805. https://doi.org/10.1080/ 19440049.2022.2126530
BAHASA INGGRIS. (2015). Definisi persyaratan kinerja minimum untuk metode analisis pengujian GMO. Jaringan laboratorium GMO Eropa, Pusat Penelitian Gabungan, EURL. Tersedia online di <http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/MPR%20Report% 20Application%2020_10_2015.pdf>.
Diakses 21 Juli 2023.
gen CO6b-1 memberikan hasil kuantitatif yang lebih akurat. Menariknya, LOD yang dicapai oleh sistem ITS (0,1 mg/kg) menunjukkan jumlah salinan/µL yang tinggi, yang menunjukkan potensi LOD yang lebih rendah dalam campuran model dan pengenceran serial masing-masing.
Penelitian ini didukung oleh dana nasional (FCT, Fundaçao ˜ para a Ciˆencia e Tecnologia) melalui proyek Hypoallergen (PTDC/BAA-AGR/4005/2021), dan pendanaan strategis dari FCT/
MCTES (UIDB/ 50006/2020|UIDP /50006/2020). J. Costa dan I. Mafra berterima kasih kepada FCT atas pendanaan melalui Panggilan Individu untuk Stimulus Ketenagakerjaan Ilmiah (masing-masing 2021.03583.CEECIND/CP1662/CT0012 dan 2021.03670.CEECIND/ CP1662/
CT0011). Pekerjaan ini juga didukung oleh UE melalui proyek SYSTEMIC (Pusat Pengetahuan tentang Ketahanan Pangan dan Gizi, ERA-Net Cofund ERA-HDHL No. 696295.
Penelitian ini menjelaskan keberhasilan transfer dua metode PCR real-time ke ndPCR untuk kuantifikasi wijen sebagai makanan penyebab alergi. Dua pendekatan ndPCR independen dikembangkan secara efektif dengan peningkatan sensitivitas 10 kali lipat dibandingkan dengan pendekatan PCR real-time yang dilaporkan sebelumnya.
Kedua pengujian yang menargetkan rangkaian CO6b-1 dan ITS menyajikan parameter kinerja optimal serta ketahanan tinggi dalam menganalisis matriks makanan kompleks dan olahan. Pemrosesan makanan tidak mempengaruhi kinerja kedua pendekatan ndPCR meskipun terjadi degradasi DNA. Matriks makanan sedikit mempengaruhi sistem ndPCR ITS, sedangkan CO6b-1 ndPCR praktis tidak terpengaruh. Selain itu, kedua metode yang dikembangkan berhasil diterapkan pada sampel komersial untuk kuantifikasi absolut jejak wijen. Hasil ini menunjukkan potensi tinggi ndPCR untuk mendeteksi alergen makanan dalam jumlah kecil dan ketahanannya yang tinggi terhadap variasi matriks dan pemrosesan makanan. Oleh karena itu, penerapan ndPCR harus diperluas ke berbagai jenis makanan yang menyebabkan alergi, seperti kacang pohon, kacang tanah, kedelai, gandum, ikan, krustasea, susu, dan lain-lain, dengan memanfaatkan kemudahan transfer protokol PCR real-time ke nPCR. . Seiring dengan beragamnya makanan yang menyebabkan alergi, sejumlah besar matriks makanan, termasuk daging, kue kering, roti dan produk susu yang berbeda serta produk makanan yang dimasak sebelumnya harus diselidiki bersamaan dengan perlakuan termal yang berbeda, seperti auto-claving, dan teknologi pemrosesan lainnya. Selain itu, potensi tinggi ndPCR untuk multiplexing juga layak untuk dieksploitasi untuk analisis beberapa spesies alergi pada tingkat jejak. Oleh karena itu, metode ndPCR yang pertama kali diusulkan ini diharapkan dapat menjadi titik awal untuk pengembangan analisis alergen makanan di masa depan.
Korelasi antara kandungan makanan yang menyebabkan alergi dalam matriks kompleks dan jumlah salinan target ditentukan menggunakan campuran model berdasarkan linearitas yang ditetapkan antara kandungan wijen dalam campuran model (mg/kg) dan kandungan DNA (salinan/µL). Jadi, untuk tujuan kuantitatif, faktor konversi dapat dihasilkan dengan pengukuran bahan referensi dalam jangka waktu yang sama. Namun, penting untuk mempertimbangkan jenis pengolahan makanan karena perkiraan jumlah salinan dapat dipengaruhi oleh degradasi DNA. Oleh karena itu, pengujian harus selalu menyertakan bahan referensi yang semirip mungkin dengan produk pangan yang dianalisis untuk memperhitungkan kemungkinan variasi jumlah salinan yang disebabkan oleh pengolahan pangan.
Referensi
Pernyataan kontribusi kepenulisan CReditT
Caterina Villa: Penulisan – draf asli, Metodologi, Investigasi,
Kedua sistem ndPCR yang dikembangkan menunjukkan potensi penerapannya dalam kuantifikasi wijen dalam sampel komersial. Penerapan kedua pendekatan ini telah diverifikasi pada produk yang mengandung wijen sebagai bahan atau sebagai label pencegahan. Karena sensitivitasnya yang tinggi, sistem ITS mampu mendeteksi wijen pada jumlah sampel terbanyak (5 dari 9), mencapai kadar < 0,1 mg/kg pada dua sampel, namun jenuh pada dua sampel lainnya. Sebaliknya, sistem CO6b-1 mendeteksi wijen pada 3 dari 5 sampel yang diidentifikasi oleh sistem ITS, namun tidak jenuh pada sampel mana pun yang diuji, artinya kedua pendekatan tersebut dapat memberikan hasil yang saling melengkapi. Meskipun sistem ITS dapat lebih berguna untuk sampel dengan label kehati-hatian, penerapan sistem CO6b-1 dapat diperluas ke sampel yang mengandung bahan wijen dengan kadar di atas 1.000 mg/
kg. Temuan ini menunjukkan kelayakan ndPCR untuk memverifikasi kepatuhan pelabelan, baik sebagai tindakan pencegahan dan/atau sebagai bahan, berkontribusi terhadap pengelolaan alergen yang lebih efektif, sehingga membantu melindungi kesehatan konsumen yang peka/alergi.
& Anak Inc.
Analisis formal, Konseptualisasi. Joana Costa: Penulisan – review & penyuntingan, Investigasi, Analisis formal, Konseptualisasi. Isabel Mafra: Penulisan – review &
editing, Pengawasan, Investigasi, Akuisisi pendanaan, Konseptualisasi.
Deklarasi kepentingan bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak mempunyai kepentingan finansial atau hubungan pribadi yang saling bersaing yang dapat mempengaruhi pekerjaan yang dilaporkan dalam makalah ini.
Data akan tersedia berdasarkan permintaan.
Ketersediaan data
Ucapan Terima Kasih
5. Kesimpulan
10
Kimia Pangan 444 (2024) 138650
Holzhauser, T., Johnson, P., Hindley, JP, O'Connor, G., Chan, C.-H., Costa, J., &
Lopez-Calleja, IM, García, A., Madrid, R., García, T., Martín, R., & Gonz´ alez, I. (2017).
Villa, C., Costa, J., & Mafra, I. (2022). Wijen sebagai sumber alergen makanan: Klinis relevansi, karakterisasi molekuler, reaktivitas silang, stabilitas terhadap strategi pemrosesan dan deteksi. Tinjauan Kritis dalam Ilmu Pangan dan Gizi, 1–17. https://doi.org/
10.1080/10408398.2022.2145263
Peraturan (UE) No 1169/2011. tanggal 25 Oktober 2011 tentang penyediaan informasi pangan kepada konsumen, perubahan Peraturan (EC) No 1924/2006 dan (EC) No 1925/2006 Parlemen Eropa dan Dewan, dan mencabut Petunjuk Komisi 87/250/EEC, Dewan Petunjuk 90/496/EEC, Petunjuk Komisi 1999/10/EC, Petunjuk 2000/13/EC Parlemen dan Dewan Eropa, Petunjuk Komisi 2002/67/EC dan 2008/5/EC dan Peraturan Komisi (EC) No 608/ 2004. (Vol. L304, hlm.
18-63.): Jurnal Resmi Uni Eropa.
Amplifikasi probe bergantung ligasi multipleks (MLPA) untuk deteksi simultan DNA dari bahan alergi bunga matahari, opium, biji rami, wijen, dan kedelai dalam produk makanan komersial. Pengendalian Makanan, 71, 301–310. https://doi. org/10.1016/j.foodcont.2016.06.014 Mayer, W., Schuller, M., Viehauser, MC, & Hochegger, R. (2019). Kuantifikasi alergen
kedelai (Glycine max) dalam makanan menggunakan digital droplet PCR (ddPCR). Riset dan Teknologi Pangan Eropa, 245(2), 499–509. https://doi.org/10.1007/s00217-018- 3182-5
Mustorp, S., Engdahl-Axelsson, C., Svensson, U., & Holck, A. (2008). Deteksi seledri (Apium graveolens), mustard (Sinapis alba, Brassica juncea, Brassica nigra) dan wijen (Sesamum indicum) dalam makanan dengan PCR waktu nyata. Riset dan Teknologi Pangan Eropa, 226(4), 771–778. https://doi.org/10.1007/s00217-007-0589-9
Wang, X., Tang, T., Miao, Q., Xie, S., Chen, X., Tang, J., & You, Z. (2019). Deteksi galur beras transgenik TT51-1 pada pangan olahan menggunakan PCR konvensional, real-time PCR, dan droplet digital PCR. Pengendalian Makanan, 98, 380–388. https://doi.org/10.1016/j. foodcont.2018.11.032 Kruizinga, AG (2015). Alergen yang tidak diinginkan dalam produk berlabel kehati-hatian dan tidak berlabel menimbulkan risiko signifikan bagi konsumen penderita alergi di Inggris.
Alergi, 70(7), 813–819. https://doi.org/10.1111/all.12625
Pinheiro, LB, Coleman, VA, Hindson, CM, Herrmann, J., Hindson, BJ, Bhat, S., & Emslie, KR (2012).
Evaluasi format reaksi berantai polimerase digital tetesan untuk kuantifikasi nomor salinan DNA. Kimia Analitik, 84(2), 1003–1011. https://doi.org/10.1021/ac202578x QIAGEN. (2021).
Ekstensi Panduan Pengguna QIAcuity®.
https://www.qiagen.com/us/
(4), 1271. https://www.mdpi.com/1424-8220/18/4/1271.
Remington, BC, Baumert, JL, Blom, WM, Houben, GF, Taylor, SL, &
Villa, C., Costa, J., & Mafra, I. (2023). Deteksi dan kuantifikasi wijen putih dan hitam sebagai bahan alergi potensial dalam makanan olahan: Studi penanda gen komparatif. Pengawasan Makanan, 145, Pasal 109449. https://doi.org/10.1016/j. foodcont.2022.109449 Waiblinger, H.-U., & Schulze, G. (2019).
Tingkat tindakan untuk
alergen makanan: Sebuah pendekatan untuk pengendalian makanan resmi di Jerman. Jurnal AOAC Internasional, 101(1), 17–22. https://doi.org/10.5740/jaoacint.17-0383
Flanagan, SD (2020). Apakah metode analisis saat ini cocok untuk memverifikasi VITAL®
Remington, BC, Westerhout, J., Meima, MY, Blom, WM, Kruizinga, AG, 2.0/3.0 Dosis Referensi Alergen untuk Alergen UE dalam Makanan? Toksikologi Makanan
dan Kimia, 111709. https://doi.org/10.1016/j.fct.2020.111709
Wheeler, MW, & Baumert, JL (2020). Distribusi dosis minimal populasi yang diperbarui untuk digunakan dalam penilaian risiko 14 alergen makanan prioritas. Toksikologi Makanan dan Kimia, 139, Pasal 111259. https://doi.org/10.1016/j. fct.2020.111259 Schoringhumer, ¨ K., & Cichna-
Markl, M. (2007).
Pengembangan metode PCR real-time untuk mendeteksi wijen (Sesamum indicum) yang berpotensi menyebabkan alergi pada makanan. Jurnal Kimia Pertanian dan Pangan, 55(26), 10540–10547.
https://doi.org/10.1021/jf0719407 Schoringhumer, ¨ K., Redl, G., & Cichna-Markl, M. (2009).
Pengembangan dan validasi metode PCR duplex real-time untuk secara bersamaan mendeteksi wijen dan hazelnut yang berpotensi menimbulkan alergi pada makanan. Jurnal Kimia Pertanian dan Pangan, 57(6), 2126–2134. https://doi.org/10.1021/jf8033336 Torricelli, M., Pierboni, E., Rondini, C., Altissimi, S., & Haouet, N. (2020). Wijen, pistachio, dan
kacang macadamia: Pengembangan dan validasi sistem alergi baru untuk aplikasi PCR Real-Time yang cepat. Makanan, 9(8). https://doi.org/10.3390/food9081085
sumber daya/detail sumber daya?id=5d19083d-fa10-4ed2-88a0-2953d9947e0c&lang=en.
Huggett, JF, Foy, CA, Benes, V., Emslie, K., Garson, JA, Haynes, R., & Bustin, SA
´
Quan P.-L., Sauzade M., & Brouzes E. (2018). dPCR: Tinjauan Teknologi. Sensor, 18 C.Vila dkk.
(2013). Pedoman MIQE digital: Informasi minimum untuk publikasi eksperimen PCR digital kuantitatif. Kimia Klinis, 59(6), 892–902. https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.206375 Koppel,
¨ R., van Velsen-Zimmerli, F., & Bucher, T.
(2012). Dua sistem PCR real-time hexaplex kuantitatif untuk mendeteksi dan menghitung DNA dari dua belas alergen dalam makanan. Riset dan Teknologi Pangan Eropa, 235(5), 843–852.
https:// doi.org/10.1007/s00217-012-1806-8 Kumar, AN, Vishnuraj, MR, Vaithiyanathan, S., Srinivas, C., Chauhan, A., &
Barbuddhe, SB (2023). Uji PCR digital tetesan dengan model regresi linier untuk kuantifikasi bahan turunan kerbau dalam matriks makanan yang berbeda. Metode Analisis Makanan , 16(3), 615–625.
´
Lopez-Calleja, IM, de la Cruz, S., Martín, R., Gonzalez, I., & García, T. (2015). Metode duplex real-time PCR untuk mendeteksi DNA wijen (Sesamum indicum) dan flaxseed (Linum usitatissimum) pada produk pangan olahan.
Bahan Tambahan & Kontaminan Makanan: Bagian A, 32(11), 1772–1785. https://doi.org/10.1080/
19440049.2015.1079650
´
