Genetika Mikroba

(1)

Genetika Mikroba

 Genetika  ilmu tentang keturunan (hereditas)

 Apa itu gen?

 Bagaimana gen membawa informasi biologik?

 Bagaimana gen bereplikasi?

 Bagaimana gen dipindahkan ke generasi berikutnya atau antara organisme?

 Bagaimana ekspresi informasi yang dibawa gen?

 Genom  informasi genetik dalam satu sel

 Kromosom  organisasi genom sel

 Mengandung DNA  membawa informasi herediter

 Mengandung gen

(2)

GENETIKA MIKROBA

 Karakteristik mikroba yang diturunkan meliputi:

 1) bentuk;

 2) struktural;

 3) metabolisme;

 4) motilitas;

 5) kemampuan berinteraksi dg organisme lain  penyebab penyakit  faktor virulensi

 Pemindahan karakteristik  melalui gen

(3)

 Pemahaman genetika  kunci sejumlah\ konsep dalam mikrobiologi

Banyak antibiotika beraksi dg menghambat sintesis protein

Pemahaman bgmn informasi biologik mengalir dari gen ke protein  membantu pemahaman bgmn antibiotika beraksi

Mampu mengembangkan “senjata baru” utk melawan penyakit

(4)

 Mikroba resisten  memperoleh gen (sekelompok gen) yang akan mencegah dayakerja antibiotika

 Emerging infectiuos disease EID  contoh lain pentingnya pemahaman genetika

Penyakit baru  hasil perubahan genetik dari mikroba yang eksis

(5)

DNA  makromolekul yang terdiri dari unit nukleotida yang berulang

Satu nukleotida  satu basa nitrogen (adenin,

timin, sitosin, atau guanin), satu deoksiribosa (gula pentosa), dan satu grup fosfat

DNA dalam sel  nukleotida rantai panjang yang melingkar dalam pasangan  membentuk double

helix

Dua rantai nukleotida bersatu  ikatan hidrogen di antara basa nitrogen

(6)

Structure Of DNA

 Proposed by Watson & Crick.

 Double helix model.

 Composed of 2 chains of polypeptides, each chain has a backbone of deoxyribose sugar and phosphate residues arranged alternately.

 4 nitrogenous bases: Adenine (A) Purine Guanine (G)

Thymine(T) Pyrimidine

Cytosine (C)

(7)

Double helical structure of DNA by Watson & Crick

(8)

 Pasangan basa terjadi dalam cara spesifik:

 Adenin (A) – Timin (T)  A-T

 Sitosin (C) – Guanin (G)  C-G

 Sekuens basa satu rantai DNA menentukan sekuens rantai lainnya  dua rantai DNA bersifat komplementer

 Kode genetik  satu set aturan yang menentukan bagaimana sekuens nukleotida dikonversi menjadi sekuens asam amino dari satu protein

 Banyak metabolisme seluler berhubungan dengan translasi pesan genetik menjadi protein spesifik

(9)

DNA Structure

Phosphate-P Sugar-blue Bases-ATGC

(10)

Genotip dan Fenotip

 Genotip organisme

 Kandungan genetiknya (gen atau DNA seluruhnya)

 Informasi yang mengkode untuk semua karakteristik detil organisme

 Mewakili sifat potensial tetapi bukan sifat organisme itu sendiri

 Fenotip organisme

 Sifat aktual yang terekspresi

 Seperti kemampuan melakukan reaksi kimia tertentu

 Koleksi protein-proteinnya

(11)

DNA dan Kromosom

 Kromosom bakteri

 Tunggal, sirkuler  molekul DNA sirkuler tunggal dengan protein

 Bentuk  looped and folded

 Menempel pada satu atau beberapa tempat di membran plasma

 DNA E. coli  spesies paling banyak dipelajari

 ~ 4 juta pasang basa

 Panjang ~ 1 mm  1000 kali lebih panjang dari ukuran sel

(12)

(13)

(14)

DNA  sangat tipis dan terkemas rapat menempati 10% volume sel

Lokasi gen ditentukan dengan eksperimen pada transfer gen dari satu sel ke sel lain

Peta kromosom bakteri  ditandai dalam menit sesuai waktu transfer gen dari sel donor ke sel resipien

Genomik  sequencing dan karakterisasi molekuler dari genom

(15)

Bacteria chromosome

 Escherichia coli

 4.6 million base pairs

 4300 genes

 1mm long

 1,000 X length of cell

 Supercoiled

 Topoisomerase II

 DNA gyrase

(16)

Bacterial chromosome

 Genetic map

 Mapped in minutes

 Based on time for

chromosome exchanged between two cells

(17)

Kromosom Bakteri

(18)

Aliran Informasi Genetik

 Replikasi DNA  aliran informasi genetik dari satu generasi ke generasi berikutnya

 DNA sel  bereplikasi sebelum sel membelah diri

 Setiap sel anak menerima kromosom yang identik dengan sel induk

 Dalam sel yang bermetabolisme:

 Informasi genetik DNA  ditranskripsi ke mRNA  ditranslasi menjadi protein

 Replikasi DNA

 1 molekul DNA induk  2 molekul DNA anak

 Satu rantai  template bagi rantai yang lain

 Membutuhkan keberadaan kompleks protein seluler

(19)

DNA Replication

 Steps in replication

 DNA unwinds

 DNA polymerase

 Adds nucleotides to 3` end

 Replication fork forms

 Leading strand forms towards the fork

 5`3`

(20)

Replication Fork

(21)

LE 18-14

Origin of replication

Replication fork

Termination of replication

Bacterial DNA

replication

Both genome

& plasmid replicate in this manner

(22)

(23)

(24)

Protein Synthesis

 DNA---  mRNA---  protein

transcription translation Central Dogma of Molecular Genetics

(25)

Regulasi Ekspresi Gen Bakteri

 Diatur oleh Operons

 REPRESI dan INDUKSI

 Mengatur transkripsi mRNA dan sintesis enzim dari mRNA

 Mengontrol pembentukan dan jumlah enzim dalam sel  bukan aktivitas enzim

 Represi

 Menghambat ekspresi gen

 Mengurangi sintesis enzim

 Respon terhadap jumlah berlebihan dari produk akhir jalur metabolik

 Diperantarai protein regulatori  REPRESSOR

 menghambat kemampuan RNA polymerase untuk mengawali transkripsi dari gen yang mengalami represi

(26)

Regulasi Ekspresi Gen Bakteri (lanjutan)

 Induksi

 Proses yang menyebabkan transkripsi satu atau beberapa gen

 Substansi yang beraksi menginduksi transkripsi

 INDUCER

 Enzim yang disintesis dengan keberadaan inducer

 INDUCIBLE ENZYME (contoh: gen yang

dibutuhkan untuk metabolisme laktosa pada E.

coli)

Inducer and Represor : Operons

(27)

Regulation of Bacterial Gene Expression

 All metabolic reactions are catalyzed by enzymes (proteins)

 Feedback inhibition stops a cell from

performing unneeded chemical reactions



Stops enzymes that are already synthesized

 What prevents synthesis of enzymes that are

not needed?

(28)

Regulation of Bacterial Gene Expression

 Protein synthesis requires tremendous energy



Cell does not waste energy



Regulating protein synthesis economizes cells

energy

(29)

 Genes



60-80% are constitutive

 Not regulated

 Products produced at fixed rate

 Genes turned on all the time

 Code for enzymes essential to major life processes

 Ex: Enzymes needed for glycolysis

(30)

Regulation of Bacterial Gene Expression

 Genes



Inducible genes

 Production of enzymes is regulated

 Inducible enzymes

 Present only when needed

 Trypanosoma

 Surface glycoproteins

 Produces one glycoprotein at a time

 Eludes immune system

(31)

 Regulation of transcription

 Repression

 Decreases gene expression

 Decrease enzyme synthesis

 Response to overabundance of an end product

 Regulatory proteins called repressors

 Block RNA polymerase

(32)

Regulation of Bacterial Gene Expression

 Regulation of transcription



Induction

 Turns on genes

 Substance that turns on gene

 Inducer

 Inducible enzymes

(33)

 Induction enzymes



β-galactosidase (E. coli)

 Cleaves lactose

 Medium without lactose = little to no β-galactosidase

 Lactose added to medium large amounts of β- galactosidase produced

 Lactose is converted to allolactose

 Allolactose is the inducer

 Enzyme reduction

(34)

Operon Model

 Three genes for lactose utilization

 Located next to each other on bacterial chromosome

 Regulated together

 Called structural genes

 lac structural enzymes are transcribed and translated

 lac for lactose

(35)

Plasmid dan Transposon

 Elemen genetik yang memberikan mekanisme perubahan genetik tambahan

 Ada pada organisme eukaryot dan prokaryot

 Plasmid

 DNA sirkuler yang bereplikasi sendiri

 Berukuran ~1-5% dari kromosom bakteri

 Ditemukan terutama pada bakteri, juga pada eukaryot seperti Saccharomyces cerevisiae

 Dalam kondisi tertentu  penting untuk bertahan hidup dan pertumbuhan sel

(36)

Plasmids

 Extrachromosomal genetic elements

 Autonomously replicating

 circular DNA - exept. B.burgdorferi

 do not encode essential functions -

additional genetic information (phenotypic

properties, ab resistance, bacteriocin and

toxin production, metabolizing properties)

(37)

Plasmid dan Transposon

 Faktor F  plasmid konjugatif; membawa gen

untuk pili seks dan untuk transfer plasmid ke sel bakteri lain

 Faktor R  plasmid yang membawa gen

resistensi antibiotik; ditemukan pertama sekali di Jepang akhir tahun 1950-an setelah beberapa epidemik disentri

 Plasmid untuk toksin  enterotoksin E. coli, exfoliative toxin dari Staphylococcus aureus, neurotoksin Clostridium tetani, toksin anthrax dari Bacillus anthracis, bakteriosin (protein yang dapat membunuh bakteri lain)

(38)

 Transposon  segmen DNA yang dapat

dipindahkan dari satu molekul DNA ke molekul DNA lain

 Ukuran potongan DNA  700 – 40 ribu base pairs (bp)

 Transposon bakteri  mugnkin mengandung gen untuk enterotoksin atau resistensi

antibiotik

 Mekanisme alami untuk perpindahan gen dari satu kromosom ke kromosom lain

 Dapat berpindah dari satu organisme ke organisme lain

 Dapat menjadi bagian dari kromosom, plasmid, dan virus (bakteriofag)

(39)

 Mediator potensial untuk evolusi organisme

 Semua transposon mengandung informasi untuk transposisi mereka

 Transposon paling sederhana (disebut juga INSERTION SEQUENCES: IS)  hanya satu gen untuk enzim transposase dan

recognition sites

 Transposase  mengkatalisis pemotongan dan penutupan DNA pada transposisi

 Recognition site  sekuens DNA yang pendek yang berulang; dikenal sebagai sisi

rekombinan antara transposon dan kromosom

(40)

Virulensi dan Materi Genetik

 Virulensi atau patogenisitas  kemampuan mikroba untuk dapat menyebabkan penyakit (patogen)

 Gen toksin pada plasmid  enterotoksin E. coli, exfoliative toxin dari Staphylococcus aureus,

neurotoksin Clostridium tetani, toksin anthrax dari Bacillus anthracis,

 Gen kapsul pada DNA  Streptococcus pneumoniae, B. anthracis (pada plasmid)

 Gen resistensi antibiotik dari bakteri  plasmid dan transposon

 Struktur pada bakteri untuk perlekatan ke sel target

 dikode oleh gen seperti gen eae pada E. coli

(41)

Mutation

 Mutation



Change in the base sequence of DNA

 may cause change in the product coded by the gene

 Beneficial

 Lethal

 Neutral

 Occur commonly

 Degeneracy

(42)

(43)

Mutations

 Normal

 No mutations

 DNA strand properly transcribed by mRNA

 Correct sequence of amino acids for protein

(44)

Mutations

 Mis sense mutation

 Base substitution results in an amino acid

substitution in protein

 Sickle cell anemia

 A to T

 Glutamic acid to valine

 Hb shape changed during low oxygen

(45)

Mutations

 Non sense mutation

 Base substitution

creates a nonsense or stop codon

 Protein is not produced

 Only a fragment of protein is produced

(46)

Mutations

 Frame shift mutation

 One or a few nucleotide pairs are deleted or inserted in the DNA

 Shifts the translation reading frame

 Almost always result in a long stretch of altered amino acids

 Inactive protein

(47)

 Insertion of extra bases into a gene



Huntington's disease

(48)

Mutations

 Spontaneous mutations



Occur occasionally in DNA replication

 Mutagens



Chemically of physically alters DNA and effects a change is called a mutagen

 Radiation, ultraviolet light

(49)

Mutagens

 Chemical Mutagens

 Nitrous acid

 Converts adenine (A) to a form that doesn’t bind with thymine (T), but instead binds with cytosine (C)

 Alters base pair on DNA, works on random locations

(50)

MUTASI

 Suatu perubahan dalam materi genetik

 Suatu perubahan dalam sekuens basa DNA atau satu gen

 Menyebabkan perubahan dalam produk yang dikode oleh gen tersebut

 Gen enzim bermutasi  enzim menjadi inaktif atau kurang aktif  karena sekuens asam amino

berubah

 Mutagen  agen di lingkungan yang langsung atau tidak langsung menyebabkan mutasi

 Bahan kimia dan radiasi

 Setiap bahan yang dapat bereaksi secara kimia dan fisik dengan DNA  dapat menyebabkan mutasi

(51)

MUTASI

 Mutagen kimia

 Asam nitrat, analog nukleosida (2-aminopurin, 5-bromourasil, obat antiviral dan antitumor [azidotimidin]), aflatoksin, zat warna akridin

 Radiasi

 Sinar X dan sinar gamma  mutagen poten

karena kemampuannya untuk mengionisasi atom dan molekul  kerusakan fisik pada kromosom

 Sinar ultraviolet (UV) panjang gelombang 260 nm

 dihambat oleh lapisan ozone atmosfer  kerusakan serius atau kematian sel

(52)

Identifikasi Karsinogen Kimia

 Banyak mutagen bersifat karsinogen  substansi yang menyebabkan kanker pada hewan atau

manusia

 Subjek uji untuk menentukan karsinogen potensial

 biasanya hewan

 Prosedur uji  mahal dan butuh waktu

 Prosedur lebih cepat dan kurang mahal untuk

pengujian awal  AMES TEST  bakteri sebagai indikator karsinogen

 Dasar  eksposur bakteri mutan ke substansi mutagenik mungkin menyebabkan mutasi baru yang mengembalikan efek dari mutasi awal

 Disebut mutasi kembali atau reversion

 Salmonella his^- (hilang kemampuan sintesis histidin)  mutagen  Salmonella his⁺

(53)

Replica Plating

(54)

Genetic Transfer & Recombination

In Bacteria

(55)

Transfer Genetik dan Rekombinan

 Rekombinasi genetik  mengganti gen diantara dua molekul gen untuk membentuk kombinasi baru

 Transfer gen  perpindahan gen dari satu organisme ke organisme lain

 Vertikal  dari sel induk ke sel anak (manusia, hewan, dan tanaman)

 Horizontal (lateral)  dari satu sel bakteri ke sel bakteri lain dari generasi yang sama

 Sel Donor  sel yang memberikan DNA

 Sel Resipien  sel yang menerima DNA

(56)

 Genetic recombination - transfer of DNA from one organism (donor) to another recipient. The

transferred donor DNA may then be integrated

into the recipient's nucleoid by various mechanisms (homologous, non-homologous).

 Homologous recombination- homologous DNA sequences having nearly the same nucleotide sequences are exchanged by means of Rec A proteins. This involves breakage and reunion of paired DNA segments as seen in (Natural

mechanisms of genetic recombination in bacteria include:

a. transformation

b. transduction

c. conjungation

(57)

Transformation

 Genetic recombination in which a DNA fragment from a dead, degraded

bacterium enters a competent recipient bacterium and it is exchanged for a

piece of the recipient's DNA.

 Involves 4 steps

(58)

1. A donor bacterium dies and is degraded 2. A fragment of DNA from the dead donor bacterium binds to DNA binding proteins on the cell wall of a competent, living recipient bacterium

3. The Rec A protein promotes genetic exchange between a fragment of the donor's DNA and the recipient's DNA

4. Exchange is complete

The 4 steps in Transformation

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit4/genetics/recombination/transformation/transformation.html

(59)

Transfer Genetik dan Rekombinan

 Sel resipien yang menggabungkan DNA donor ke DNA miliknya  rekombinan

 Transformasi pada bakteri  gen ditransfer dari satu bakteri ke bakteri lain sebagai “naked” DNA dalam larutan

 Eksperimen awal  Frederick Griffith di Inggris 1928

 Dua strain Streptococcus pneumoniae  virulen (kapsul) dan avirulen (tidak ada kapsul)

 Virulen dimatikan dengan panas dicampur dengan avirulen dalam larutan  avirulen memiliki kapsul dan menjadi virulen

(60)

(61)

Transduction

 Genetic recombination in which a DNA fragment is transferred from one

bacterium to another by a bacteriophage

Structure of T4 bacteriophage Contraction of the tail sheath of T4

(62)

What are Bacteriophages ?

Bacteriophage (phage) are obligate

intracellular parasites that multiply inside bacteria by making use of

some or all of the host biosynthetic

machinery (i.e., viruses that infect

bacteria

(63)

(64)

Bacterial Conjugation

Bacterial Conjugation is genetic recombination in which there is a transfer of DNA from a living donor bacterium to a recipient

bacterium. Often involves a sex pilus.

 The 3 conjugative processes

I. F⁺conjugation II. Hfr conjugation

III. Resistance plasmid conjugation

(65)

 Konjugasi pada bakteri  transfer materi genetik yang diperantarai oleh plasmid

 Plasmid  DNA sirkuler yang bereplikasi sendiri tidak bergantung pada kromosom

 Plasmid membawa gen yang tidak esensial untuk pertumbuhan sel dalam kondisi normal

 Plasmid untuk konjugasi dapat dipindahkan diantara sel-sel selama konjugasi

 Konjugasi berbeda dengan transformasi dalam dua hal: 1) konjugasi membutuhkan kontak

langsung sel-ke-sel dan 2) sel-sel yang berkonjugasi harus berlawanan  donor membawa plasmid; resipien tidak

(66)

 Pada bakteri gram-negatif  plasmid membawa gen yang mengkode untuk sintesis sex pili

(penjuluran dari permukaan sel donor yang kontak ke resipien dan membantu dua sel berkontak langsung)

 Contoh E. coli  F factor (Fertility factor)  plasmid pertama yang ditransfer diantara dua sel selama konjugasi

(67)

Process of Conjugation

(68)

F+ Conjugation- Genetic recombination in which there is a transfer of an F+

plasmid (coding only for a sex pilus) but not chromosomal DNA from a male donor bacterium to a female recipient

bacterium. Involves a sex (conjugation) pilus. Other plasmids present in the

cytoplasm of the bacterium, such as those coding for antibiotic resistance, may also be transferred during this process.

I. F+ Conjugation Process

(69)

The 4 stepped F+ Conjugation

1. The F+ male has an F+ plasmid coding for a sex pilus and can serve as a genetic donor

2. The sex pilus adheres to an F- female (recipient). One strand of the F+ plasmid breaks

(70)

The 4 stepped F+ Conjugation (cont’d)

3. The sex pilus retracts and a bridge is created between the two bacteria.

One strand of the F+ plasmid enters the recipient bacterium

4. Both bacteria make a complementary strand of the F+ plasmid and both are now F+ males capable of producing a sex pilus.

There was no transfer of donor

chromosomal DNA although other plasmids the donor bacterium carries may also be transferred during F+ conjugation.

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit4/genetics/recombination/conjugation/f.html

(71)

II. Hfr Conjugation

Genetic recombination in which fragments of chromosomal DNA from a male donor bacterium are transferred to a female recipient bacterium following insertion of an F+ plasmid into the nucleoid of the

donor bacterium. Involves a sex

(conjugation)pilus.

(72)

5 stepped Hfr Conjugation

1. An F+ plasmid inserts into the donor bacterium's nucleoid to form an Hfr male.

2. The sex pilus adheres to an F- female (recipient). One donor DNA strand breaks in the middle of the inserted F+ plasmid.

(73)

5 stepped Hfr Conjugation (cont’d)

3. The sex pilus retracts and a bridge forms between the two bacteria. One donor DNA strand begins to enter the recipient bacterium. The two cells break apart easily so the only a portion of the donor's DNA strand is usually

transferred to the recipient bacterium.

4. The donor bacterium makes a

complementary copy of the remaining DNA strand and remains an Hfr

male. The recipient bacterium makes a complementary strand of the

transferred donor DNA.

(74)

5 stepped Hfr Conjugation (cont’d)

5. The donor DNA fragment undergoes genetic exchange with the recipient bacterium's DNA. Since there was transfer of some donor chromosomal DNA but usually not a complete F+

plasmid, the recipient bacterium usually remains F-

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit4/genetics/recombination/conjugation/hfr.html

(75)

III. Resistant Plasmid Conjugation

Genetic recombination in which there is a transfer of an R plasmid (a

plasmid coding for multiple antibiotic resistance and often a sex pilus) from a male donor bacterium to a female

recipient bacterium. Involves a sex

(conjugation) pilus

(76)

4 steped Resistant Plasmid Conjugation

1. The bacterium with an R-plasmid is multiple antibiotic resistant and can produce a sex pilus (serve as a genetic donor).

2. The sex pilus adheres to an F- female (recipient). One strand of the R-plasmid breaks.

(77)

4 stepped Resistant Plasmid Conjugation (cont’d)

3. The sex pilus retracts and a bridge is created between the two bacteria.

One strand of the R-plasmid enters the recipient bacterium.

4. Both bacteria make a complementary strand of the R-plasmid and both are now multiple antibiotic resistant and capable of producing a sex pilus.

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit4/genetics/recombination/conjugation/r.html