ISOLASI DAN KARAKTERISASI LIPASE TERMOSTABLE DARI BAKTERI TERMOFILIK (ISOLAT AL96). Program Studi Magister Pengajaran Kimia). Hasil pemurnian parsial menggunakan amonium sulfat pada ekstrak enzim kasar isolat AL96 menunjukkan bahwa fraksi 50-70% mempunyai aktivitas paling tinggi yaitu sebesar 0,018 U/mg protein, disusul fraksi 30-50%. Hasil SDS-PAGE dan zymogram menunjukkan adanya pita lipase dengan ukuran sekitar 85 kDa pada tiga fraksi yaitu fraksi 50-70%, fraksi 30-50% dan fraksi 0-30%.
0C dan fraksi 50-70% mempunyai suhu optimum 75 0C dan lipase ini dapat dikategorikan sebagai lipase termostabil. Karakterisasi pH optimum pada fraksi 50-70% dan fraksi 30-50% menunjukkan bahwa kedua fraksi mempunyai pH optimum sebesar 10. Hasil pemurnian parsial menggunakan amonium sulfat terhadap ekstrak enzim kasar dari isolat AL96 menunjukkan bahwa 50 Fraksi -70% mempunyai aktivitas tertinggi yaitu 0,018 U/mg protein, disusul fraksi 30-50%. dengan aktivitas spesifik hingga 0,015 U/mg protein.
Karakterisasi pH optimum pada fraksi 50-70% dan 30-50% menunjukkan bahwa kedua fraksi mempunyai nilai pH optimal sebesar 10. Isolasi dan Karakterisasi Lipase Termostabil dari Bakteri Termofilik (isolat AL96), Tesis Program Magister Keguruan, Institut Teknologi Bandung. dan dalam bahasa inggris sebagai berikut :.
Pendahuluan
Latar Belakang
Dalam penelitian ini ditemukan beberapa mikroorganisme yang teridentifikasi mampu menghasilkan lipase termostabil (Widhiastuty, dkk, 2009). Selain dari sumber air panas, mikroorganisme juga telah diisolasi dari kompos, dan diketahui bahwa mikroorganisme yang diperoleh mampu menghasilkan lipase termostabil (Madayanti, dkk, 2008). Di Laboratorium Penelitian Biokimia Institut Teknologi Bandung telah diisolasi isolat bakteri AL96 yang mempunyai aktivitas lipolitik, namun enzim ini belum dikarakterisasi dengan baik, oleh karena itu dilakukan pemurnian untuk mendapatkan lipase termostabil dengan sifat yang lebih spesifik.
Proses fraksinasi bertujuan untuk mengendapkan protein pada titik isoelektriknya, yang dapat dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat. Prinsip pengendapan dengan amonium sulfat didasarkan pada kelarutan protein, yaitu interaksi antara gugus polar dan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya tolak protein dengan muatan yang sama. Amonium sulfat umum digunakan karena mempunyai beberapa keunggulan antara lain: mempunyai kelarutan yang tinggi dalam air, tidak mengandung zat toksik, melindungi protein dari denaturasi dan membatasi pertumbuhan bakteri, serta harganya relatif murah (Scopes, 1987).
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
- Ruang lingkup
Tinjauan Pustaka
Mikroorganisme Termofilik
- Habitat Mikroorganisme Termofilik
- Enzim Termostabil
- Lipase
- Aplikasi Lipase Pada Bidang Industri
Lipase yang diperoleh dari golongan Pseudomonas termofilik mempunyai kestabilan yang sangat tinggi pada suhu 60 0C dimana setelah diinkubasi selama 24 jam masih mempunyai aktivitas sebesar 96. Lipase yang diisolasi dari Pseudomonas mesofilik juga mampu menghasilkan lipase basa hipertermostabil dengan aktivitas maksimum pada suhu tertentu. suhu 90 0C dan pH 11 dengan waktu paruh lebih dari 13 jam (Rathi, et al., 2000). Isolat AL96 merupakan mikroorganisme yang diisolasi dari kompos rumah yang bersifat termofilik, tahan terhadap alkohol, dan memiliki aktivitas lipolitik.Berdasarkan analisis menggunakan gen 16S rRNA, isolat AL96 diketahui paling erat kekerabatannya dengan Pseudoxanthomonas taiwanensis, yaitu bakteri gram negatif. . bakteri berbentuk batang (Syihab et al., 2015).
Penelitian mengenai bakteri termofilik telah banyak dilakukan di Indonesia antara lain Sumber Air Panas Cimanggu, Kawah Domas, Gunung Tangkuban Perahu, Kawah Gunung Papandayan, Garut, Jawa Barat (Akhmaloka et al., 2006). Penggunaan enzim yang diperoleh dari mikroorganisme lebih menguntungkan karena lebih mudah berkembang biak dalam waktu yang relatif singkat dan tidak memerlukan tempat yang luas, termasuk enzim lipase yang banyak digunakan dalam industri (Pramiadi, dkk, 2014). Kebanyakan enzim termostabil berasal dari mikroorganisme yang tumbuh pada suhu tinggi, meskipun ada beberapa enzim termostabil yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang hidup pada suhu rendah.
Lipase dari mikroorganisme termofilik umumnya menunjukkan stabilitas yang cukup baik pada suhu tinggi dan pelarut organik, hal ini disebabkan mikroorganisme mampu mempertahankan diri pada kondisi ekstrim (Sinchaikul, et al., 2001). Lipase (triasilgliserol asil hidrolase; EC 3.1.1.3) merupakan enzim yang dapat mengkatalisis proses hidrolisis ikatan karboksilester pada lipid pada antarmuka antara minyak dan air. Lipase merupakan enzim yang mempunyai kemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis dan sintesis ester, sehingga banyak digunakan dalam industri, dan mempunyai cakupan yang lebih luas dalam bidang bioteknologi seperti biomedis, pestisida, pengolahan limbah, biosensor dan deterjen (Macrae, 1983). ). .
Lipase (triasilgliserol asilhidrolase; EC 3.1.1.3) yang berasal dari bakteri termofilik dapat dimanfaatkan dalam berbagai industri antara lain industri farmasi, industri makanan dan minuman, deterjen, pengolahan coklat dan juga biodiesel. Lipase banyak digunakan di berbagai industri karena potensinya yang cukup besar dan kontribusinya yang banyak (Sharma dan Kanwar, 2014). Penggunaan komersial utama lipase, yang banyak digunakan di rumah tangga, adalah dalam deterjen yang mampu menghidrolisis lemak (Hasan, et al., 2006).
Penggunaan lipase dalam industri kertas juga telah digunakan sejak lama, lipase yang digunakan bersama dengan selulase dan ligninase dapat menghilangkan pitch dari pulp yang dihasilkan untuk kertas.
Metodologi Penelitian
- 1
- 2
- 3
- 4
- Uji Aktivitas Lipase dan Penentuan Kadar Protein
- Elekroforesis Gel Akrilamid
- Karakterisasi Lipase
Koloni tunggal bakteri kemudian dipindahkan ke media pertumbuhan padat menggunakan wire loop secara aseptik dan diinkubasi pada suhu 55 oC selama 17 jam. Pembuatan enzim diawali dengan pembuatan 10 mL media starter, kemudian satu koloni bakteri dipindahkan dari media padat ke media starter, inkubasi dilakukan dalam inkubator pengocok pada suhu 55 oC selama 17 jam dengan kecepatan 150 rpm. Inkubasi pada media produksi dilakukan dalam inkubator pengocok pada suhu 55 oC selama 17 jam dan kecepatan 150 rpm selama 17 jam.
Untuk memisahkan sel bakteri yang mengandung enzim, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 12.000 x g selama 20 menit pada suhu 4 oC. Sebanyak 900 µl larutan ini kemudian ditambahkan ke dalam 300 µl larutan enzim dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 55 oC menggunakan inkubator. Aktivitas lipase diukur berdasarkan perubahan serapan pada panjang gelombang 405 nm yang mengindikasikan terlepasnya senyawa p-nitrofenol (pNP) dari substrat pNP-L.
Aktivitas lipase dinyatakan dalam satuan/mg yang didefinisikan sebagai µmol produk (p-nitrofenol) yang dihasilkan oleh lipase per menit per mg enzim. Larutan pewarna dibuat dengan mencampurkan 1,2 g koma biru, 225 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial yang diencerkan dalam 225 ml air suling (Sambrook et al., 1989). Larutan penghilang warna dibuat dengan mencampurkan 250 mL metanol, 75 mL asam asetat glasial yang dilarutkan dalam 325 mL air suling (Sambrook et al., 1989).
Penentuan pengaruh pH terhadap aktivitas lipase dilakukan pada suhu 55oC menggunakan buffer 50 mM dengan rentang pH 6-12. Pengukuran aktivitas lipase dilakukan sesuai dengan prosedur yang diusulkan oleh Lee et al. 1999), seperti ditunjukkan pada subbagian III.4 di atas, sistem buffer yang digunakan meliputi buffer natrium fosfat (pH 6,0–8,0) dan buffer glisin NaOH (pH 8,0–11). Pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada suhu yang berbeda pada kisaran 35-85oC.
Campuran reaksi diinkubasi pada suhu tertentu dalam penangas air, dan aktivitas lipase diukur mengikuti prosedur yang disarankan oleh Lee et al.
Hasil dan Pembahasan
- Pertumbuhan bakteri lipase
- Karakter Lipase Isolat AL96
- Penentuan Berat Molekul Lipase
- Hasil Karakterisasi
- Pengaruh Temperatur Terhadap Aktivitas Lipase
- Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Lipase
Dari kurva diatas terlihat aktivitas lipase terbaik dihasilkan pada jam inkubasi ke 17, dimana nilai OD pada jam tersebut sebesar 1,069 (dapat dilihat pada Lampiran C.1). Lipase yang dihasilkan pada penelitian ini merupakan lipase yang berada pada fase diam (Gambar IV.1). Prinsip fraksinasi amonium sulfat adalah jika garam ditambahkan ke dalam larutan protein, maka kelarutan protein akan berkurang, sehingga protein terpisah dan membentuk endapan, hal ini disebut salting out.
Peningkatan nilai aktivitas spesifik enzim pada tahap isolasi menunjukkan adanya peningkatan kemurnian lipase yang diperoleh. Hasil penentuan aktivitas spesifik (Gambar IV.2, Lampiran C.2) menunjukkan adanya peningkatan aktivitas lipase setelah fraksinasi amonium sulfat dan dialisis. Hasil pemurnian parsial menggunakan amonium sulfat pada ekstrak kasar enzim dari isolat AL96. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi 50-70% mempunyai aktivitas spesifik tertinggi yaitu 0,018 U/mg protein, disusul fraksi 30-50% dengan aktivitas spesifik. 0,015 U/mg protein.
Hal ini mungkin disebabkan karena pengendapan protein pada fraksi 50-70% relatif lebih sedikit dibandingkan fraksi 30-50% dan fraksi lainnya. Protein yang diendapkan dapat dipengaruhi oleh fraksinasi amonium sulfat, jika garam ditambahkan ke dalam larutan protein maka kelarutan protein akan berkurang dan akibatnya protein akan terpisah membentuk endapan. Prinsip elektroforesis adalah proses perpindahan molekul bermuatan dalam medan listrik.Kecepatan molekul bergerak tergantung pada bentuk, muatan dan ukuran molekul sehingga protein dapat dipisahkan. Karena komposisi protein pada beberapa fraksi akan berbeda, maka perlu diketahui komposisi masing-masing fraksi, yang mempunyai aktivitas lipase, kemudian dilakukan SDS-PAGE dan zymogram.
SDS-PAGE merupakan suatu metode pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran protein, dimana protein kecil bergerak lebih cepat sedangkan protein besar bergerak lebih lambat karena terhalang oleh ukuran dan pori-pori gel (Cutler, 2004). Zymogram adalah cara untuk menentukan lokasi protein target dari hasil SDS-PAGE. Pada SDS-PAGE dan zymogram, tebal pita pada 85 kDa menunjukkan pita lipase dari fraksi yaitu fraksi 50-70%, fraksi 30-50% dan fraksi 0-30% yang ditandai dengan warna kecoklatan. warna.
Di atas suhu optimum aktivitas lipase sangat berkurang, hal ini terjadi karena lipase mengalami denaturasi protein yang dapat mengubah konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan sifat alaminya.
Penutup
Kesimpulan
Saran
Investigation of thermophilic microorganisms from a hot spring around Bandung, Journal of the Indian Chemical Society. Determination of kinetic parameters during continuous cultivation of lipase-producing thermophilic Bacillus sp IHI-91 on olive oil Applied Microbiology and Biotechnology. A Rapid and Sensitive Method for Quantifying Microgram Amounts of Protein Using the Principle of Protein-Dye Binding, Analytical Biochemistry.
Cloning, characterisasi and ekpresi for pengkode lipase thermostable dari kompos melalui sikke metagenom, Dissertasi Program Doktor, Institut Teknologi Bandung. Characterization and identification of thermophilic lipase-producing bacteria from thermogenic compost, Journal of Pure & Applied Microbiology. Onilude, (2003): Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OGI, African Journal of Biotechnology Isolation and activity test of thermostable lipase enzyme from thermophilic bacteria after merapi outbreak.
Structural modeling and characterization of a thermostable lipase from Bacillus stearothermophilus P1, Biochemical and Biophysical Research Communications. Molecular cloning and characterization of thermostable esterase and lipase from Geobacillus thermoleovorans isolated from desert soil in Egypt. Amplifikasi fragmen pelacak gene lipase bakteri thermophilik yang diisolasi dari kompos, journal article Isolation, characterization and identification of lipolytic thermophiles with methanol tolerance from home compost.
Modification of determination of molecular lipase isolate and application of biodiesel from minyak rumput laut (Sargassum Sp.). Characterization and identification of thermostable alkaline lipase-producing bacteria from hot spring around West Java, Journal of pure and applied microbiology. Isolation of alkaline lipase from rubber seed-partial purification, characterization and its potential applications as a detergent additive, Indian Journal of Chemical Technology.
Zeikus GJ dan Vieille C (2001): Hyperthermophilic enzymes: sources, applications and molecular mechanisms of thermostability Expression of a thermo-alkaline lipase gene from Talaromyces thermophilus in recombinant Pichia pastoris, Biochemical Engineering Journal.
