LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK LANJUT II “KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)”

(1)

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALITIK LANJUT II

“KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)”

DISUSUN OLEH RIKA KARTIKA

2012C1003

S1 KIMIA/ANALIS KIMIA

SEKOLAH TINGGI ANALIS BAKTI ASIH BANDUNG

2022

(2)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Tanggal Praktikum: 22 November 2022

I. TUJUAN

Untuk memisahkan dan menentukan komposisi suatu campuran komponen organik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi.

II. PRINSIP

2.1 Migrasi diferensial

Perbedaan kecepatan distribusi pada komponen sampel karena adanya perbedaan koefisien partisi.

2.2 Distribusi partisi

Perbedaan distribusi komponen pada fase diam dan fase gerak karena adanya perbedaan kepolaran.

2.3 Like dissolved like

Kecenderungan suatu senyawa untuk larut dalam pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang relatif sama.

III. TEORI DASAR

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) termasuk ke dalam kromatografi, pemisahan berdasarkan distribusi komponen-komponen sampel diantara fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa cairan yang dilapiskan pada suatu pendukung padat, dan fasa gerak berupa cairan tunggal atau campuran.

Faktor pemisahan pada Kromatografi Cair sangat bergantung pada suatu fase gerak.

Ada dua macam jenis elusi fase gerak yang digunakan pada percobaan kromatografi : 1. Elusi isokratik

Ketika komposisi dari pelarut/fase gerak yang digunakan dibuat tetap atau tidak berubah selama proses elusi pada satu percobaan kromatografi.

2. Elusi gradien

Merupakan kebalikan dari elusi isokratik, dimana pada satu percobaan kromatografi, komposisi pelarut/fase gerak dibuat berubah-ubah selama elusi dilakukan.

(3)

Syarat fasa gerak yang dapat digunakan pada KCKT adalah:

1. Pelarut murni, baik tunggal maupun campuran dan buffer.

2. Tidak bereaksi dengan fasa diam 3. Dapat melarutkan cuplikan 4. Mempunyai viskositas rendah

5. Mudah memperoleh cuplikan kembali jika diperlukan 6. Bebas dari udara terlarut.

Penggunaan kolom pada KCKT, hampir serupa dengan kolom pada kromatografi konvensional. Hal ini didasari dari karakterisasi dari komponen sampel yang diinginkan (sesuai kebutuhan). Macam-macam kolom pada KCKT, misalnya:

1. Kolom fase terbalik

2. ODS (Octadecylcilane) / C18 3. Kolom fase normal

4. Kolom penukar kation 5. Kolom penukar anion 6. Kolom afinitas

7. Kolom eksklusi ukuran

IV. ALAT DAN BAHAN 4.1 ALAT

a. Kromatografi cair kinerja tinggi dan udara tekan b. alat-alat gelas

c. penyaring “Millipore”

d. suntikan KCKT

e. seperangkat alat ultrasonik 4.2 BAHAN

a. Sejumlah sampel yang akan dianalisis

V. PROSEDUR KERJA

Dipersiapkan fase gerak dengan cara mengawagaskan (menghilangkan udara terlarut) fasa gerak dan menyaring fasa gerak dengan penyaring “Millipore”.

Kemudian dihubungkan bejana pelarut dengan pompa. Diatur panjang gelombang pada detektor UV. Dikondisikan kolom dengan laju alir fasa gerak yang diinginkan.

Dialirkan fasa gerak menggunakan kecepatan rendah sampai didapat garis dasar

(4)

(background) yang datar. Dipersiapan sampel yaitu dengan cara menyaring sampel dengan penyaring sampel “Millipore” dan mengencerkan sampel bila diperlukan.

Kemudian menyuntikan sampel. Lalu, sampel dielusi. Dan diapatkan kromatogram.

VI. HASIL PENGAMATAN

Waktu retensi dan tinggi komponen 1: 5,75 menit Waktu retensi dan tinggi komponen 2: 7,5 menit Waktu retensi dan tinggi komponen 3: 9,3 menit Waktu retensi dan tinggi komponen 4: 12,7 menit Waktu retensi dan tinggi komponen 5: 15,4 menit

VII. PERHITUNGAN Komponen 1 N =16 (^𝑇𝑟

𝑊)² = 16 (^5.75

0.4)² =3306.25 HETP = ^𝐿

𝑁= ^0.4

3306.25= 1.21 × 10⁻⁴ R =^2𝑡^𝑟2^−𝑡^𝑟1

𝑤1+𝑤2 =^{2×7.5−5.75}

0.4+0.5 = 0.28 Komponen 2

N =16 (^𝑇𝑟

𝑊)² = 16 (^7.5

0.5)² =3600

(5)

HETP = ^𝐿

𝑁= ^0.5

3600= 1.38 × 10⁻⁴ R =^2𝑡^𝑟2^−𝑡^𝑟1

𝑤1+𝑤2 =^2×9.3−7.5

0.5+0.5 = 11.1 Komponen 3

N =16 (^𝑇𝑟

𝑊)² = 16 (^9.3

0.5)² = 5535.36 HETP = ^𝐿

𝑁= ^0.5

5535.36= 9.03 × 10⁻⁵ R =^2𝑡^𝑟2^−𝑡^𝑟1

𝑤₁+𝑤₂ =^{2×12.7−9.3}

0.5+0.6 = 14.64 Komponen 4

N =16 (^𝑇𝑟

𝑊)² = 16 (^12.7

0.6)² = 7168.44 HETP = ^𝐿

𝑁= ^0.6

7168.44= 8.37 × 10⁻⁵ R = ^2𝑡^𝑟2^−𝑡^𝑟1

𝑤₁+𝑤₂ =2×15.4−12.7

0.6+0.7 = 13.92 Komponen 5

N =16 (^𝑇𝑟

𝑊)² = 16 (^15.4

0.7)² = 7744 HETP = ^𝐿

𝑁= ^0.7

7744= 9.04 × 10⁻⁵ R = ^2𝑡^𝑟2^−𝑡^𝑟1

𝑤1+𝑤2 = ^2×9.3−7.5

0.5+0.5 = 13.92

Komponen 1

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 = 20 𝑝𝑝𝑚 Komponen 2

𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛 1

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 =𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛 2 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖

Konsentrasi =𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛 2 ×𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑙𝑢𝑎𝑠 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛 1

=^2.5×20

1.2 = 41.67 Komponen 3

=^1.225×20

1.2 = 20.42 Komponen 4

(6)

=^1.8×20

1.2 = 30 Komponen 5

= ^0.77×20

1.2 = 12.83

VIII. PEMBAHASAN

High-performance liquid chromatography (HPLC) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) mengacu pada proses pemurnian dan pengasingan campuran. Pada HPLC senyawa-senyawa dipisahkan berdasarkan karakter hidrofobiknya. Pelarut-pelarut harus dihawagaskan (dihilangkan komponen gasnya) untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung. Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak cair yang dialirkan melalui kolom ke detector. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen- komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelariut. HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak. Fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Dalam percobaan ini yang berfungsi sebagai fasa gerak ialah metanol. Fasa gerak Persyaratan fasa gerak dalam HPLC ialah:

1. zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.

(7)

2. zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram.

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) merupakan proses pemisahan berdasarkan kepolaran dengan suatu fasa gerak cair dipompa di bawah tekanan melalui kolom baja yang mengandung partikel-partikel fasa diam. Semakin besar luas area dari peak yang dihasilkan, maka konsentrasinya juga semakin besar. Dari data perhitungan, diperoleh jumlah keping teoritik, HETP, dan resolusi bergantung pada waktu retensi dan lebar peak. Dari data perhitungam keeping teoritik, HETP, dan resolusi komponen 1 sampai 5 berturut-turut yaitu; 3306.25, 1.21 × 10⁻⁴,0.28; 3600, 1.38 × 10⁻⁴,11.1;

5535.36, 9.03 × 10⁻⁵,14.64; 7168.44, 8.37 × 10⁻⁵,13.92; 7744, 9.04 × 10⁻⁵, 13.92.

sedangkan konsentarsi komponen 1 sampai 5 berturut-turut adalah 20 ppm, 41.67 ppm, 20.42 ppm, 30 ppm, 12.83 ppm.

IX. KESIMPULAN

Pada praktikum ini dapat disimpukan bahwa semakin besar luas area dari peak yang dihasilkan, maka konsentrasinya juga semakin besar. Dari data perhitungan, diperoleh jumlah keping teoritik, HETP, dan resolusi bergantung pada waktu retensi dan lebar peak. Dari data perhitungam keping teoritik, HETP, dan resolusi komponen 1 sampai 5 berturut-turut yaitu; 3306.25, 1.21 × 10⁻⁴,0.28; 3600, 1.38 × 10⁻⁴,11.1;

5535.36, 9.03 × 10⁻⁵,14.64; 7168.44, 8.37 × 10⁻⁵,13.92; 7744, 9.04 × 10⁻⁵, 13.92.

sedangkan konsentarsi komponen 1 sampai 5 berturut-turut adalah 20 ppm, 41.67 ppm, 20.42 ppm, 30 ppm, 12.83 ppm.

X. DAFTAR PUSTAKA

Widyastuti, Sani. (2018). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Lanjut 2. Bandung : STABA.

XI. PERTANYAAN PENDAHULUAN

a. Apakah perbedaan antara elusi bergradien denngan isokratik?

Jawab:

1. Elusi isokratik

Ketika komposisi dari pelarut/fase gerak yang digunakan dibuat tetap atau tidak berubah selama proses elusi pada satu percobaan kromatografi.

(8)

2. Elusi gradien

Merupakan kebalikan dari elusi isokratik, dimana pada satu percobaan kromatografi, komposisi pelarut/fase gerak dibuat berubah-ubah selama elusi dilakukan.

b. Jelaskan perbedaan antara kromatografi cair kinerja tinggi dengan kromatografi gas cair?

Jawab:

KCKT KGC

Fasa Gerak Cairan Gas

Suhu Suhu kamar (25˚C) Suhu tinggi (50-250˚C) Kolom Kolom pendek (20-30

cm)

Panjang dan dibuat melingkar ( Kolom packed = 1-10 m, sedangkan kolom kapiler sampai 100 m)

Sampel Hampir semua zat dijadikan sampel

Hanya untuk senyawa yang mudah menguap

c. Mengapa tinggi puncak secara pendekatan dapat digunakan untuk menentukan kuantitas komponen dalam sampel?

Jawab:

Karena jumlah puncak pada kromatogram menyatakan jumlah komponen penyusun campuran, sedangkan luas puncak menyatakan kuantitas komponennya. Pendekatan luas puncak memperhitungkan lebar peak sehingga perbedaan antara lebar peak standar dan analit tidak berbeda.

d. Bagaimana mekanisme pemisahan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi?

Jawab:

pemisahan berdasarkan partisi (kepolaran) yaitu distribusi komponen-komponen sampel diantara fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa cairan yang dilapiskan pada suatu pendukung padat, dan fasa gerak berupa cairan tunggal atau campuran.

e. Jelaskan komponen alat dalam kromatografi cair kinerja tinggi?

Jawab:

1. Reservoir pelarut, pelarut bisa dicampurkan dengan pelarut lain 2. Pencampur, tempat pencampuran pelarut

(9)

3. Pompa, mendorong pelarut ke pembuangan

4. Injector (5-500 ul), menggunakan syringe kaca, pastikan tidak ada gelembung udara saat menginjeksikan sampel

5. Loop (dihubungkan padainjector), selang panjang untuk memastikan penginjeksian presisi dan akurat

6. Oven

7. Kolom (5-30 cm), tempat pemisahan

8. Pembuangan atau pencampuran, tempat pembuangan pelarut atau ditampung untuk tahap lanjutan sebelum masuk ke detector

9. Detector (spektro, ms, simultan) 10. Sistem data, pembacaan hasil 11. Rekorder