Uji Isolasi dan Aktivitas Enzim Bakteri Asam Laktat B-galaktosidase Hasil Fermentasi Sorrel (Annona Muricata L.). Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri Gram positif yang mengeluarkan asam laktat sebagai produk akhir fermentasi, yang bertindak sebagai pengawet makanan (Schnurer dan Magnusson 2005).
Fermentasi
Tanaman ini dapat tumbuh di dataran rendah hingga ketinggian 500 meter di atas permukaan laut (mdpl), iklim basah hingga kering, suhu 22-28oC, kelembapan (RH) 60-80%, dan curah hujan berkisar mm per tahun. Zuhud) 2011). Sirsak merupakan tanaman dengan tinggi pohon sekitar 8 meter.
Bakteri Asam Laktat
Kelompok bakteri asam laktat terdiri dari famili Micrococcaceae yaitu spesies dari genus Micrococcus dan Staphylococcus, famili Lactobacillaceae yaitu spesies dari genus Lactobacillus dan bakteri yang tergolong famili Streptococcaceae yaitu spesies dari genus Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus dan Aerococcus (Fardiaz 1992). Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang dapat hidup di berbagai macam habitat di alam, seperti pada tumbuhan, saluran pencernaan hewan dan manusia, pada produk makanan kaleng, produk susu, produk fermentasi, buah-buahan dan sayuran tropis (Misgiyarti dan Janda 2005).
Enzim β-Galaktosidase
Isolasi Bakteri
Uji aktivitas Enzim β-galaktosidase
Adanya aktivitas β-galaktosidase menyebabkan reaksi hidrolisis ONPG membentuk dua senyawa yaitu galaktosa dan ONP.
Uji Kadar Protein (Bradford Method)
Data mikroorganisme yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayuran telah banyak dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi coklat kemerah-merahan (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014), dengan 7 isolat tersebut berhasil diisolasi. LABORATORIUM. Isolasi BAL yang berpotensi menghasilkan enzim β-galaktosidase dari buah kemerah-merahan (Annona muricata L.) yang difermentasi belum dilakukan.
Lokasi penelitian : Di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Bioteknologi, dan Laboratorium Kimia Terpadu Fakultas Farmasi dan Sains Universitas
Desain Penelitian : Desain Yang digunakan adalah desain eksperimental secara kualitatif
Sampel Penelitian: Sampel Penelitian berupa Buah Sirsak yang sudah matang D. Cara Kerja
- Persiapan dan pengambilan sampel
- Fermentasi Buah Sirsak
- Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak
- Karakterisasi Bakteri
- Produksi Enzim β-galaktosidase
- Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
- Uji Kadar Protein
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan 1000 µl 0,1 M dapar fosfat pH 7 dan 100 µl enzim β-galaktosidase, ditempatkan dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Ke dalam larutan yang telah diinkubasi kemudian ditambahkan 200 µl ONPG 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit.
Indikator pencapaian hasil penelitian
Nilai absorbansi yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam kurva standar BSA untuk mengetahui kandungan protein yang terkandung dalam sampel enzim β-galaktosidase (Bradford 1976).
Diagram Alir Penelitian
Fishbond Penelitian 3
Hasil determinasi yang diperoleh di Puslit Biologi LIPI Cibinong menyatakan bahwa sampel yang diperoleh dari Pasar Klender, Jakarta Timur memang buah sirsak (Annona muricata L.).
Fermentasi Buah Sirsak
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Hasil pengenceran yang diimplantasikan pada media MRSA dalam cawan petri hanya hasil pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyak koloni pada hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Setelah 48 jam inkubasi, didapatkan jumlah koloni pada hasil pengenceran 10 -9 sebanyak 2 koloni sehingga diambil 2 koloni tunggal untuk proses pemurnian. Hasil scatter pada pengenceran 10-8 menghasilkan 5 koloni, namun hanya diambil 3 koloni tunggal terbaik, sedangkan hasil scatter pada pengenceran 10-7 menghasilkan 1 koloni tunggal terbaik dari 52 koloni yang tumbuh.
Pemilihan koloni tunggal didasarkan pada bentuk morfologi terbaik yang mencirikan koloni BAL yaitu bulat, cembung, halus dan berwarna putih susu. Keenam koloni tunggal yang diperoleh terlebih dahulu harus dimurnikan untuk mendapatkan isolat murni bakteri asam laktat menggunakan metode kerokan kuadran karena lebih mudah untuk mendapatkan koloni tunggal dibandingkan dengan metode kerokan lainnya. Isolat bakteri asam laktat yang telah dimurnikan dipertahankan sebagai stok pada MRSA slant dalam tabung reaksi dan diberi kode isolat SM1 yang berasal dari pengenceran 10-7.
Kode isolat SM2, SM3 dan SM4 berasal dari pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode isolat SM5 dan SM6.
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Teknik isolasi dilakukan dengan metode penghamburan agar koloni yang tumbuh tersebar merata pada permukaan agar, sehingga memudahkan pengumpulan koloni bakteri. Suspensi bakteri penyebar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Berdasarkan data pada Tabel 3 diketahui bahwa keenam isolat bakteri yang diperoleh dari fermentasi buah asam memiliki kesamaan morfologi baik secara makroskopis maupun mikroskopis.
Secara makroskopik, hasil identifikasi menunjukkan hasil berupa isolat koloni berwarna putih susu, bentuk bulat, tepi halus dan peninggian cembung, dengan hasil mikroskopis menunjukkan sel bakteri berwarna ungu (gram positif) dan berbentuk basil. BAL yang diisolasi dari fermentasi buah sirsak menunjukkan morfologi makroskopis dan mikroskopis yang sama dengan BAL pada penelitian sebelumnya yang berasal dari buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011; Ibrahim 2015).
Produksi Enzim β-Galaktosidase
Enzim ß-galaktosidase pada bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler, sehingga membutuhkan degradasi dinding sel (Huang et al. 1993). Proses penghancuran dinding sel diawali dengan pemanenan bakteri asam laktat yang dilakukan dengan sentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan pada 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC untuk mencegah kerusakan enzim.
Sel yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH 7 untuk membebaskannya dari pengotor dari media kultur. Sonication adalah salah satu metode yang paling umum digunakan dibandingkan dengan metode lain untuk mengganggu dinding sel bakteri (Engler 1985) dan telah terbukti lebih efektif dalam melepaskan β-gal (Toba et al.
Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan terlebih dahulu membuat kurva standar ONP dengan rentang konsentrasi 0–2,5 mM untuk menentukan konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. Satu unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari substrat ONPG per menit dalam kondisi percobaan (Miller 1972). Aktivitas enzimatik isolat bakteri asam laktat buah coklat kemerah-merahan dibandingkan dengan bakteri pembanding yaitu bakteri Lactobacillus plantarum.
Sebagai pembanding digunakan bakteri Lactobacillus plantarum, karena bakteri ini memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase yang cukup tinggi (Prihantini 2013). Berdasarkan hasil percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari bakteri pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yaitu 0,776 U/ml. Nilai aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat SM6 yaitu 0,292 U/ml, sedangkan nilai aktivitas enzim β-galaktosidase terendah dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu 0,232 U/ml.
Nilai rata-rata aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dan bakteri pembanding kecil, karena waktu dan kondisi yang diukur tidak optimal dan selain enzim ß-galactosidase, banyak enzim lain yang terdapat dalam ekstrak enzim kasar.
Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase
Pengikatan antara zat warna CBBG dan protein dapat terjadi karena gaya van der Waals antara keduanya. Gaya van der Walls ini terjadi karena bagian hidrofobik protein berikatan dengan bagian pewarna non polar CBBG dan menyebabkan pewarna melepas elektronnya ke bagian hidrofobik protein. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi perlakuan pereaksi Bradford sangat cepat terbentuk dan stabil karena adanya kekuatan ion antara zat warna dan protein yang memperkuat ikatan antara keduanya sehingga zat warna menjadi stabil (Ninfa et al.
Reagen Bradford bereaksi terutama dengan residu arginin dan bereaksi dengan residu histidin, lisin, tirosin, triptofan dan fenilalanin (Bintang 2010) yang terdapat dalam ekstrak enzim kasar. Data pengukuran panjang gelombang maksimum kemudian ditentukan untuk konsentrasi minimum dan maksimum untuk membuat kurva kalibrasi untuk menentukan linearitas hubungan antara konsentrasi larutan standar dan absorbansinya. Kandungan protein tertinggi ditunjukkan pada isolat bakteri SM6 yang memiliki nilai rata-rata kandungan protein 0,8092 mg/ml, sedangkan terendah ditunjukkan pada isolat bakteri SM3 yaitu 0,6690 mg/ml (Tabel 6.).
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa keenam isolat bakteri asam laktat yang diperoleh mampu menghasilkan enzim β-galactosidase, namun isolat SM6 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan kandungan protein. 0,8092 mg/ml.
Saran
RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI
Pemurnian parsial dan karakterisasi β-galactosidase Lactobacillus plantarum B123 indigenos dan hidrolisis laktosa untuk produksi susu rendah laktosa suhu sangat tinggi. Fase pertumbuhan isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Tempoyak asal Jambi Geberg pada suhu kamar. Isolasi Bakteri Asam Laktat Berpotensi Probiotik pada Dangke, Makanan Tradisional Susu Kerbau di Curio, Kabupaten Enrekang.
Isolasi, karakterisasi dan identifikasi DNA bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi sebagai antimikroba melalui fermentasi. Karakterisasi molekuler bakteri asam laktat (BAL) probiotik dengan gen 16s rRNA berpotensi menghasilkan bakteriosin dari fermentasi sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera Barat. Isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat secara fermentasi buah markisa ungu (Pasiflora edulis var. Sims) sebagai penghasil eksopolisakarida.
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM β-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK
ANNONA MURICATA. L)
Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah asam merupakan sumber bakteri asam laktat yang potensial. Kelompok bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri yang memiliki enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004). Namun, isolasi BAL yang berpotensi menghasilkan enzim β-galaktosidase pada buah asam jawa (Annona muricata L.) belum pernah dilakukan.
Koloni bakteri asam laktat yang diamati secara morfologi merupakan koloni yang tumbuh pada media MRSA dalam cawan petri. Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa enam isolat bakteri asam laktat mampu menghasilkan enzim β-galaktosidase. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri asam laktat yang diperoleh dari buah kemerah-merahan yang difermentasi dapat digunakan sebagai sumber baru dalam produksi enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan, terutama yang memiliki intoleransi laktosa.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa diperoleh enam isolat bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan enzim β-galaktosidase.
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM B-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK (ANNONA
MURICATA. L)
Dari data di atas dapat disimpulkan bahwa buah kemerah-merahan mengandung bakteri asam laktat yang dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tambahan mengenai bahan alam yang menjadi sumber bakteri asam laktat penghasil enzim β-galaktosidase, yang nantinya dapat digunakan pada pasien dengan intoleransi laktosa. Intoleransi laktosa adalah ketidakmampuan untuk mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena rendahnya enzim ß-galaktosidase (Marsh dan Riley 1998).
Mengingat banyaknya manfaat enzim BAL dan ß-galactosidase bagi kesehatan, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang isolasi enzim β-galactosidase penghasil BAL dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.). Berdasarkan hal tersebut, diharapkan bakteri asam laktat yang diisolasi pada penelitian ini dapat digunakan sebagai sumber baru untuk menghasilkan enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan, khususnya penyakit. Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan secara makroskopis yaitu identifikasi morfologi bakteri asam laktat dan pewarnaan mikroskopis/gram.
Pada tahap awal proses fermentasi berlangsung secara anaerob karena bakteri asam laktat bersifat anaerob fakultatif. Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat diketahui dengan terlebih dahulu membuat kurva standar ONP dengan rentang konsentrasi 0-2,5 mM, yang tujuannya adalah untuk menentukan konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. . Isolasi, karakterisasi dan identifikasi potensi DNA bakteri asam laktat (BAL) sebagai agen antimikroba dari fermentasi buah markisa (Passiflora edulis var. flavicarpa).
