PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI P5
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA METODE DILUSI AIR
Nama : M. Ikhsan Syarlendra Nim : 2200023266
Kelas : 1C Gol : C4 Kel : 3
Dosen : Dr. apt. Ichwan Ridwan Rais, M.Sc., Ph.D
LABORATORIUM MICROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AHMAD DAHLAN YOGYAKARTA 2022
Uji Aktivitas Antimikroba Metode Dilusi Cair
A. Tujuan
Mengetahui kemampuan suatu antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroba secara dilusi cair dngan parameter KHM dan KBM.
B. Dasar Teori
Antimikroba adalah zat yang dapat menganggu pertumbuhan atau bahkan mematikan mikroba dengan cara mengganggu metabolism yang merugikan.
Mikroorganisme dapat menyebabkan bahaya karena kemampuan menginfeksi dan menimbulkan penyakit serta merusak bahan pangan. Antifungi termasuk dalam antimikroba yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan fungi.
Antifungi hanya dapat digunakan jika mempunyai sifat toksisitas selektif, artinya dapat membunuh fungi yang menyebabkan penyakit tetapi tidak beracun bagi penderitanya. Mekanisme kerja dari seyawa antifungi diantaranya yaitu menghambat sisntesis ergosterool, berikatan langsung dengan ergosterol yang terdapat dalam membrane sitoplasma , menghmabat sintesis khitin, meganggu sintesis asam nukleat dan protein.
Langkah pertama kerja obat berupa pegikatan obat pada reseptor sel ( beberapa ) doantaranya adalah enzim transpeptida. Kemudian dilanjutkan dengan reaksi transpeptisidase dan sintesis peptidoglikan yang etrhambat. Mekanisme diakhiri dengan pembuangan atau penghentian aktivitas penghambat enzim autolysis pada dinding sel. Pada lingkungan yang isotonis lisis terjadi pada lingkungan yang jelas hipertonik, mikroba berubah menjadi protoplas atau sferoflas yang hanya tertutup oleh selaput yang rapuh.
Sitoplasma semua sel hidup dibatasi oleh selaput sitoplasma yang bekerja sebagai penghalang dalam peamebilitas selektif, melakukan fungsi pengangkutan aktif sehingga dapat mengendalikan susunan sel. Bila integritas fungsi selaput terganggu misalnya oleh zat bersifat surfaktan sehingga permeabilitas dinding sel berubah atau bahkan menjadi rusak, maka komponen penting, seperti protein, asam nukelat, nukleotida, dan lain – lain keluar dari sel dan sel berangsur – angsur mati.
Aktivitas senyawa antifungi dipengaruhi oleh pH, suhu stabilitas senyawa tersebut, jumlah fungi yang ada, lamanya inkubasi, dan aktivitas metabolism fungi.
Berdasarkan aktivitasnya zat antifungis dibedakan menajdi dua jenis, yaitu fungistatistik dan fungisida. Fungistatik adlah zat antifungi yang memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan fungi ( menghambat perbanyakan populasi bakteri ), namun tidak mematikan. Fungisida adalah zat zat antifungi yang memiliki aktifitas menbunuh fungi. Namun ada beberapa zat antifungi yang bersifat fungistatik pada konsentrasi rendah dan bersifat fungisida pada konsistensi tinggi.
Metode dilusi dibedakan menjadi dua , yaitu dilusi cair ( broth dilution ) dan dilusi padat (solid dilution ).
a. Metode dilusi cair, digunakan untuk mengukur MIC atau kadar hambat minimum dan MBC atau kadar bunuh minimum. Cara yang dilakukan adalah degan member seri pengengseran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang telihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selnajutnya ditanamn / digoreskan pada media padat dan inkubasi selama 18-24 jam. Media padat yang tidak ditumbuhi fingi setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM.
b. Metode dilusi padat, pada metode ini adalah suatu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
Konsentrasi suspense mikroba yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba biasanya dibuat tersntadar dibandingkan kekeruhannya degna standar 0,5 Mc. Farland yang setara dengan 108 CFU/ml.
C.
Alat dan Bahan
Alat :
1. Alat gelas 2. Lampu spirtus 3. Yellow tip 4. Blue tip 5. Ose 6. Speander 7. Mikropipet 8. Tabung reaksi 9. Incubator 10. Oktoklaf 11. Oven 12. Neraca
13. Kompor listrik 14. Blender 15. Corong 16. Pipet volume 17. Botol semprot Bahan :
1. NaCl 0,9 % 2. Akuades
3. Media cair 4. Media padat 5. Antibiotic 6. Destilata 7. Etanol
D. Cara Kerja
1. Sterilisasi alat dan bahan
Semua alat dan bahan yang digunakan dicuci bersih, dikeringkan , dibungkus kertas dan disterilkan dengan oven pada suhu 160 – 180 selama 2 jam dan bahan yang digunakan disterilkan dengan autoclave pada suhu 121 selama 10-20 menit.
2. Pembuatan stok suspense mikroba
Koloni diambil dari media pertumbuhan sebanyak satu mata ose kemudian digoreskan pada media agar yang sesuai. Media agar yang sesuai tersebut diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37. Setelah tumbuh koloni mikroba , tabung sidimpan dalam suhu 4 dalam almari pendingin sebagai stok.
3. Pembuatan suspense mikroba
Diambil 100 mikroliter kultur cair yang telah diinkubasi selama 24 jam dimasukkan kedalam tabung yang berisi 1 ml media cair I, kemudian diinkubasi selama 4-6 jam 37 . setelah diinkubasi selama 4-6 jam kemudian diambil 100 mikoliter dimasukkan kedalam tabung dan 108 CFU/Ml. Kemudian diencerkan 100 kali dengan media cair II.
4. Pembuatan Larutan Kontrol
Dibuat 3 macam larutan control dalam tabung reaksi.
Kontrol pelarut (KP ) : 1 ml aquades = 1 ml media cair II Kontrol Media (KM) : 2 ml media cair I
Kontrol suspense (Ksus): 1 ml suspense mikroba = 1 ml aquades Kontrol Sampel (Ksam) : 1 ml larutan obat = 1 ml media II
5. Uji aktivitas antimikroba larutan uji (antibiotika)
a.) Dibuat seri kadar larutan antibiotic dari stok dengan konsentrasi 2%, 1%, 0,5% , 0,25
% b/v dengan cara pengenceran.
b.) Dimasukkan masing – maisng 1 ml dalam tabung reaksi
b.) Ditambah 1 ml suspense mikroba dan dikocok homogeny, tabung – tabung tersebut kemduia diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
c.) Dilakukan pengamatan adanya pertumbuhan mikroba pada maisng – masing tabung.
Untuk menegetahui KHM ditandai dengan tidak adanya mikroba ( larutan tampak jernih )
d.) Untuk mengethaui KBM, dilakukan penggoresan dari masing – masing cairan dalam tabung tersebut pada media padat dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
e.) Setelah dolakukan penginkubasian , hasil goresan diamati apakah terjadi pertumbuhan koloni pada media padat tersebut.
Dibiakkan mikroba pada media padat
Diambil 1 koloni, dimasukkan dalam 1 ml media cair 1 Dikocok
Dinkubasi selama 24 jam 37 C Dikocok
Diambil 100 m ikroliter dimasukkan dalam 1 ml media cair I
Diinkubasi selama 4-6 jam 37
Diambil 100 mikroliter = NaCl 0,9 % sampaikan kekeruhan sama Dengan standar Mc. Farland 108 CFU/ML
Diencerkan dengan cair II ( 1: 100 )
E. Hasil
1. Konsentrasi 0,25% : jernih 2. Konsentrasi 0,5% : keruh 3. Konsentrasi 1% : keruh 4. Konsentrasi 2% : keruh
Kadar Hambat Minimal (KHM) pada media cair yaitu pada Mesia dengan Konsentrasi 0,25% b/v
1. Konsentrasi 0.25 %: tumbuh koloni 2. Konsentrasi 0,5% : tumbuh koloni 3. Konsentrasi 1% : tidak tumbuh koloni 4. Konsentrasi 2% : tidak tumbuh koloni
Kadar Bunuh Minimal (KBM) padamedia padat yaitu pada media dengan konsentrasi 1%
% b/v
F. Pembahasan
Pada percobaan kali ini melakukan uji aktivitas bakteri metode dilusi cair. Menggunakan sampel obat untuk melakukan uji aktivitas bakteri metode dilusi cair dengan stok bakteri yang sudah tersedia. Pada uji aktivitas vakteri metode dilusi cair menggunakan
parameter KHM dan KBM. KHM adalah Kadar Hambat Minimal dengan konsentrasi terkecil dari obat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. kadar terkecil yang jernih (tidak ada endapan). KBM adalah Kadar Bunuh Minimal dengan konsentrasi terkecil dari obat yang dapat membunuh mikroba (tidak tumbuh koloni). Banyak antibiotik atau antimikroba yang digunakan untuk mengobati infeksi. Sekarang juga banyak bahan alam yang dikembangkan sebagai bahan anti mikroba. Pertama mempersiapkan alat dan bahan. Alat dan bahan yang digunakan yaitu stok bakteri, larutan Nacl 0,9%, standar Mc. Farland, media cair, media padat, sampel obat, mikro pipet, petri, lampu spiritus, yellow tip, blue tip, ose, tabung reaksi dan inkubator. Salah satu cara mengetahui uji aktivitas bakteri adalah menggunkan metode dilusi cair.Berikut Cara uji aktivitas mikroba metode dilusi cair :
1. Penyiapan suspensi mikroba uji
a. Pengembangbiakan (sub kultur) mikroba uji
Stok bakteri/mikroba uji dipindahkan ke media baru. sampel dapat berupa bakteri ataupun fungi. Sampel dipindahkan menggunakan ose yang digoreskan pada media.
Lalu media di inkubasi pada suhu 37C selama 18 -24 jam. Setelah itu dikeluarkan dan melakukan tahap selanjutnya.
b. Mengkondisikan mikroba mencapai fase eskponensial
Setelah sampel diinkubasi, tahapan selanjutnya mengkondisikan mikroba mencapai fase eksponensial. Fase eskponensial yaitu ditandai dengan periode pertumbuhan yang cepat.
misalnya mengambil 100 l hasil inkubasi dimasukan dalam 1 ml media baru lalu inkubasi lagi pada suhu 37C selama 3-5 jam. Proses pengambilan media atau sampel menggunakan mikro pipet dengan menggunakan yellow tip dan blue tip. Mengeluarkan media dari inkubator dan melakukan tahap selanjutnya.
c. Membuat suspensi bakteri 106 CFU/ml
Mengambil sejumlah volume biakan hasil inkubasi (misalnya 100 l lalu diencerkan dengan Nacl 0,9% hingga kekeruhan sama dengan kekeruhan 0,5 x standar Mc.Farland (=108CFU/ml). Setelah Kekeruhan sudah sama dengan standar Mc.Farland, sampel akan diencerkan lagi 100 x dengan media air yang DS(Double Strength) disebut sebagai suspensi mikroba uji.
2. Penyiapan larutan sampel obat atau bahan yang diuji dengan seri konsentrasi tertentu.
Contoh pembuatan larutan sampel 2%,1%,0,5% dan 0,25 % masing-masing sebanyak 1 ml. Mengisi 2 ml sampel ke tabung 1 (obat 2%), mengisi 1 ml pelarut (akuades) ke tabung 2 sampai tabung 4 (obat 1%, 0,5 % dan 0,25%). Selanjutnya, memindahkan 1 ml larutan secara berturut-turut dari tabung 1 ke tabung 2, dihomogenkan lalu dari tabung 2 ke tabung 3 dan seterusnya sampai tabung terakhhir dengan menggunakan mikro pipet.
Setelah itu memindahkan larutan terakhir ke tabung kontrol sampel. Dalam proses menghomogenkan larutan yaitu dengan cara mengambil larutan dengan mikro pipet kemudian dikeluarkan kembali. Hasil yang diperoleh pada Tabung Kontrol 1 berisi 2 ml suspensi mikroba, Tabung Kontrol 2 berisi 1 ml media DS dan 1 ml pelarut, Tabung Kontrol 3 berisi 1 ml sampel dan 1 ml media DS, Tabung Kontrol 4 berisi 2 ml media DS. Media DS yang digunakan bukanlah suatu media seperti media padat atau media cair. Media DS merupakan singkatan dari Double Streght yang memiliki nutrisi 2x lebih banyak dibanding media biasa. Contoh media BHI DS dapat digunakan untuk bakteri, sedangkan media CYG DS digunakan untuk fungi.
3. Pencampuran suspensi mikroba dan larutan sampel
Mencampurkan suspensi mikroba dan larutan sampel, kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 18-24 jam dengan volume sama banyak. kemudian diinkubasi. Dengan adanya proses pencampuran ini maka telah dilakukannya pengenceran 2x baik larutan sampelnya maunpun medianya. Sehingga terjadi perubahan konsentrasi sampel dan media DS. setelah itu lakukan inkubasi kembali.
4. penentuan kadar hambat minimal (KHM)
KHM adalah proses penentuan kadar hambat minimal suatu sampel dengan kadar atau konsentrasi terendah dari sampel yang sudah menghambat pertumbuhan mikroba menggunkan media cair. Hasil yang diperoleh Tabung dengan Konsentrasi 2%
menghasilkan larutan yang jernih, Tabung dengan Konsentrasi 0,5 % menghasilkan larutan yang keruh, , Tabung dengan Konsentrasi 0,25 % menghasilkan larutan yang keruh, dan Tabung dengan Konsentrasi 1 % menghasilkan larutan yang keruh. Kadar Hambat Minimal nya yaitu Media dengan Konsentrasi 2% dengan keadaan larutan jernih atau tidak ada endapan yang mampu menghambat pertumbahan mikroba.
5. penentuan kadar bunuh minimal (KBM)
KBM adalah proses penentuan kadar bunuh minimal suatu sampel dengan kadar atau konsentrasi terendah yang sudah menghambat pertumbuhan mikroba menggunakan media padat. Langkah yang dilakukan yaitu menanam sampel dengan ose pada media.
Ose disterilkan terlebih dahulu pada nyala api. Setelah itu mengambil media dengan ose lalu menggoresnya pada media padat dilanjutkan dengan inkubasi 18-24 jam suhu 37C. Hasil setelah diinkubasi yaitu pada Media dengan Konsentrasi 1% : tidak tumbuh koloni, Media dengan Konsentrasi 2% : tidak tumbuh koloni, Media dengan Konsentrasi 0,25% : tumbuh koloni, dan Media dengan Konsentrasi 0,5% : tumbuh koloni. Kadar Bunuh Minimal yaitu pada Media dengan Konsentrasi 1% yang tidak ditumbuhi koloni dengan konsentrasi terkecil
G. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa kadar hambat minimal 0,25% dan kadar bunuh minimalnya ada pada media dengan konsentrasi 1%.
H. Daftar Pustaka
Zainab. dkk. 2022. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Yogyakarta: Universitas Ahmad Dahlan Zainab. dkk. 2021. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Yogyakarta: Universitas Ahmad Dahlan
