BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian adalah eksperimental laboratories dengan rancangan penelitianThe Post Test Only Control Group Design.
4.2 Sampel Penelitian dan Besar Sampel 4.2.1 Sampel dan kriteria Sampel
Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang didapat dari laboratorium mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga. Dibiakkan dengan mediaBrain Hearth Infusion Broth (BHIB) dalam tabung reaksi.
4.2.2 Besar Sampel
Besar sampel dihitung dengan rumus Lemeshow: n= 2δ2 (Z1-½α + Z1-β)2
(µ1 - µ2)2
Namun sesuai dengan ketentuan yang ada, besar sampel minimal 7 sampel replikasi
Keterangan:
n = besar sampel.
δ = standard deviasi dari respon kelompok control. Z½α = adjusted standard deviation dari ½α (α=0.05, Z=1). Zβ = adjusted standard deviation dari β
µ1 = rata-rata hitung respon kelompok 1. µ2 = rata-rata hitung respon kelompok 2.
4.3.1 Variabel bebas
Variabel bebas adalah dosis atau besar konsentrasi bahan ekstrak daun ungu.
4.3.2 Variabel terikat
Variabel terikat adalah jumlah koloni bakteriEnterococcus faecalis, 4.3.3 Variabel terkendali
Variabel terkendali adalah jenis daun ungu, metode ekstraksi, media pertumbuhan bakteri, peralatan yang digunakan selama penelitian, suhu dan lama waktu inkubasi
4.4 Definisi Operasional :
a. Ekstrak daun ungu adalah serbuk daun ungu kering yang didapat dari balai penelitian di surabaya dan telah teridentifikasi oleh kebun raya purwodadi yang dimaserasi dengan larutan etanol dan diambil filtratnya dengan penyaring kemudian diuapkan dalam rotary vacum evaporator dengan suhu 40oC.
b. Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) adalah konsentrasi terendah ekstrak daun ungu yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis sebanyak 90% dari jumlah bakteri yang berhasil tumbuh pada kontrol positif (Forbes, 2007).
c. Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah ekstrak daun ungu yang dapat membunuh bakteri Enterococcus faecalis sebanyak 99,9% dari jumlah bakteri yang berhasil tumbuh pada kontrol positif
akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap 2 koloni yang dibantu dengan alat QCC (Quebec Coloni Center). Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit)
(Forbes, 2007)
d. Koloni Enterococcus faecalis adalah hasil identifikasi bakteri
Enterococcus faecalis yang terlihat dari pertumbuhan bakteri tersebut pada media blood agar dan dinyatakan dalam Colony Forming Unit
(CFU).
e. Kontrol positif adalah media BHIB yang ditambah dengan bakteri
Enterococcus faecalistanpa penambahan ekstrak daun ungu.
f. Kontrol negatif adalah media BHIB yang tanpa ditambah dengan bakteri
Enterococcus faecalisdan ekstrak daun ungu.
4.5 Tempat dan Waktu Penelitian
a. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi Unair Surabaya.
b. Pembuatan ekstrak daun ungu (Graptophyllum pictum) dilakukan di Laboratorium Farmasi Unair Surabaya.
4.6 Alat dan Bahan Penelitian 4.6.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : rak dan tabung reaksi, petridish (cawan petri), spuit, mikro pipet, gelas obyek steril, spreader, spidol, korek api, osse, anaerobic jar, spiritus brander, inkubator, timbangan gram, panci ekstrak, pengaduk ekstrak, dan gunting.
4.6.2 Bahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian adalah ekstrak daun ungu (Graptophyllum pictum), suspensi bakteri Enterococcus faecalis ATCC 29212, media BHIB dan pelarut etanol.
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Pembuatan Bahan Ekstrak
Pembuatan ekstrak sebagai berikut: Daun ungu yang didapat dari daerah tertentu dicuci bersih lalu diangin-anginkan, kemudian dikeringkan dengan oven dengan suhu 40°C sampai kering, kemudian diremas dan dihaluskan sampai menjadi serbuk menggunakan blender. 100 gram serbuk kemudian dimaserasi dengan larutan etanol 70% dan diambil filtratnya dengan penyaringan. Hasil saringan diuapkan dalam rotary vacum evaporator dengan suhu 40°C. Pada akhir proses ini didapatkan ekstrak murni (Wahyuningtyas, 2005).
4.7.2 Persiapan Bakteri
Bakteri Enterococcus faecalis ATCC 29212 disiapkan terlebih dahulu kemudian dilakukan pembiakan dalam media BHIB. Biakkan Enterococcus
anaerobic jar dalam suasana anaerob dan diinkubasi pada suhu kamar (37oC) selama 24 jam, kemudian ditanam pada permukaan media blood agar secara merata.
4.7.3 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)
Penentuan konsentrasi hambat minimal dan konsentrasi bunuh minimal bahan ekstrak daun ungu (Graptophyllum pictum) terhadapEnterococcus faecalis
dilakukan dengan metode penipisan seri/dilusi (Forbes and Berty 2007). a. Tabung steril disiapkan dan diberi tanda no.1 sampai no.12.
b. Masing-masing tabung (dari no.1 sampai 12) diisi media BHIB (5 ml).
c. Ekstrak daun ungu dengan konsentrasi 100% dimasukkan pada tabung no.1 sebanyak 10 ml.
d. Diambil 5 ml dari tabung no.1 kemudian dimasukkan ke dalam tabung no.2 hingga mencapai volume 10 ml. Penipisannya dari tabung ke dua adalah 5/10 = ½ = 50%
e. Selanjutnya dari tabung no.2 diambil 5 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung no.3 sehingga penipisannya ¼ = 25%. Dengan cara yang sama dilakukan sampai tabung no.10, dan 5ml dari tabung no.10 dibuang.
f. Tabung no.11 sebagai kontrol positif (media BHIB dan bakteriEnterococcus faecalis) dan tabung no.12 sebagai kontrol negatif berisi media BHIB.
g. Setelah seri penipisan selesai, dimasukkan 0,1 ml inokulum Enterococcus faecalis pada tabung no.1 sampai tabung no.10
i. Pembacaan hasil penipisan seri dari bahan terhadap pertumbuhan bakteri
Enterococcus faecalis, dengan pengamatan secara visual oleh pengamat yang ahli ada tidaknya pertumbuhan yang ditandai dengan kekeruhan atau endapan j. Karena bahan ekstrak berwarna gelap dan kekeruhan terjadi pada semua
tabung maka dilakukan strik pada media dengan cara, tiap tabung diambil 1 osse dan ditanamkan pada media blood agar.
k. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian amati pertumbuhan bakteri hasil strik. Hasil strik batas pertumbuhan bakteri di jadikan sebagai dugaan KHM
l. Ambil 0,1 ml inokulum dari 1 konsetrasi diatas dugaan KHM, dugaan KHM dan 1 konsentrasi dibawah dugaan KHM kemudian masing-masing di tanam pada media blood agar yang berbeda.
m. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian amati jumlah koloni yang tumbuh.
n. Kontrol positif dibuat dengan media padat blood Agar yang ditambah dengan 0,1 ml suspensi bakteri bakteri uji tanpa penambahan ekstrak daun ungu. o. Kontrol negatif dibuat dengan media padat blood Agar tanpa penambahan
bakteri uji dan ekstrak daun ungu.
p. Konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh minimal (KBM) ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media
blood agar secara manual dengan cara membuat garis kotak-kotak pada
petridish dan menggunakan alat QCC (Quebec Colony Counter) serta dinyatakan dengan colony forming unit (CFU) dan dibandingkan dengan
kontrol positif dan kontrol negatifnya. Perhitungan tersebut diulang tiga kali oleh tiga pengamat yang berbeda
4.8 Uji Statistik
Pengolahan data menggunakan analisis statistik dengan kepercayaannya sebesar 95% dan signifikasi 0,05 (montgomery 2002):
a. Uji normalitas menggunakan tes Kolmogorov-Smirnov untuk melihat apakah data yang didapat berdistribusi.
b. Uji homogenitas varians menggunakan tes Levene.
c. Uji parametrik menggunakan tes One Way Annova untuk melihat signifikansi perbedaan jumlah koloni bakteri antar kelompok penelitian. Hal ini dapat dilakukan karena data yang diperoleh berdistribusi normal serta variansi data homogen.
4.9 Alur Penelitian
Uji sensitivitas bakteriEnterococcus faecalis dengan metode dilusi
Metode dilakukan pada BHIB dengan Konsentrasi
100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,195%
Memasukkan 0,1 ml inokulum bakteri ke dalam tiap tabung hasil pengenceran termasuk tabung kontrol positive
Setiap tabung diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam
Pengamatan ada tidaknya kekeruhan pada tabung dan pengamatan pada
blood agar utuk mengetahui ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri
Karena bahan ekstrak yang berwarna gelap sehingga kekeruhan terjadi disemua tabung maka dilakukan strik pada media dengan cara setiap tabung diambil 1
osse dan ditanam pada blood agar serta di inkubasi
Amati pertumbuhan bakteri hasil strik. Hasil strik batas yang menunjukkan pertumbuhan bakteri di jadikan sebagaidugaan KHM
Ambil 0,1 ml inokulum dari 1 konsentrasi diatas dugaan KHM, dugaan KHM dan 1 konsentrasi dibawah dugaan KHM kemudian masing-masing diratakan
dengan caraswab pada media blood agar yang berbeda dan inkubasi.
Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dankonsentrasi Bunuh Minimal (KBM) ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media blood agar yang dinyatakan dengancolony forming unit (CFU) dan dibandingkan dengan
kontrol positif dan kontrol negatifnya. Perhitungan tersebut diulang tiga kali oleh tiga pengamat yang berbeda
