i
POSITIF DAN GRAM NEGATIF
Skripsi
Diajukan Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far).
Oleh
Muhamad Irwan Prima NIM: 107102001564
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGRI SYARIFHIDAYATULLAH
v ABSTRAK
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK METANOL GANGGANG MERAH (Gracilaria verrucosa) TERHADAP BEBERAPA BAKTERI PATOGEN GRAM POSITIF DAN GRAM NEGATIF
Telah dilakukan penelitian uji aktivitas antibakteri ektrak metanol ganggang merah Gracilaria verrucosa terhadap tiga bakteri patogen gram positif dan tiga bakteri patogen gram negatif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol ganggang merah (Gracilaria verrucosa) terhadap bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus pneumoniae) dan bakteri gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis). Sampel ganggang merah
(Gracilaria verrucosa) dimaserasi dengan pelarut metanol kemudian dilakukan uji
aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram yang dibandingkan dengan kontrol positif amoksisilin. Hasil dari penelitian ini menunjukan bahwa ekstrak metanol Gracilaria verrucosa tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji pada konsentrasi 100, 1000, 10.000, dan 100.000 µg/ml.
vi ABSTRACT
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF METHANOL EXTRACTS OF RED ALGAE (Gracilaria verrucosa) TO SOME PHATOGEN GRAM-POSITIVE AND GRAM-NEGATIVE BACTERIA
The antibacterial activity of methanol extract of red algae (Gracilaria verrucosa) was tested to some phatogen Gram-positive and some Gram-negative bacteria. The aim of this research is to know further antibacterial activity from metanolic extract of red algae (Gracilaria verrucosa) against Gram-positive bacteria
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,Streptococcus pneumoniae) and
Gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis). Sample was macerated with methanol and tested its antibacterial activity by disc diffusion method. The result of this reseach showed that methanol extract of red algae (Gracilaria verrucosa) has not activity against some phatogen Gram-positive and Gram-negative bacteria at concentrations 100, 1000, 10.000, dan 100.000 µg/ml.
vii
KATA PENGANTAR
Segala puji dan Syukur kehadirat Allah SWT karena atas limpahan nikmat, karunia dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat dan pengikut-Nya yang telah membawa umat-Nya dari zaman kegelapan hingga zaman yang kaya akan Ilmu Pengetahuan dan kemajuan teknologi seperti sekarang ini.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Adapun judul skripsi ini adalah “Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol
ganggang merah Gracilaria verrucosa terhadap beberapa bakteri patogen gram positif dan gram negatif”.
Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak, maka dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Prof. DR. (hc) dr. M.K. Tadjuddin, Sp. And selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah.
2. Drs. Umar Mansur, M.Sc selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah.
viii
4. Dr. Ismiarni Komala, M.Sc, Apt selaku dosen pembimbing II (kedua) yang telah meluangkan waktu, tenaga dan buah pikirannya untuk mendidik, membimbing dan memotivasi kami.
5. Orang tua saya yakni Bpk H. Wawan Kustiawan dan Ibu Hj. Elly Holiah serta Saudara kandung saya yakni Yudha dan Robby yang telah memberikan semangat, motifasi dan doa kepada kami sehingga tugas akhir ini dapat disusun dan penelitian pun telah dilaksanakan
6. Teman-teman seperjuangan selama di farmasi yakni Muhardi, Ibel, Lutfi, Intan, Regi, Dimas, Bhanu, Kaniya, Fanny, dan Edriansyah. Juga teman seperjuangan di Lab. Mikrobiologi, Aisyah, Zelin, Fajri, dan Selvy.
7. Tidak lupa untuk Putri Tsaniah Amalia yang selalu memberi semangat dalam penelitian.
8. Teman - teman satu Kelas Farmasi B yang tetap kompak, peduli, setia kawan, saling dapat merasakan satu sama lain dan teman-teman Farmasi angkatan 2007 yang ikut serta membantu selama penelitian ini.
9. Kak Eris, Kak Rahmadi, S.Si, Kak Niken, S.Si, Kak Novi, S.Si, Kak Yopi Mulyana, S.Far, Kak Tiwi, S.Far dan Kak Lisna Fauzia, S.Far yang telah meluangkan waktu dan tenaganya untuk menyediakan tempat (laboratorium), menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang dibutuhkan selama penelitian. 10. Dosen - dosen Farmasi dan Staf akademik Program Studi Farmasi Fakultas
ix
11. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu.
Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih terdapat kekurangan dan masih jauh dari kesempurnaan seperti pribahasa berikut “Tidak ada gading yang tak retak” Oleh karena itu, penulis menerima saran, masukan dan
kritik dari para pembaca untuk memperbaiki kemampuan menulis pada kesemapatan berikutnya.
x DAFTAR ISI
Halaman Judul ... i
Lembar Persetujuan Skripsi ... ii
Lembar Pernyataan... iii
Abstrak ... iv
Abstract ... v
Kata Pengantar ... vi
Daftar Isi ... viii
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Perumusan Masalah ... 2
1.3. Tujuan Penelitian ... 3
1.4. Hipotesis ... 3
1.5. Manfaat Penelitian ... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Gracilaria verrucosa ... 4
2.1.1. Deskripsi ... 5
2.1.2. Kandungan kimia ... 6
2.1.3. Manfaat Tumbuhan ... 6
2.2. Ekstraksi ... 6
2.3. Tinjauan tentang bakteri ... 12
2.3.1. Morfologi bakteri ... 12
xi
2.4. Bakteri Uji ... 13
2.5. Antibakteri ... 21
2.5.1. Mekanisme kerja antibakteri ... 21
2.5.2. Penentuan Aktivitas Antibakteri ... 23
2.6 Antibakteri Pembanding ... 25
2.7 Kerangka Konsep ... 27
BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan waktu penelitian ... 28
3.2. Alat dan bahan ... 28
3.3. Prosedur Kerja ... 29
3.3.1. Persiapan Bahan Untuk Ekstraksi ... 29
3.3.2. Ekstraksi dengan Pelarut Organik ... 30
3.3.3. Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak ... 30
3.3.4. Penapisan Fitokimia ... 31
3.3.5. Sterilisasi Alat dan Bahan ... 34
3.3.6. Pembuatan Media Pertumbuhan ... 34
3.3.7. Pembuatan Stok Bakteri ... 35
3.3.8. Pembuatan Suspensi Bakteri ... 35
3.3.9. Pembuatan Larutan Uji ... 35
3.3.10. Pengujian Aktivitas Antibakteri ... 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil ... 37
4.1.1 Determinasi Sampel ... 37
xii
4.1.3 Pembuatan Ekstrak ... 38
4.1.4 Uji Aktivitas Antibakteri ... 38
4.2 Pembahasan ... 39
BAB V KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan ... 43
5.2 Saran ... 43
Daftar Pustaka .... ... 44
xiii DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Gracilaria verrucosa ... 47
Gambar 2. Ekstrak Gracilaria verrucosa... 47
Gambar 3. Hasil Penapisan fitokimia ... 48
Gambar 4. Staphylococcus aureus ... 50
Gambar 5. Bacillus subtilis ... 50
Gambar 6. Streptococcus pneumoniae ... 50
Gambar 7. Proteus mirabillis ... 51
Gambar 8. Escherichia coli ... 51
xiv DAFTAR TABEL
[image:14.595.132.493.189.540.2]1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Penyakit infeksi atau penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme merupakan penyakit yang banyak ditemukan dalam masyarakat. Menurut laporan WHO penyakit infeksi ini menjadi penyebab kematian terbesar pada anak-anak dan dewasa dengan jumlah kematian lebih dari 13 juta jiwa setiap tahun, menempati urutan kedua (25%) setelah kardiovaskular (31%) dari 53,9 juta kasus penyebab kematian di dunia dan menjadi penyebab kematian utama pada anak dibawah umur 4 tahun (WHO 1999).
Infeksi dapat diobati dengan menggunakan antibiotik. Antibiotik adalah senyawa kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri tanah, yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Akan tetapi penggunaan antibiotik secara besar-besaran untuk terapi dan profilaksis adalah faktor utama terjadinya resistensi (Tjay et al., 2002). Oleh karena itu perlu dicari alternatif pengobatan infeksi di samping menggunakan antibiotik yaitu dengan pemanfaatan obat - obat dari bahan alam.
2
sebagai antijamur (Melo et al.,2006) serta bromophenol sebagai antibakteri (Xu et al,.2002).
Rhodophyceae merupakan jenis rumput laut yang mempunyai nilai ekonomis
penting karena dari famili ini dapat menghasilkan karagenan dan agarosa. Selain itu studi tentang aktivitas antibakteri pada ganggang merah telah banyak dilakukan. Contohnya pada Cystoclonium purpureum dimana diketahui bahwa C. purpureum mengandung α-carotene, trans-phytol, ubiquinol-9, lutein, dan fucoxantine (Findlay, 1985) yang merupakan asam lemak yang berperan sebagai antibakteri. Selain itu, studi aktivitas antibakteri pada ganggang merah Gracilaria verrucosa telah diteliti memiliki aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas syringae pada fase etil asetat (Kumar et al.,2008).
Ganggang merah G. verrucosa telah diketahui mengandung asam lemak jenuh dan tak jenuh (Khotimchenko, 2005), steroid (Idler, 1968), prostaglandin (Nevshupova, 1999), glikolipid (Son, 1990), polisakarida (Sasikumar et al.,1999), hemaglutinin (Kakita, Kamishima 1997, 1999), kolesterol, glukosida, (Aydogmus, 2008), juga fenolik (Lidya, 2008).
Berdasarkan permasalahan diatas, maka dilakukan penelitian aktivitas antibakteri ekstrak metanol dari G. verrucosa terhadap 3 bakteri patogen gram positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri
1.2.Perumusan Masalah
Apakah ekstrak metanol G. verrucosa memiliki potensi sebagai antibakteri dengan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri gram positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan
gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis) ?
1.3Hipotesis
Ekstrak metanol G. verrucosa mempunyai aktivitas antibakteri terhadap beberapa bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
1.4Tujuan Penelitian
Menguji aktivitas antibakteri ekstrak metanol G. verrucosa terhadap beberapa bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus pneumoniae) dan gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
1.5 Manfaat Penelitian
4 BAB I I
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gracilaria verrucosa
Berdasarkan ilmu taksonomi, klasifikasi ganggang merah Gracilaria
verucossa adalah sebagai berikut :
Dunia : plantae
Filum : Rhodophyta
Kelas : Rhodophyceae
Bangsa : Gigartinales
Suku : Gracilariaceae
Marga : Gracilaria
2.1.1 Deskripsi
Nama lokal dari G. verrucosa adalah bulung rambut (Bali) dan sango-sango (Sulawesi). Tumbuhan ini memiliki ciri-ciri thallus silindris, halus, licin, pinggir bergerigi, membentuk rumpun radial seperti umbi tanaman jahe, percabangan berseling tidak beraturan dan memusat kearah pangkal. Ukuran thalus panjang 25cm dan diameter thalus 0,5 - 1,5mm. Tumbuh melekat pada substrat batu, umumnya di daerah terumbu karang. Di perairan laut, Gracilaria hidup di daerah litoral dan sublitoral sampai kedalam tertentu yang masih dapat ditembus oleh cahaya matahari. Beberapa jenis hidup di perairan keruh, sungai atau tempat yang sering terjadi pengadukan yang tinggi akibat pencampuran air tawar dan air laut (Suhardimansyah, 2004).
Pertumbuhan maksimum Gracilaria diperoleh pada kisaran salinitas 15-38 ppt, sedangkan kisaran salinitas optimum berkisar 15-24ppt. Suhu air yang baik untuk pertumbuhan Gracilaria antara 20-28 oC. Dengan kisaran pH 6-9 dan kedalaman air antara 0,5-1,0 m. Untuk menunjang pertumbuhannya, Gracilaria melakukan fotosintesis maka diperlukan ketersediaan unsur hara dalam perairan. Unsur hara tersebut akan masuk ke dalam tubuh melalui proses difusi sehingga akan meningkatkan laju pertumbuhan (Anggadiredja et al ,2006 ; Aslan,1998).
kadang-6
kadang hampir dichotomous dengan perulangan lateral. Bentuk cabang silindris dah meruncing diujung cabang (Soegiarto et al.,1978).
2.1.3. Kandungan Kimia
Ganggang merah G. verrucosa telah diketahui mengandung asam lemak seperti digalactosyldiacylglycerides, phosphatidyl cholines (PC), monogalactosyl diacylglyderides (MGDG), dan sulfoquinovosyldiacylglycerides (Khotimchenko, 2005), cholesterol (Doyle & Patterson, 1972), prostaglandin seperti PGA2, PGE2, PGF2, dan 15-keto-PGE2 (Nevshupova, 1999., Imbs et al.,2001),
polisakarida (Sasikumar, Rao, & Rengasamy, 1999) glikolipid seperti 1,2-diacyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1 → 6 )-O-β-D-galactopyranosyl] glycerol (acyl: palmitate-oleate-arachidonate 5:1:4) dan 1,2-diacyl-3-O- (6-sulpho-α -D-quinovopyranosyl) glycerol (acyl: myristate-palmitate-arachidonate 4:15:1) (Son, 1990), hemagglutinin seperti H-GVH dan L-GVH (Kakita, Kamishima, 1997,1999), glukosida seperti (24R)-5α-stigmast-9-(11)-en-3α-D-glucopyranoside dan palmitoleic acid (Aydogmus, 2008 ) juga fenolik (Lydia, 2008).
2.1.4. Manfaat tumbuhan
2.2Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode ekstraksi senyawa bukan atom dipergunakan oleh beberapa faktor, yaitu sifat jaringan tanaman, sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang bersifat polar (metanol atau etanol).
Ekstraksi digolongkan ke dalam dua bagian besar berdasarkan bentuk fase yang diekstraksi yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair padat, ekstraksi cair padat terdiri dari beberapa cara yaitu maserasi, perkolasi dan ekstraksi sinambung.
Metode ekstraksi dapat dibedakan menjadi Infundasi, Maserasi, Perkolasi dan Penyarian berkesinambungan. Dari keempat cara tersebut sering dilakukan modifikasi untuk memperoleh hasil yang baik (Hargono, 1986)
1. Infundasi
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 90ºC selama 15 menit.
8
cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Cara ini sangat sederhana dan sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional. Dengan beberapa modifikasi, cara ini sering digunakan untuk membuat ekstrak.
2. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak dan lain-lain.
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian.
Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang sempurna.
Maserasi dapat dilakukan modifikasi, misalnya : a. Digesti
b. Maserasi dengan mesin pengaduk
Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam.
c. Remaserasi
Cairan penyari dibagi dua. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua.
d. Maserasi Melingkar
Maserasi dapat diperbaiki dengan mengusahakan agar cairan penyari selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini penyari selalu mengalir kembali secara berkesinambungan melalui serbuk simplisia dan melarutkan zat aktifnya.
e. Maserasi Melingkar Bertingkat
Pada maserasi melingkar penyarian tidak dapat dilaksanakan secara sempurna, karena pemindahan massa akan berhenti bila keseimbangan telah terjadi. Masalah ini dapat diatasi dengan maserasi melingkar bertingkat (M.M.B.).
3. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut:
10
bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang akan dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan diatasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan.
Kekuatan yang berperan pada perkolasi antara lain: gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adhesi, daya kapiler dan daya geseran (friksi).
Perkolasi dapat dilakukan modifikasi, misalnya : a. Reperkolasi
Untuk menghindari kehilangan minyak atsiri pada pembuatan sari, maka cara perkolasi diganti dengan cara reperkolasi. Pada perkolasi dilakukan pemekatan sari dengan pemanasan. Pada reperkolasi tidak dilakukan pemekatan. Reperkolasi dilakukan dengan cara : simplisia dibagi dalam beberapa perkolator, hasil perkolator pertama dipisahkan menjadi perkolat I dan sari selanjutnya disebut susulan II. Susulan II digunakan untuk menyari perkolator II. Hasil perkolator kedua dipisahkan menjadi perkolat II dan sari selanjutnya disebut susulan II. Pekerjaan tersebut diulang sampai mendapat perkolat yang diinginkan.
b. Perkolasi Bertingkat
simplisia dengan menggunakan cairan penyari yang baru, diharapkan agar serbuk simplisia tersebut dapat tersari sempurna.
4. Penyarian Berkesinambungan a. Sokhletasi
Sokhletasi merupakan metoda ekstraksi cara panas yang menggunakan alat sokhlet, pada keadaan ini sample dan pelarut berada dalam keadaan terpisah. Pengekstrak sokhlet hanya diperlukan untuk mendapatkan senyawa yang tidak terbatas pada kelarutan pada pelarut dan pengotor yang tidak larut pada pelarut yang digunakan. Jika menginginkan senyawa yang mempunyai kelarutan yang tinggi dalam pelarut kemudian filtrasi dapat digunakan untuk memisahkan senyawa dari zat yang tidak larut.
Keuntungan :
1. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung diperoleh hasil yang lebih tepat.
2. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.
3. Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa menambah volume cairan penyari.
Kerugian :
12
2. Cairan penyari dididihkan terus menerus, sehingga cairan penyari yang baik harus murni atau cairan azeotrop.
b. Destilasi uap
Destilasi uap dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia yang mengandung komponen yang mempunyai titik didih tinggi pada tekanan udara normal. Pada pemanasan biasa kemungkinan akan terjadi kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut maka penyarian dilakukan dengan destilasi uap.
Dengan adanya uap air yang masuk, maka tekanan kesetimbangan uap zat kandungan akan diturunkan menjadi sama dengan tekanan bagian di dalam suatu sistem, sehingga produk akan terdestilasi dan terbawa oleh uap air yang mengalir. Destilasi uap bukan semata-mata suatu proses penguapan pada titik didihnya, tetapi suatu proses perpindahan masa ke suatu media yang bergerak. Uap jenuh akan membasahi permukaan bahan, melunakkan jaringan dan menembus ke dalam melalui dinding sel, dan zat aktif akan pindah ke rongga uap air yang aktif dan selanjutnya akan pindah ke rongga uap yang bergerak melalui antar fase. Proses ini disebut hidrodifusi.
2.3.Tinjauan Tentang Bakteri 2.3.1. Morfologi Bakteri
utama, yaitu kokus, batang dan spiral. Dengan diameter umumnya 1 – 10 µm. bakteri yang patogen pada manusia biasanya tumbuh dengan baik pada 370C (Staf Pengajar FKUI, 1993).
2.3.2. Pertumbuhan Bakteri
Istilah pertambahan umum digunakan untuk bakteri dan mikroorganisme lain dan biasanya mengacu pada perubahan dalam jumlah sel (pertambahan total massa sel) dan bukan perubahan individu organisme. Inokulum hampir selalu mengandung ribuan organisme, pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah dan atau massa melebihi yang ada di inokulum asalnya. Selama fase pertumbuhan seimbang (balanced gowth), pertambahan massa bakteri berbanding lurus (proporsional) dengan pertambahan komponen selular yang lain seperti DNA, RNA dan protein (Pelczer et al., 1998)
Mikroorganisme sering tumbuh dan bereproduksi ketika mineral dan sumber energi, karbon, nitrogen, phosphor, dan sulpur disuplai serta kondisi lingkungan yang mendukung (Prescott et al., 2002).
2.4. Bakteri Uji
1. Staphylococcus aureus
Taksonomi :
Domain: Bacteria
14
Filum: Firmicutes
Kelas: Bacilli
Ordo: Bacillales
Famili: Staphylococcaceae
Genus: Staphylococcus
Spesies: S. aureus
Nama binomial : Staphylococcus aureus (Rosenbach 1884)
Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang sering ditemukan
sebagai flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia. S. aureus merupakan salah satu bakteri Gram Positif berbentuk bulat yang hidup dalam saluran saluran pengeluaran lendir dari tubuh manusia dan hewan seperti hidung, mulut dan tenggorokan dan dapat dikeluarkan pada waktu bersin atau batuk.
Bakteri ini berbentuk sferis, menggerombol dengan susunan yang tidak teratur dengan diameter 0,8-1,0 µm.
Jenis-jenis Staphylococcus aureus di laboratorium tumbuh dengan baik dalam kaldu biasa pada suhu 37 0C. Batas- batas untuk pertumbuhannya ialah 15 0C dan 40 0C. Dengan pertumbuhan optimum 35
0
cembung buram, mengkilat dan konsistensinya lunak. Warna khas ialah kuning keemasan (Staf Pengajar FKUI. 1993).
2. Bacillus subtilis Taksonomi :
Kingdom: Bacteria
Phylum: Firmicutes
Class: Bacilli
Order: Bacillales
Family: Bacillaceae
Genus: Bacillus
Species: B. subtilis
Binomial name : Bacillus subtilis (Frankland & Frankland 1887)
Menurut Buchanan dan Gibbons (1974) dalam Bergey’s of
Determinative Bacteriology, B. subtilis termasuk genera Bacillus,
16
subtilis merupakan saprofit ringan yang tidak berbahaya yang lazim
terdapat dalam tanah, air, udara dan tumbuh-tumbuhan sernamampu membentuk endospora yang tahan panas (Jawetz et al. 1996).
3. Streptococcus pneumoniae
Taksonomi :
Domain: Bacteria
Phylum: Firmicutes
Class: Cocci
Order: Lactobacillales
Family: Streptococcaceae
Genus: Streptococcus
Species: S. pneumoniae
Binomial name : Streptococcus pneumonia (Klein 1884)
Streptococcus pneumoniae adalah sel gram positif berbentuk bulat
Streptococcus pneumoniae adalah sel gram positif berbentuk bulat telur atau seperti bola, secara khas terdapat berpasangan atau rantai pendek. Bagian ujung belakang tiap pasangan sel secara khas berbentuk tombak (runcing tumpul), tidak membentuk spora dan tidak bergerak tetapi galur yang ganas berkapsul, menghasilkan α-hemolisis pada agar
darah dan akan terlisis oleh garam empedu dan deterjen (Jawetz et al. 1996).
4. Escherichia coli
Taksonomi :
Domain: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Kelas: Gammaproteobacteria
Ordo: Enterobacteriales
Famili: Enterobacteriaceae
Genus: Escherichia
Spesies: E. coli
Nama binomial : Escherichia coli (Migula 1895)
18
berspora, gerak positif dengan flagel peritrikh. Koloni bakteri umumnya basah, halus, keabu-abuan, permukaannya licin. Hemolisis tipe beta. Pada perbenihan cair tumbuh secara difusi. Jenis perbenihan yang dipakai untuk isolasi bakteri enterik adalah diferensial, selektif dan persemaian.
Escherichia coli adalah bakteri oportunitis yang banyak ditemukan
didalam usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi primer pada usus misalnya diare pada anak dan
travelersdiarrhea, dan juga dapat menimbulkan infeksi pada jaringan
tubuh lain diluar usus (Staf Pengajar FKUI, 1993).
5. Pseudomonas aeruginosa
Taksonomi :
Kerajaan: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Kelas: Gamma Proteobacteria
Ordo: Pseudomonadales
Famili: Pseudomonadaceae
Genus: Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar 0,6 x 2 µm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa termasuk bakteri gram negatif. Bakteri ini bersifat aerob, katalase positif, oksidase positif, tidak mampu memfermentasi tetapi dapat mengoksidasi glukosa/karbohidrat lain, tidakberspora, tidak mempunyai selubung (sheat) dan mempunyai flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak.
Bakteri ini dapat tumbuh di air suling dan akan tumbuh dengan baik dengan adanya unsur N dan C. Suhu optimum untuk pertumbuhan P.
aeruginosa adalah 42oC. P.aeruginosa mudah tumbuh pada berbagai
media pembiakan karena kebutuhan nutrisinya sangat sederhana. Di laboratorium, medium paling sederhana untuk pertumbuhannya digunakan asetat (untuk karbon) dan ammonium sulfat (untuk nitrogen) (Jawetz, 1996).
6. Proteus mirabilis
Taksonomi:
Kingdom: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
20
Order: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Proteus
Species: P. mirabilis
Binomial name : Proteus mirabilis (Hauser, 1885)
Setelah tumbuh selama 24-48 jam pada media padat, kebanyakan sel
seperti tongkat, panjang 1-3 m dan lebar 0,4-0,6 m, walaupun pendek
dan gemuk bentuknya kokus biasa. Dalam kultur muda yang mengerumun di media padat, kebanyakan sel panjang, bengkok, dan
seperti filamen, mencapai 10, 20, bahkan sampai panjang 80 m. dalam
2.5 Antibakteri
Antimikroba adalah senyawa kimia yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Berdasarkan jenis mikroorganisme yang dimatikan atau dihambat pertumbuhannya, antimikroba terbagi menjadi antibakteri, antifungi, antivirus, dan protozoa.
Antibakteri adalah zat yang membunuh bakteri atau menekan pertumbuhan dan reproduksi mereka. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi manusia, ditentukan harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Berdasarkan toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai kadar hambat minimal (KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu dapat meningkat aktivitasnya dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM. (Ganiswara dkk,1995).
2.5.1 Mekanisme Kerja Antimikroba (Jawetz, 1996; Pratiwi, 2008)
Antimikroba berdasarkan struktur kimia dan mekanisme aksi dikelompokan menjadi :
22
ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan cara menghambat protein pengikat penisilin (penicillin binding protein), protein ini merupakan enzim damlam membrane plasma bakteri yang secara normal terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan silang dengan peptidoglikan dinding sel bakteri dinding sel bakteri. Termasuk didalamnya golongan β-laktam (misalnya, penisilin).
c. Agen yang bekerja langsung membran plasma mikroorganisme, meningkatkan permeabilitas dan menyebabkan kebocoran sel intraselular. Membran plasma bersifat semipermiabel dan mengendalikan transport berbagai metabolit kedalam dan luar sel. Adanya gangguan atau kerusakan struktur pada membran plasma sebagai penghalang (barrier) osmosis dan mengganggu sejumlah proses biosintesis yang diperlukan dalam membran. Termasuk didalamnya detergen seperti polymyxin; polyene agen antijamur (misalnya, nistatin dan amfoterisin B) yang mengikat dinding sterol; dan lipopeptide daptomycin;
d. Agen yang mengganggu fungsi ribosom subunit 30S atau 50S secara reversible menghambat sintesis protein, yang umumnya adalah bakteriostatik (misalnya, kloramfenikol, amoksisilin, eritromosin, klindamisin, streptogramis, dan linezolid) dan bakterisidal(misalnya aminoglikosida); e. Agen yang mempengaruhi metabolisme asam nukleat bakteri.
f. Antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit mikroorganisme, karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal bagi enzim metabolism. Termasuk didalamnya trimetoprim dan sulfonamide, yang menghambat enzim penting metabolism folat.
2.5.2 Penentuan Aktifitas Antimikroba
Potensi dari suatu antimikroba diperkirakan dengan membandingkan penghambatan pertumbuhan terhadap mikroorganisme yang sensitif dari hasil penghambatan suatu konsentrasi antibiotic uji dibandingkan dengan antibiotik refrensi. Bahan refrensi yang digunakan dalam pengujian adalah zat yang aktivitasnya terlah diketahui dengan mengacu pada Standar Internasional yang telah sesuai (Anonim, 2001).
Penentuan aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode difusi dan metode dilusi. Pada metode difusi termasuk didalamnya medote disk diffusion (tes Kirby & Baur), E-test, ditch-plate
technique, cup-plate technique. Sedangkan pada metode dilusi termasuk
didalamnya metode dilusi cair dan dilusi padat (Pratiwi, 2008). a. Metode difusi diantaranya :
24
2) Metode E-test digunakan untuk mengestimasi KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertubuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunkan strip plastic yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang, menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.
3) Ditch-plate technique. Pada metode ini sample uji berupa agen
antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba.
4) Cup-plate technique. Metode ini serupa dengan metode disc diffusion,
dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.
b. Metode dilusi diantaranya:
ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang ditetapkan terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai KBM. 2) Metode dilusi padat (solid dilution test). Metode ini serupa dengan
metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
2.6 Antibakteri Pembanding (Farmakope Indonesia, 1995)
Karakteristik amoksisilin yang digunakan sebagai antibakteri pembanding adalah sebagai berikut:
1. Rumus Bangun :
2. Rumus Kimia : C16H19N3OS
3. Nama Lain : (2S,5R,6R)- 6-{[(2R)-2-amino- 2-(4-hydroxyphenyl)- acetyl]amino}- 3,3-dimethyl- 7-oxo- 4-thia- 1-azabicyclo[3.2.0]heptane- 2-carboxylic acid
4. Pemerian : serbuk hablur, kuning, tidak berbau.
26
2.7 Kerangka Konsep
Pemanfaatan ganggang secara tradisional sebagai bahan pangan dan obat-obatan telah dilakukan oleh masyarakat
(Nontji,2002)
Penelitian terdahulu menunjukkan potensi antibakteri dari fase etil asetat Gracilaria
verrucosa (Kumar et al, 2008).
Analisi Mekanisme Penghambatan Antibakteri
Analisis Kebocoran Ion Logam Ca2+ dan K+ Analisis Kerusakan Sel
Penentuan diameter hambat
Penapisan Fitokimia
Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kental Gracilaria
verrucosa
Penentuan KHM dan KBM
28 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2011 sampai dengan Januari 2012 di Laboratorium Pharmacy Drugs Development and Reseach (PDR), Laboratorium Mikrobiologi FKIK UIN-Jakarta.
3.2 Alat dan Bahan a.Alat
Peralatan gelas, timbangan analitik, rotavaporator, desikator, oven, krustang, hot plate, tabung reaksi, plat tetes, spatula, pipet, erlenmayer, gelas ukur,
tissue, jarum ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, tabung sentrifuse,
sentrifuse, cawan petri, shacker, gunting, vortex, autoklaf, inkubator, lampu spritus, timbangan analitik, kertas saring whatman no.52, kapas steril, mikropipet, lemari pendingin, spektrofotometri UV-VIS, Laminar Air Flow (LAF).
b.Bahan
1) Bahan uji
2) Bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923, Basillus subtilis, Streptococcus pneumoniae ATCC 96924, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabillis yang didapat dari Laboraturium Mikrobiologi dan Parasitologi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3) Antibakteri Pembanding
Antibakteri pembanding yang digunakan adalah amoksisilin 4) Bahan Kimia
Bahan-bahan kimia yang digunakan diantaranya: Mueller Hinton Agar (MHA), Blood Agar Base, NutrientAgar, NutrientBroth, Vitamin K, NaCl, FeCl3, metanol, alkohol, Dimetilsulfoksida (DMSO), serbuk
Mg, HCl, pereaksi dragendorff, pereaksi meyer, kloroform, natrium sulfat anhidrat, asam asetat anhidrat, H2SO4, aquadest.
3.3Prosedur Kerja
3.3.1 Penyiapan simplisia G. verrucosa
30
3.3.2 Ekstraksi dengan Pelarut Organik
Serbuk rumput laut G. verrucosa sebanyak 500 g dimaserasi dengan menggunakan metanol selama 5 hari dengan mengganti pelarut setiap 24 jam, kemudian disaring dengan menggunakan kapas dan kertas saring. Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarutnya pada suhu 500C dengan menggunakan vacuum rotary evaporator, sehingga diperoleh ekstrak kental rumput laut G. verrucosa sebanyak 28 gram.
3.3.3 Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak (Depkes RI, 2000) a. Organoleptik
Pengujian ini dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau, dan rasa dari ekstrak yang dihasilkan
b. Rendemen ekstak
Rendemen ekstrak etanol rumput laut G. verrucosa dihitung dengan membandingkan bobot awal simplisia dengan bobot akhir ekstrak yang dihasilkan.
% Rendemen =Bobot ekstrak yang dihasilkan
Bobot awal simplisia x 100%
c.Susut pengeringan
Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara menimbang ekstrak sebanyak ±0.5g dan dimasukan kedalam botol timbang bertutup yang sebelumnya telah ditara. Kemudian dimasukan kedalam oven pada suhu 105 0C sehingga diperoleh bobot yang relatif tetap.
% Susut pengeringan =b−c
Keterangan :
a = bobot cawan kosong
b = bobot sampel dan cawan sebelum dikeringkan dalam oven c = bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan dalam oven 3.3.4 Penapisan Fitokimia
Pemerikasaan kandungan kimia dalam rumput laut (Harbone, 1984), diantaranya:
a. Identifikasi golongan alkaloid
32
b. Identifikasi golongan flavonoid
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa ditambahkan 100 ml aquadest panas, dididihkan selama 15 menit, saring dengan kertas saring, diperoleh filtrat yang akan digunakan sebagai larutan percobaan. Kedalam 5 ml larutan percobaan ( dalam tabung reaksi ), ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium secukupnya dan 1 ml HCl pekat, tambahkan 5 ml amilalkohol, dikocok dengan kuat, biarkan hingga memisah, terbentuk warna dalam larutan amilalkohol menunjukan adanya senyawa flavonoid.
c. Identifikasi senyawa saponin
Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan golongan flavonoid, dimasukan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, kemudian dibiarkan selama 10 menit, terbentuk busa yang stabil dalam tabung reaksi menunjukan adanya senyawa golongan saponin, bila ditambahkan 1 tetes HCl 1% (encer) busa tetap stabil.
d. Identifikasi golongan tanin
dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes larutan Ferri (III) kloridaa 1%, terbentuk warna biru tinta menujukan adanya tanin galat.
e. Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam (dalam wadah dengan penutup rapat), disaring dan diambil filtratnya, 5 ml dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu/sisa, kedalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Libermann-Buchard), terbentuk warna hijau atau merah menunjukan adanya senyawa golongan steroid atau triterpenoid.
f. Identifikasi golongan kuinon
Sejumlah tertentu serbuk/ekstrak G. verrucosa ditambahkan 100 ml air panas, dididihhkan selama 5 menit, saring. Ambil 5 ml larutan, masukkan ke dalam tabung reaksi tambahkan beberapa tetes Natrium hidroksida 1 N, terbentuk warna merah menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
g. Identifikasi golongan minyak atsiri
34
3.3.5 Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15-20 menit, semua alat dan bahan sebelum disterilisasi dibungkus terlebih dahulu dengan kertas minyak. Untuk bahan yang terbuat dari karet seperti karet pipet tetes disterilisasi dengan cara direbus. Untuk larutan uji disterilkan dengan cara melakukan pengerjaannya di dalam laminar air flow yang sebelumnya telah disterilisasi dengan alkohol 70 %, kemudian disterilkan dengan lampu UV yang telah dinyalakan 15 menit sebelum digunakan.
3.3.6 Pembuatan Media Pertumbuhan a. Nutrient Agar
Pada pembiakan bakteri menggunakan media digunakan Nutrient agar (NA). Serbuk NA sebanyak 23 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
b. MHA (Mueller Hinton Agar)
Serbuk MHA sebanyak 38 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest, kemudian dipanaskan sampai mendidih sehingga semuanya larut, kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit.
c. Blood Agar Base (BAB)
3.3.7 Pembuatan stok bakteri
Bakteri diinokulasi pada medium Blood Agar Base untuk bakteri Streptococcus pneumoniae, sedangkan medium MHA untuk
Staphylococcus aureus , B. subtilis, E. coli, Pseudomonas aeruginosa,
Proteus mirabillis dengan cara menggoreskan bakteri menggunakan
jarum ose pada permukaan agar, kemudian semua biakan bakteri diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
3.3.8 Pembuatan Suspensi Bakteri
Biakan bakteri yang telah berumur 24 jam diambil beberapa ose kemudian di suspensikan kedalam larutan NaCl 0.9% dan di ukur kekeruhannya dengan menggunakan metode turbidimetri dengan standar 0,5 Mc Farland (diperkirakan 1,5 x 108 sel bakteri/ml).
3.3.9 Pembuatan Larutan Uji
Pada pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram, larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak metanol G.
verrucosa menggunakan metanol dengan konsentrasi ekstrak G.
verrucosa yang digunakan adalah 0,1 mg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, dan
36
3.3.10 Pengujian Aktivitas Antibakteri (Rhimou et al, 2010).
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol G. verrucosa dilakukan dengan metode difusi menggunakan kertas cakram. Kertas cakram yang digunakan memiliki diameter lingkaran 6 mm.
Media Blood Agar Base untuk bakteri S. pneumonia dan medium MHA untuk bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis yang masih berbentuk
cairan dimasukkan ke dalam cawan petri masing-masing sebanyak ±20ml dan dibiarkan memadat pada suhu kamar. Setelah agar memadat suspensi bakteri sebanyak 100 µl di sebar kepermukaan agar secara merata dengan menggunakan lidi kapas steril.
37
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1HASIL
4.1.1 Determinasi Sampel
Dari hasil identifikasi sampel yang dilakukan di LIPI Oceanografi diketahui bahwa sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah rumput laut Gracillaria verrucosa (Lampiran 1).
4.1.2 Penapisan Fitokimia
[image:51.595.116.511.167.722.2]Dari proses ekstraksi yang dilakukan didapatkan karakteristik ekstrak dan hasil penapisan fitokimia, diantaranya.
Tabel 1. Karakteristik ekstrak dan uji penapisan fitokimia
Karakteristik ekstrak Hasil Rendemen Susut Pengeringan Warna Bau Flavonoid Alkaloid Saponin Tanin
38
4.1.3 Pembuatan ekstrak
Hasil ekstraksi serbuk rumput laut (Gracilaria verrucosa) sebanyak 500 gram dengan pelarut metanol adalah sebanyak 28 gram ekstrak kental dengan rendemen ekstrak sebesar 3,6%.
4.1.4 Uji Aktivitas Antibakteri
[image:52.595.90.581.148.592.2]Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol G. verrucosa pada berbagai konsentrasi :
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antibakteri ektrak metanol G. verrucosa terhadap enam bakteri uji.
Konsentrasi Ekstrak
Diameter Zona Hambat ( mm ) Rata-rata
S. aureus B. subtilis S. pneumoniae E. coli P. aeruginosa P. mirabilis
100µg/ml - - - -
1000µg/ml - - - -
10000µg/ml - - - -
100000µg/ml - - - -
Kontrol (-) - - - -
Kontrol (+) 51 40 42 28 51 23
Kontrol (-) : metanol
Kontrol (+) : amoksisilin
hambat tidak ditemukan diamater hambat. Oleh karena itu, pengujian aktivitas antibakteri seperti kebocoran protein dan asam nukleat, kebocoran ion Ca2+ dan ion K+ serta analisis kerusakan sel tidak dilakukan.
4.2 PEMBAHASAN
Sampel uji yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari tambak di Desa Tenjo Ayu Kecamatan Tirtayasa Serang – Banten. Berdasarkan hasil determinasi yang dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi LIPI Jakarta, menunjukan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Gracilaria verrucosa dengan famili Gracilariaceae (lampiran 1).
Serbuk simplisia G. verrucosa selanjutnya diidentifikasi dengan cara penapisan fitokimia yang menunjukan bahwa pada sampel uji terdapat kandungan kimia dari golongan senyawa saponin, steroid dan triterpenoid (Tabel 1). Saponin adalah senyawa aktif yang kuat dan menimbulkan busa jika dikocok dalam air sehingga bersifat seperti sabun dan mempunyai kemampuan antibakterial (Zuhud,
et al., 2001). Saponin dapat meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri
sehingga dapat mengubah struktur dan fungsi membran, menyebabkan denaturasi protein membran sehingga membran sel akan rusak dan lisis (Siswandono, 1995).
40
kamar. Pelarut yang digunakan dalam proses maserasi ini adalah metanol. Pemilihan metanol sebagai pelarut dikarenakan metanol dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder pada sampel uji, baik senyawa yang bersifat polar maupun nonpolar sehingga dapat mengekstrak G. verrucosa secara optimal. Metanol dapat digunakan sebagai kontrol pelarut pada uji aktivitas antibakteri (Dash, et al., 2011).
Pengujian aktivitas antibakteri bertujuan untuk mengetahui sensitivitas bakteri terhadap sampel uji. Metode pengujian aktivitas antibakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah metode difusi cakram. Pada metode ini sensivitas bakteri terhadap sampel uji ditunjukan dengan terbentuknya zona bening disekitar kertas cakram yang menandakan daerah hambatan pertumbuhan bakteri.
Pada penelitian ini menggunakan 6 bakteri patogen yang berasal dari gram positif dan gram negatif. Bakteri patogen yang digunakan adalah Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae yang termasuk golongan
bakteri gram positif serta Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabillis yang termasuk golongan bakteri gram negatif.
Pada pengujian diameter zona hambat, bakteri diinokulasikan pada media MHB untuk bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, dan Proteus mirabillis, serta media agar darah untuk
sebesar 0.08 – 0.1 A (setara dengan larutan McFarland 0.5 = 1-2 x108 cfu/ml) (Schwable, et al., 2007).
Selanjutnya dibuat larutan uji dengan cara melarutkan ekstrak kental dengan metanol dan dibuat konsentrasi 100, 1000, 10.000, dan 100.000 µg/ml. Untuk kontrol negatif digunakan metanol. Sedangkan untuk kontrol positif digunakan amoksisilin.
Pemilihan amoksisilin sebagai kontrol positif karena amoksisilin merupakan antibiotik turunan penisilin yang mempunyai spektrum kerja luas, dan mekanisme kerjanya menghambat sintesis dinding sel bakteri (Setiabudy, 2007). Zona hambat yang ditunjukan oleh kontrol positif adalah sebesar 51 mm untuk
Staphylococcus aureus, 40 mm untuk Bacillus subtilis, 42 mm untuk
Streptococcus pneumoniae, 28 mm untuk Escherichia coli, 51 mm untuk
Pseudomonas aeruginosa, dan 23 mm untuk Proteus mirabillis.
Dari tabel hasil uji aktivitas antibakeri (tabel 2) pada penelitian ini dapat dilihat bahwa ekstrak metanol G. verrucosa tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap 3 bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri gram negatif (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis). Hal ini dapat dilihat dari tidak
42
Perbedaan hasil yang didapat pada penelitian ini dimungkinkan karena pada senyawa yang terdapat pada ekstrak metanol G. verrucosa yang memiliki aktifitas antibakteri sangat kecil jumlahnya. Sedangkan pada penelitian ini, sampel uji yang digunakan adalah crude ekstrak dari G. verrucosa yang artinya masih terdapat banyak sekali senyawa lain yang terkandung dalam sampel uji seperti metabolit primernya yaitu polisakarida sebesar 32.4% (Satari, 1997). Selain itu, dikarenakan perbedaan sumber ganggang merah yang digunakan menjadi penyebab tidak ditemukannya aktivitas antibakteri pada penelitian ini. Meskipun pada penapisan fitokimia yang dilakukan menunjukan terdapat senyawa saponin yang diduga dapat memberikan aktivitas antibakteri.
Melihat hasil uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram yang tidak menunjukan adanya hambatan terhadap 3 bakteri gram positif
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3
bakteri gram negatif (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabillis), maka penentuan nilai KHM dan KBM serta pengujian mekanisme
43 5.1KESIMPULAN
Ekstrak metanol Gracilaria verrucosa tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap 3 bakteri gram positif (Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Streptococcus pneumoniae) dan 3 bakteri gram negatif (Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabillis).
5.2 SARAN
Perlu adanya penelitian lebih lanjut tentang kandungan kimia pada
Gracilaria verrucosa yang terdapat di Indonesia sehingga dapat dicari
44
Daftar Pustaka
Anggadiredja, J. T., Zatnika, A., Purwoto, H. dan Istini, S. 2006. Rumput Laut. Jakarta : Penebar Swadaya
Aslan, M. 1998. Budidaya Rumput Laut . Kanisius. Yogyakarta.
Aydogmus, Zeynep. 2008. Studies on chemical constituents of Gracilaria verrucosa.
Natural Product Research. 22, (18):1589–1596.
Buchanan, R.E. and Gibbons, N.E. 1974.Bergey’s manual of determinative bacteriol
ogy(Eighth edition), The Williams and Wilkins Co., Baltimore, pp.747 ‐ 842.
Chia, M,. Lin., Preston, J.K., Weii, C.I., 2000. Antibacterial mechanism of alyl isothiocyanate. Journal of Food Protection.
Cox, S.D., Mann, C.M., Markham, J.L., Bell, H.C., Gustafson, J.E. 2000. The mode of antibacterial action the essential oil of melaluea alternifolia (tea tree oil). Journal of Application Microbiology.
Dash, BK., S Sultana, N Sultana. 2011. Antibacterial Activities of Methanol and Acetone Extracts of Fenugreek (Trigonella foenum) and Coriander
(Coriandrum sativum). Life Sciences and Medicine Research, Volume 2011:
LSMR-27
Depkes RI. 2000. Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan: Jakarta.
Doyle, P.J., & Patterson, G.W. 1972. Sterols of some Chesapeake Bay algae. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &
Molecular biology, 41: 355–358.
Findly, John A., Ashok D. Patil. 1986. Antibacterial constituents of the red alga cystoclonium purpureum. Phytochemistry 25(2). pp. 548-550.
Ganiswara. 1995. Farmakologi dan Terapi. Edisi 4. Jakarta: Universitas Indonesia Press
Hargono, Djoko. 1986. Sediaan Galenika. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta .
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneathm, P.H.A., Staley, J.T. and Williams, S.T. (1994) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edn. Baltimore, MD:
Williams and Williams.
Imbs , Andrey B., Anna V. Vologodskaya, Natalia V. Nevshupova, Svetlana V. Khotimchenko, Edouard A. Titlyanov. 2001. Response of prostaglandin content in the red alga Gracilaria verrucosa to season and solar irradiance.
Phytochemistry 58: 067–1072.
Jawetz, Ernest.1995. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Hal 140-143. Jakarta: EGC
Jawetz, Ernest.1995. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Hal 299-303. Jakarta: EGC
46
Kakita, H., Fukuoka, S., Obika, H., Li, Z.F., & Kamishima, H. 1997. Purification and properties of a high molecular weight hemagglutinin from the red alga,
Gracilaria verrucosa . Botanica Marina, 40:241–247.
Kakita, H., Fukuoka, S., Obika, H., & Kamishima, H. 1999. Isolation and characterisation of a fourth hemagglutinin from the red alga, Gracilaria verrucosa , from Japan. Journal of Applied Phycology, 11: 49–56.
Khotimchenko, S.V. 2005. Lipids from the Marine Alga Gracilaria verrucosa .
Chemistry of Natural Compounds, 41: 285–288.
Khotimchenko, S.V. 2006. Variations in lipid composition among different developmental stages of (Rhodophyta). Botanica Marina, 49 : 34–38.
Lydia, Ninan Lestario.2008.Antioxidant activity and total phenolic content of red seaweed ( Gracilaria verrucosa). J.Teknol. dan industri pangan , Vol.XIX No.2.
Melo, V.M.M, Cordeiro, R.A, Gomes, M.V, Carvalho, A.F.U. 2006. Effect of Proteins (Agglutinins) from the Red Seaweed Hypnea musciformis (Wulfen) Lamouroux on the Growth of Human Pathogen Yeasts. Brazilian archives of
biology and technology.6 : pp. 915-921
Miksusanti., Jennie, B. S. L., Panco, B. dan Trimulyadi, G., 2008, Kerusakan Dinding Sel Escherichia coli K1.1 oleh Minyak Atsiri Temu Kunci
(Kaempferia pandurata), Berita Biologi 9(1):1-8
Nadler , J. Victor .1979. Kainic Acid: Neurophysiological And Neurotoxic Actions.
Neushul , Michael, 1990. Antiviral carbohydrates from marine red algae.
Hydrobiologia. 204/205: 99-104.
Nevshupova, N.V. 1999. Prostaglandin composition of red alga Gracilaria verrucosa . Biologiya Morya, 25: 142–143.
Newman, David J , 2003. Natural Products as Sources of New Drugs over the
Period 1981-2002. J. Nat. Prod. 66:1022-1037
Nontji, Anugerah. 2002. Laut Nusantara. Penerbit Djambatan. Jakarta.
Noor, R.R. 2001. Scanning Electron Microscope. Laboraturium pemuliaan dan Genetika ternak. Fakultas Peternakan. IPB
Padmakumar K, Ayyakkannu K .1997. Seasonal variation of antibacterial and antifungal activities of the extracts of marine algae from Southern coast of India. Bot. Mar. 40: 507-515
Pelczer et al. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Jakarta: UI-Press.
Pelczer et al. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jilid 2. Jakarta: UI-Press.
Pratiwi, Silvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.
Ravikumar S, Anburajan L, Ramanathan G, Kaliaperumal N .2002. Screening of seaweed extracts against antibiotic resistant post operative infectious pathogens. Seaweed. Indian Journal of Marine Sciences. (24)1: 95-99.
48
Mediterranean Coast of Morocco. African Journal Of Biotechnology. 9(38): 6365-6372
Satari, Rachmaniar. 1997. Isolasi dan Identifikasi Polisakarida dari Rumput Laut. Rangkuman Hasil Penelitian Produk Alami Laut Indonesia LIPI Puslitbang Oseanologi.
Sasikumar, C., Rao, V.N.R., & Rengasamy, R. (1999). The effect of environmental factors on the qualitative and quantitative characteristics of agar from the marine red alga Gracilaria verrucosa (Gracilariales, Rhodophyta). Indian
Journal of Marine Sciences, 28: 270–273.
Schwable, Richard, et al,. 2007. Antimicrobial Suspectibility Testing Protocols. New York : CRC Press.
Setiabudy R. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Jakarta : Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI.
Sirait, M. et al.1979. Farmakofe Indonesia, Edisi III. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan: Jakarta.
Soegiarto, A., Sulistijo, W.S. Atmadja dan H. Mubarak. 1978. Rumput Laut (algae);
Manfaat, potensi dan usaha budidaya, SDE 46 LON-LIPI Jakarta, 61 pp.
Soesilo,S. Et al.1995. Farmakofe Indonesia, Edisi IV. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan: Jakarta.
Staf Pengajar FKUI. 1993. Mikrobiologi Kedokteran, Edisi revisi. Jakarta: Binarupa Aksara.
Suhardimansyah. 2004. Pengaruh Tanah Pirit Pada Berbagai Perlakuan Terhadap
Pertumbuhan Rumput Laut, Gracillaria sp. IPB
Tjay T. H. dan R. Kirana, 2002, Obat-Obat Penting, ed. 5, PT. Elex Media Komputindo, Jakarta.
WHO. 1999. Infectious Diseases are the Biggest Killer of the Young. diakses tanggal 25 Juli 2011. Dari http://www.who.int/infectious-disease-report/index-rpt99.htm
Winarno, F.G. 1996. Teknologi Pengolahan rumput laut. Pustaka Sinar Harapan. Jakarta.
Xu, N, Xiao Fan, Xiaojun Yan, Xiancui Li, Rongli Niu, C.K. Tsenga. 2003. Antibacterial bromophenols from the marine red alga Rhodomela confervoides. Phytochemistry 62 : 1221–1224.
Zuhud, M.A.E., Rahayu, W.P.,Wijaya, H.P., Sari, P.P. 2001. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Kedawung Terhadap Bakteri Patogen. Jurnal Teknol dan Indrustri
50
52
[image:66.595.69.496.132.557.2]Lampiran 2. Gambar Gracilaria verrucosa
Lampiran 3 . Hasil Penapisan fitokimia Gambar 3. Penapisan Fitokimia
Alkaloid Flavonoid
Saponin
54
Lampiran 4. Perhitungan 1. Perhitungan Rendemen
Ekstraksi G. verrucosa sebanyak 500 g dalam metanol didapatkan ekstrak yang dipekatkan hingga 18 g.
Rendemennya : 18 g x 100 % = 3.6 % 500 g
2. Susut Pengeringan
Dipanaskan 30 menit di oven ±150 oC Cawan Penguap + tutup = 25,940 g
Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,944 g Ekstrak 1,004 g
30 menit selanjutnya : Cawan penguap + tutu + ekstrak = 26,844 g 30 menit selanjutnya : Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,704 g
Didiamkan dalam eksikator 24 jam : Cawan penguap + tutup + ekstrak = 26,703 g Jadi, susut pengeringan ekstrak metanol ganggang merah Gracilaria verrucosa adalah = 26,944 g – 26,703 g
= 0,241 g 0,241 g x 100 % = 0,89% 26,944 g
3. Perhitungan Konsentrasi Uji Konsentrasi 100 mg/ml :
Berat ekstrak kental : 1 gram Volume metanol : 10 ml
Konsentrasi 10 mg/ml :
Volume metanol : 10 ml
Konsentrasi 1 mg/ml :
Konsentrasi 10 mg/ml : 1 ml
Volume metanol : ad 10 ml
Konsentrasi 0.1 mg/ml :
Konsentrasi 1 mg/ml : 1 ml
56
Lampiran 6. Hasil Uji Diameter Zona Hambat
[image:71.595.112.563.130.759.2]Gambar 4. Staphylococcus aureus
Gambar 5. Bacillus subtilis
58
[image:72.595.203.539.568.745.2]Gambar 7. Proteus mirabillis
Gambar 8. Escherichia coli
[image:72.595.96.312.571.743.2]Lampiran 7. Pembuatan ekstrak Gracilaria Verrucosa
Gracilaria verrucosa
Dicuci bersih, dikeringkan, dirajang
Ekstraksi dengan methanol (metode maserasi)
Dipekatkan dengan Vacuum Rotary Evaporator
Didapatkan ekstrak kental Gracilaria verrucosa
Dilarutkan dengan metanol
60
Lampiran 8. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri uji yang murni
Diukur kepadatannya dengan spektrofotometer =625 nm, A=0,08-0,1 (setara mc Farland 0,5 = 1-2 x 108 cfu/ml)
Vortex selama 5 menit
Lampiran 9. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol G. verrucosa Tabel 2. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol G. verrucosa
Konsentrasi Ekstrak
Diameter zona hambat (mm)
S. aureus B. subtilis S. pneumoniae E. coli P. aeruginosa P. mirabilis
100 µg/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
1000 µg/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
10000µg/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
100000µg/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Kontrol (-) Metanol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Kontrol (+) Amoxilin 25 g/cakram
