BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Bakteri adalah kelompok organisme mikroskopis yang pada umumnya bersel tunggal, dan tidak memiliki membran inti sel. Pada umumnya organisme ini memiliki dinding sel namun tidak berklorofil. Walaupun berukuran kecil bakteri berperan penting dalam kehidupan sehari-hari, beberapa kelompok bakteri dikenal bermanfaat untuk kehidupan, antara lain bakteri telah digunakan dalam sektor industri pangan. Namun ada juga bakteri yang merugikan, seperti bakteri yang membusukkan bahan-bahan makanan dan bahkan menyebabkan infeksi dan penyakit bagi manusia (Febriza dkk, 2021).
Berdasarkan perbedaan kandungan dan dinding sel, bakteri dapat digolongkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif dinding selnya tersusun atas PG (Peptidoglikan) terdapat senyawa yang disebut asam teikoat. Bakteri gram negatif mengandung PG (Peptidoglikan) dalam jumlah yang jauh lebih sedikit, akan tetapi dibagian luar PG terdapat membran luar yang tersusun atas lipoprotein dan fosfolipid, serta mengandung lipopolisakarida. Karena perbedaan komposisi dinding sel ini, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif memiliki ketahanan yang berbeda. Bakteri gram positif lebih rentan terhadap antibiotik penisilin, karena antibiotik ini mampu merusak PG. Karena jumlah PG lebih banyak, bakteri gram positif biasanya lebih rentan terhadap kerusakan mekanis (Rini & Rochmah, 2020).
Pewarnaan Gram digunakan untuk menentukan jenis bakteri gram positif dan bakteri Gram negatif. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol sehingga bebas dari lemak, difiksasi diatas api spirtus sampai kering, diberi satu tetes NaCl fisiologis. Bakteri dari media NA diambil dengan jarum ose, diletakkan pada tetesan NaCl fisiologis, dicampur hingga merata. Diteteskan 2-3 tetes larutan kristal violet, biarkan selama 30-60 detik, dibuang larutan kristal violet diteteskan larutan lugol satu tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Preparat dibilas dengan alkohol 95% sampai jernih, dicuci dengan air mengalir sampai bersih. Terakhir ditetesi dengan safranin dan dibiarkan selama 2 menit lalu dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Warna ungu untuk bakteri Gram positif dan warna merah untuk bakteri Gram negatif (Budiyanto, 2021).
1.2 Rumusan Masalah
Adapun Rumusan masalah pada praktikum Mikrobiologi Lingkungan modul Pewarnaan Gram antara lain:
1. Jelaskan tujuan dilakukan pewarnaan gram!
2. Bagaimana ciri-ciri dan perbedaan dari bakteri gram negatif dan bakteri gram positif?
1.3 Tujuan Pratikum
Adapun tujuan dilakukannya praktikum Mikrobiologi Lingkungan modul Pewarnaan Gram antara lain:
1. Untuk mempelajari cara pewarnaan bakteri.
2. Untuk mengamati sifat sel yang kontras dengan sekelilingnya.
3. Untuk mengamati sifat dan bentuk bakteri terhadap pewarnaan gram.
1.4 Manfaat Pratikum
Adapun manfaat dilakukannya praktikum Mikrobiologi Lingkungan modul Pewarnaan Gram antara lain:
1. Sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan nilai akhir mata kuliah Mikrobiologi Lingkungan.
2. Agar praktikan dapat meningkatkan keterampilan-keterampilan dasar dalam bereksperimen di laboratorium.
3. Kegiatan praktikum mendorong pemahaman materi pembelajaran.
1.5 Ruang Lingkup Pratikum
Adapun ruang lingkup praktikum Mikrobiologi Lingkungan modul Pewarnaan Gram antara lain:
1. Praktikum dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Gedung Teknik Lingkungan Universitas Sumatera Utara.
2. Mempelajari faktor-faktor yang memengaruhi hasil pewarnaan gram seperti waktu pewarnaan, konsentrasi pewarnaan, pH larutan, dan suhu.
Laboratorium Bioteknologi Lingkungan – Pewarnaan Gram I-2
BAB Ⅱ
TINJAUAN PUSTAKA 4.1 Definisi Pewarnaan
Pewarnaan Gram adalah salah satu cara untuk menggolongkan bakteri, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri gram negatif. Salah satu bakteri yang termasuk Gram positif dan patogen yaitu Staphylococcus aureus dan bakteri yang termasuk Gram negatif yang patogen yaitu bakteri Escherichia coli. Pewarnaan Gram juga disebut metode Gram, adalah metode pewarnaan yang digunakan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar (gram-positif dan gram-negatif). Nama dari metode tersebut berasal dari ilmuwan Denmark Hans Christian Gram, yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 (Septian dkk,2020).
4.2 Prinsip Dasar Pewarnaan
Prinsip dasar pewarnaan gram melibatkan kemampuan dinding sel bakteri untuk mempertahankan pewarna kristal violet selama perlakuan pelarut. Mikroorganisme gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang lebih tinggi, sedangkan organisme gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi. Awalnya, semua bakteri menyerap pewarna kristal violet; Namun, dengan penggunaan pelarut, lapisan lipid dari organisme gram negatif dilarutkan. Dengan larutnya lapisan lipid, gram negatif kehilangan pewarna utamanya.
Sebaliknya, pelarut mendehidrasi dinding sel gram positif dengan penutupan pori-pori yang mencegah difusi kompleks violet-iodin, sehingga bakteri tetap ternoda. Durasi dekolorisasi merupakan langkah penting dalam pewarnaan gram karena paparan yang terlalu lama terhadap zat dekolorisasi dapat menghilangkan semua noda dari kedua jenis bakteri. Langkah terakhir dalam pewarnaan gram adalah dengan menggunakan pewarnaan fuchsin dasar untuk memberikan warna merah jambu pada bakteri gram negatif yang terdekolorisasi untuk memudahkan identifikasi (Tripati dan Sapra, 2020).
4.3 Tujuan dan Fungsi Pewarnaan
Pada pewarnaan Gram terdapat 2 jenis bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif. Tujuan dari pewarnaan Gram ini yaitu untuk mempermudah melihat bakteri secara mikroskopik, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, melihat struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, dan menghasilkan sifat-sifat fisik serta kimia khas dari bakteri dengan zat warna (Bulele dkk, 2019).
Laboratorium Bioteknologi Lingkungan – Pewarnaan Gram I-1
4.4 Jenis-Jenis Teknik Pewarnaan 4.4.1 Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu pewarna dan ditunjukan terutama untuk mengetahui morfologi bakteri (Ashri dkk, 2020).
4.4.1.1 Pewarnaan Asam
Pewarnaan sederhana asam merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna untuk melihat morfologi dari suatu bakteri. Pewarnaan asam menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk selnya saja. Pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (Ashri, 2020).
4.4.1.2 Pewarnaan Basa
Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Pewarna basa (basic stains) dengan kromogen (zat induk pada zat celup atau senyawa yang menghasilkan zat berwarna) bermuatan positif dapat digunakan karena asam nukleat dan beberapa komponen dinding sel bakteri yang bermuatan negatif dapat terikat kuat dengan kromogen kationik yang positif. Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat (Ashri, 2020).
4.4.2 Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang dapat menghasilkan perbedaan di antara sel-sel mikroorganisme atau bagian-bagian sel mikroorganisme disebut teknik pewarnaan diferensial. Teknik ini menggunakan lebih dari satu larutan zat pewarna. Dalam proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan ungu kristal, larutan yodium, alkohol (sebagai bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai (Ashri, 2020).
4.4.2.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram termasuk dalam pewarnaan diferensial karena membutuhkan sedikitnya tiga pewarna yang diberikan secara bertahap pada
memberikan suatu kompleks warna yang tidak larut, kemudian diberikan senyawa pemucat (decolorizing agent) untuk menghilangkan warna primer. Pewarna tandingan yang memiliki pewarna yang kontras dari pewarna primer ditambahkan (Kurniaji, 2021).
4.4.2.1.1 Gram Positif
Bakteri gram positif pada umumnya lebih rentan terhadap antibiotik penisilin dan kurang rentan terhadap desintegrasi oleh perlakuan mekanis (sepeti diberi tekanan yang tinggi atau getaran ultrasonik) atau bila diberi enzim-enzim tertentu. Bakteri Gram positif memiliki dinding peptidoglikan lebih tebal dibandingkan dengan bakteri Gram negatif sehingga pada saat pewarnaan bakteri gram positif mampu mengikat zat warna kristal violet (Silviani, 2022).
4.4.2.1.2 Gram Negatif
Bakteri gram negatif merupakan bakteri yang kemampuan mengikat pewarna bakteri utama tidak kuat, sehingga dapat di lunturkan oleh peluntur, dan dapat diwarnai oleh pewarna bakteri lawan. Dinding sel bakteri Gram negatif mikroorganisme terdiri dari dua lapisan, lapisan peptidoglikan bagian dalam jauh lebih tipis daripada di dinding sel Gram positif. Di luar lapisan peptidoglikan adalah membran luar tambahan yang unik untuk dinding sel Gram negatif.
Membran luar mengandung protein, fosfolipid, dan lipopolisakarida (LPS) (Silviani, 2022).
4.5 Ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif
Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari lapisan peptidoglikan (murein) pelindung yang sangat tebal. Lapisan peptidoglikan merupakan komponen utama dinding sel Gram positif.
Komponen lain dari dinding sel Gram positif yang adalah asam teikoat dan asam lipoteikoat.
Kedua komponen ini unik untuk dinding sel gram positif. Polisakarida antigenic lainnya mungkin ada pada permukaan lapisan peptidoglikan. Dinding sel bakteri Gram negatif mikroorganisme terdiri dari dua lapisan, lapisan peptidoglikan bagian dalam jauh lebih tipis daripada di dinding sel Gram positif. Di luar lapisan peptidoglikan adalah membran luar tambahan yang unik untuk dinding sel Gram negatif. Membran luar mengandung protein, fosfolipid, dan lipopolisakarida (Nurhidayat, 2022).
4.6 Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan Mikroba a. Umur biakan.
Umur biakan dapat mempengaruhi pewarnaan. Contohnya bila anda akan melakukan pewarnaan spora maka umur biakan yang baik adalah 2 x 24 jam, karena pada umur itu biakan sudah membentuk spora dengan baik.
Laboratorium Bioteknologi Lingkungan – Pewarnaan Gram II-3
b. Kualitas zat warna reagen yang digunakan.
Bila zat warna yang digunakan kualitasnya tidak baik, maka warna yang tampakpun kurang jelas atau bahkan bila zat warna yang digunakan adalah zat warna yang dibuat sendiri yang penyaringannya kurang sempurna maka pewarnaannya akan kotor seperti ada becak-bercak zat warna, dsb.
c. Fiksasi.
Fiksasi yang tidak sempurna dapat menyebabkan kurang rekatnya bakteri pada kaca objek sehingga pada pencucian akan lepas dan ikut tercuci dan pada saat diamati tidak tampak hasil yang diinginkan.
d. Intensifikasi pewarnaan.
Zat warna dapat diintensifikasikan dengan beberapa cara misalnya dengan mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperature pewarnaan dan menambahkan suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara pewarnaan tanpa diberi mordan.
e. Penggunaan zat warna penutup.
Fungsi dari penggunaan zat warna punutup adalah memberikan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat warna punutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama.
f. Substrat.
Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel dapat dibedakan yaitu sel-sel basophil, sel-sel asidofil/ oksifil, dan sel-sel yang sudanofil (Arrachman, 2022).
