PETUNJUK PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN 2023

(1)

PETUNJUK PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN

Disusun Oleh :

Tim Dosen Praktikum Kultur Jaringan

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN”

YOGYAKARTA

(2)

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...1

DAFTAR ISI...2

JADWAL ACARA PRAKTIKUM...3

TATA TERTIB PRAKTIKUM...4

ACARA I PENGENALAN LABORATORIUM DAN STERILISASI...5

ACARA II PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI...7

ACARA III PEMBUATAN MEDIA MS DAN ALAMI...9

ACARA IV SUB KULTUR DAN MIKROSTEK...13

ACARA V AKLIMATISASI...15

ACARA VI BUDIDAYA EMBRIO...18

ACARA VII INDUKSI KALUS...20

ACARA VIII ORGANOGENESIS...22

(3)

JADWAL ACARA PRAKTIKUM

No Waktu Acara Penanggung jawab

1. Sabtu

11 Februari 2023

Pre Test (Semua acara) Asistensi

Ir. Rina Srilestari, MP Nova Wahyu Pratiwi, S. Si., M.Sc.

Asisten Mahasiswa 2. Rabu

15 Februari 2023

I. Pengenalan ruang Laboratorium II.Pengenalan Alat dan Sterilisasi III. Pembuatan media MS dan alami

Dr. Ir. Tuti Setyaningrum, MSi

Ir. Ari Wijayani, MP M. Fauzan Farid Al Hamdi, S.P., M.Si.

3 Rabu

22 Februari 2023

IV. Sub Kultur dan Mikrostek V. Aklimatisasi

VI. Budidaya Embrio

Endah Wahyurini, SP, MSi Dr.Ir. Tuti Setyaningrum, Msi Nova Wahyu Pratiwi, S. Si., M.Sc.

4. Rabu

1 Maret 2023

VII. Induksi Kalus

VIII.Organogenesis (akar dan tunas)

Ir. Ari Wijayani, MP Endah Wahyurini, SP, MP M. Fauzan Farid Al Hamdi, S.P., M.Si.

5. Rabu

25 Maret 2023 RESPONSI Ir. Rina Srilestari, MP

Asisten Mahasiswa

TATA TERTIB PRAKTIKUM

(4)

2. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium lengan panjang dan masker selama pelaksanaan praktikum

3. Praktikan yang tidak dapat hadir harus memberi keterangan resmi secara tertulis dan dilampiri bukti yang sah.

4. Praktikan wajib mengikuti semua acara dan melaksanakan tugas antara lain : pre-test, praktikum, pengamatan , pembuatan laporan dan responsi

5. Praktikan yang inhal acara praktikum wajib mengulang dan membawa bahan sendiri 6. Praktikan dilarang makan, mengobrol, menimbulkan kekotoran dalam ruangan

laboratorium

7. Setiap selesai praktikum praktikan wajib membersihkan meja, alat-alat dan lingkungan yang digunakan.

8. Praktikan yang memecahkan alat, wajib mengganti dengan alat yang baru

(5)

ACARA I

PENGENALAN LABORATORIUM DAN STERILISASI

Tujuan :

1. Mengenalkan bagian-bagian ruangan laboratorium dan fungsinya 2. Mengetahui cara sterilisasi ruangan, enkast dan Laminar Air Flow

Dasar Teori

Laboratorium Budidaya Jaringan

Dalam budidaya jaringan terdapat empat kegiatan pokok yang dilakukan yaitu 1).

Persiapan, 2). Inokulasi atau transfer, 3). Inkubasi dan 4). Aklimatisasi. Setiap kegiatan memerlukan ruangan tersendiri. Dengan demikian, laboratorium budidaya jaringan tumbuhan hendaknya memiliki ruangan-ruangan sebagai berikut :

1. Ruang persiapan untuk mempersiapkan media tanam, bahan dan mencuci peralatan.

2. Ruang inokulasi atau ruang transfer untuk sterilisasi bahan tanam, isolasi dan inokulasi atau transfer bahan tanam (eksplan).

3. Ruang inkubasi untuk meletakkan botol kultur setelah proses inokulasi selesai. Di dalam ruangan ini suhu, kelembaban maupun cahaya sebaiknya diatur sesuai dengan yang syarat pertumbuhan eksplan. Perkembangan eksplan maupun kondisi aseptiknya hendaknya diperhatikan secara rutin.

4. Ruang aklimatisasi untuk penyesuaian diri tanaman kecil (planlet) yang baru dikeluarkan dari botol kultur dari kondisi heterotrof ke autotrof. Suhu, kelembaban udara dan penyinaran di ruangan ini harus terjaga sesuai dengan kondisi yang diperlukan planlet.

Tidak semua laboratorium budidaya jaringan memiliki empat ruangan ini, apabila laboratorium tidak cukup besar, almari penabur dapat diletakkan di dalam ruangan inkubasi.

Sterilisasi Ruang Bahan dan alat :

- Sprayer, lap bersih, kain pel, alkohol 96%, spiritus Cara Kerja :

1. Bersihkan meja-meja dan dinding ruang inokulasi dan ruang inkubasi dengan lap basah

(6)

2. Meja-meja, dinding ruang inokulasi dan ruang inkubasi disemprot dengan alkohol 96%

atau spiritus

3. Ratakan dengan lap bersih (untuk yang permukaannya licin), biarkan mengering

4. Bersihkan lantai dengan kain pel yang telah dibasahi dengan air yang diberi lisol atau creolin, biarkan mengering. Ulangi sampai benar-benar bersih.

5. Untuk sterilisasi enkast (almari penabur) kerjakan No.2 dan 3 untuk almari penabur dan dibiarkan sampai mengering. Tablet formalin sebanyak 2-3 butir letakkan di atas petridish terbuka lalu dimasukkan di dalam almari penabur (entkas). Mohon diperhatikan untuk memakai masker pada waktu memasukkan tablet formalin ke enkast

6. Untuk sterilisasi LAF (Laminar Air Flow) caranya dengan menyalakan lampu UV di dalam Laminar Air Flow selama ± 1 jam sebelum digunakan.

(7)

ACARA II

PENGENALAN ALAT DAN STERILISASI

Tujuan:

1. Mengetahui kegunaan alat-alat dasar di laboratorium kultur jaringan 2. Mengetahui cara sterilisasi alat dengan menggunakan autoclave

Dasar Teori

Alat dan Perlengkapan Laboratorium

Kebutuhan laboratorium kultur jaringan tumbuhan akan peralatan dan bahan sangat fleksibel. Laboratorium yang lengkap diperlukan alat dan bahan yang lengkap pula, namun semuanya tergantung kepada jenis pekerjaan yang akan dikerjakan di dalam laboratorium tersebut. Perlengkapan dasar alat-alat dan bahan berikut perlu dimiliki oleh laboratorium kultur jaringan tumbuhan.

1. Refrigerator 2. Autoclave 3. Oven

4. Alat pemasak, dapat berupa hot plate atau kompor gas 5. Timbangan analitik dengan kepekaan sampai 0,1 mg 6. Timbangan analitik dengan kepekaan sampai 0,01 mg 7. Rak-rak inkubasi beserta lampu fluorescent-nya 8. Skalpel dan pinset

9. Alat-alat gelas seperti botol media, petridish, gelas piala, labu takar, pipet, dll 10. Pengukur pH

11. Bahan kimia untuk media tanam dan agar-agar 12. Akuades

13. Penutup botol media (alumunium foil, plastik wrap) 14. Sterilan seperti clorox, alkohol 70% dan 96%

15. Lampu spiritus

16. Shaker untuk media cair

17. Almari penabur seperti entkas dan Laminar Air Flow 18. Deterjen dan sunlight

(8)

Sterilisasi Alat

Bahan : Alumunium foil, kertas pembungkus

Alat : Autoclave, botol kultur, petridish, pinset, scalpel Langkah kerja :

1. Botol kultur ditutup dengan alumunium foil sampai rapat.

2. Petridish, pinset, scalpel dibungkus dengan kertas pembungkus 3. Autoclave diisi air hingga batas sang-sang

4. Botol, petridish, pinset, skalpel yang sudah dibungkus dimasukkan ke dalam autoclave 5. Autoclave ditutup dan dinyalakan

6. Ditunggu hingga mencapai suhu 121⁰C tekanan 15 psi dan waktu untuk alat 45 menit.

7. Setelah selesai, autoclave dimatikan dan ditunggu hingga tekanan mencapai 0 kemudian tutup baru dibuka.

8. Alat selanjutnya disimpan dalam oven pada suhu 50⁰C.

(9)

(10)

ACARA III

PEMBUATAN MEDIA MS (Murashige & Skoog) DAN ALAMI

Tujuan :

1. Mengetahui cara pembuatan medium Murashige-Skoog (MS) 2. Mengetahui cara pembuatan medium alami

Dasar Teori :

Pengetahuan tentang kebutuhan hara bagi sel dan jaringan sangat menentukan keberhasilan kultur jaringan. Kebutuhan hara tersebut di atas, tersedia dalam medium.

Medium pertumbuhan yang baik mengandung sumber energi, garam an organik, vitamin serta hormon pertumbuhan bagi sel tanaman. Bentuk medium kultur jaringan dapat berupa medium padat maupun cair, sedangkan jenis medium berupa medium buatan serta medium alami. Beberapa macam medium kultur jaringan adalah : MS (tanaman semusim), VW (anggrek), WPM (tanaman keras), Nitsch, White, N-6, Gamborg (B5) (tanaman paku- pakuan).

Komposisi medium Murashige & Skoog (MS) :

TABEL MEDIUM MURASHIGE & SKOOG (CARA PEMBUATAN LARUTAN STOK)

I HARA MAKRO

UNTUK 1 LITER MEDIUM

(mg/l)

KEPEKATAN mg/500 ml

(20x)

VOLUME STOK UNTUK 1

LITER MEDIUM NH4NO3

KNO3

MgSO4.7H2O KH2PO4

CaCl2.2H2O (dilarutkan tersendiri)

1.650 1.900 370 170 440

33.000 38.000 8.000 7.400 3.400

Ambil 50 ml stok

II BESI mg/200ml

(40x) Ambil 5 ml stok

Na2-EDTA FeSO4.7H2O

37,3 27,8

1.492 1.112

III HARA MIKRO mg/500 ml

(100 x)

Ambil 5 ml stok

MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O

H3BO3

22,3 8,6 6,2

2.230 860 620

(11)

KI

Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O

CoCl2.6H20

0,83 0,25 0,025 0,025

83 25 2.5 2.5

IV VITAMIN mg/200 ml (50

x)

Ambil 4 ml stok Glycine

Nicotinic acid Pyridoxine-HCl

Thiamine-HCl

2,0 0,5 0,5 0,1

100 25 25 5

Karena komponen penyusun medium kultur jaringan sangat banyak dan jumlahnya beragam maka untuk mempermudah teknik pengerjaan dan mendapatkan akurasi penimbangan bahan (terutama bagi bahan yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit) maka perlu dibuat larutan stok yang mempunyai konsentrasi pekat (misalnya 20 kali).

Pembuatan larutan

1. Buatlah larutan stok MS (makro, mikro, besi, vitamin) sesuai dengan tabel terlampir.

2. Buatlah larutan stok zat tumbuh dalam ppm (per sejuta) atau mg/l untuk IBA, NAA, KINETIN dan BAP.

3. Dalam membuat larutan stok, timbanglah masing-masing bahan, larutkan satu persatu dalam akuades

4. Setelah semua bahan terlarut, sesuaikan volumenya dengan volume yang dikehendaki.

5. Untuk zat pengatur tumbuh, gunakan ethanol/NaOH untuk auksin atau HCl untuk sitokinin sebagai pelarut, setelah benar-benar larut baru ditambah akuades.

Media alami

Media alami adalah media dengan bahan bahan dasar non pabrik, tidak diramu dari komposisi berbagai macam zat kimia namun dengan bahan dasar alamiah. Alasan penggunaan medium alami adalah :

1. Pemanfaatan bahan bahan alami yang ada disekitar kita 2. Kandungan bahan alami dapat memacu pertumbuhan kalus 3. Lebih murah

(12)

Macam media alami

Buah dan sayuran yang sering digunakan : kentang,ubi jalar oranye , pisang, kecambah kacang hijau, air kelapa hijau, tomat, jeruk, kapri dan akar bunga matahari

Alat : timbangan analitik, beker glass, gelas ukur, pinset, pipet, autoclave, botol kultur, panci, kompor, pengaduk, magnetic stirrer

Bahan: stok makronutrien, stok mikronutrien, stok vitamin, stok besi, stok mio inositol, sukrosa, stok zat pengatur tumbuh (NAA ; BA), vitamin B1 (thiamin), akuades dan agar-agar.

Langkah Kerja :

A. Pembuatan Media MS

1. Ambil stok makronutrien 50 ml dimasukkan ke dalam beker glass yang berisi akuades 500 ml

2. Ditambah stok mikronutrien 5 ml 3. Ditambah stok besi 5 ml

4. Ditambah stok vitamin 4 ml

5. Ditambah stok zat pengatur tumbuh sesuai dengan perlakuan 6. Ditambah 20 ml stok mio inositol

7. Ditambah sukrosa 30 g 8. Diukur pH antara 5,6 – 5,8

9. Tambahkan akuades sehingga menjadi 1 liter

10. Masukkan agar-agar dan dipanaskan sampai mendidih

11. Tuang ke dalam botol kultur, kemudian sterilisasi dengan autoclave selama 30 menit

B. Pembuatan Media Alami

 Jeruk manis ( 1 liter)

Jeruk manis diperas diambil airnya sebanyak 150 ml / L ,tambahkan sukrosa 30 g, tambahkan agar- agar 8 g dan kita tambahkan akuades sampai volumenya menjadi 1 liter kemudian dipanaskan sampai mendidih. Tuang ke dalam botol kultur, kemudian sterilisasi dengan autoclave selama 30 menit.

(13)

 Kentang (1 liter)

Kentang dikupas ditimbang sebanyak 150 g/L kemudian dipotong-potong sebesar dadu. Kentang selanjutnya direbus dengan aquades sebanyak 1 liter sampai volumenya menjadi 500 ml. Tambahkan sukrosa 30 g dan agar-agar 8 g kemudian tambahkan aquades sampai volume menjadi 1 liter. Kemudian dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk. Tuang ke dalam botol kultur, kemudian sterilisasi dengan autoclave selama 30 menit.

(14)

PEMBUATAN MEDIA

Kelas Kelompok Macam Media Jumlah

yang dibuat

Keterangan

A 1 T1 : MS + Thiamin 1 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol

2 T2 : MS + Thiamin 2 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol 3 T3 : MS + Thiamin 3 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol

4 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g 200 ml 15 botol

B 1 T1 : MS + Thiamin 1 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol

C 1 T1 : MS + Thiamin 1 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol

D 1 T1 : MS + Thiamin 1 ppm + BA 1 ppm 200 ml 20 botol

(15)

ACARA IV

SUB KULTUR DAN MIKROSTEK

Tujuan :

1. Mengetahui cara sub kultur/mikrostek

2. Mengetahui pengaruh konsentrasi thiamin terhadap pertumbuhan planlet vanili

Dasar teori :

Sub kultur : usaha untuk mengganti media tanam kultur jaringan dengan media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus/planlet dapat terpenuhi.

Sub kultur diperlukan dengan tujuan :

1. Nutrisi dalam media telah habis digunakan eksplan/planlet, hal ini menyebabkan adanya kekurangan nutrisi.

2. Terjadi kekeringan pada media, sehingga kadar nutrisi menjadi menurun.

3. Pertumbuhan kultur telah memenuhi botol media.

4. Bahan yang dikulturkan diperlukan untuk propagasi selanjutnya.

5. Terjadi pencoklatan (browning) pada media agar yang merupakan senyawa beracun bagi kultur yang tersebar ke seluruh media

6. Media menjadi cair karena terjadi penurunan pH

Sub kultur sebaiknya dilakukan 2 minggu sekali atau menyesuaikan kondisi media apakah masih bisa digunakan atau tidak untuk kelangsungan hidup tanaman. Media tanam bisa ditambahkan dengan vitamin yang berupa bahan organik kompleks yang dibutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit. Vitamin yang biasa digunakan adalah vitamin B1 (Thiamin) yang akan mempengaruhi pembelahan sel, pembesaran sel, differensiasi jaringan dan pembentukan organ tanaman pada pertumbuhan awal tanaman, sebagai koenzim dalam metabolisme karbohidrat.

Alat : Laminair Air Flow Cabinet/ entkas ; pinset ; pisau blade ; petridish ; lampu spiritus, alumunium foil steril,

Bahan: Media ; planlet vanili ; alkohol 70%

Langkah kerja :

(16)

2. Planlet diletakkan dalam petridish, kemudian dipotong sepanjang 1,5 cm.

3. Masukkan ke dalam botol media 1 botol 1 eksplan dengan posisi vertikal

4. Diberi label (ditulis tanggal penanaman, media tanam dan kelompok) kemudian diletakkan di ruang inkubasi

5. Pengamatan terakhir dilakukan tanggal 15 Maret 2023

Parameter pengamatan : 1. Persentase hidup (%) 2. Tinggi planlet (cm)

(17)

SUB KULTUR/MIKROSTEK

Kelas Kelompok Macam Media Eksplan Jumlah

A 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol B 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol C 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol D 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Vanili 5 botol

(18)

ACARA V AKLIMATISASI

Tujuan :

1. Mengetahui cara aklimatisasi planlet anggrek Dendrobium

2. Mengetahui pengaruh macam media tanam terhadap pertumbuhan aklimatisasi anggrek Dendrobium

Dasar teori :

Aklimatisasi adalah melatih tanaman yang sebelumnya ditumbuhkan di dalam botol kultur dengan suplai media yang lengkap untuk dapat hidup secara mandiri dan berfotosintesis pada kondisi eksternal. Aklimatisasi adalah peralihan dari kondisi heterotrof (terkendali) menjadi autotrof (tak terkendali).

Tujuan Aklimatisasi : memberi kesempatan pada planlet untuk melakukan pertumbuhan dan perkembangan jaringan di dalam lingkungan yang baru, agar nantinya dapat menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan yang terbuka di lapangan.

Tanaman baru yang dihasilkan dari budidaya jaringan secara anatomi mempunyai beberapa perbedaan jika dibandingkan dengan tanaman hasil perbanyakan secara konvensional. Perbedaan terjadi antara lain pada lapisan kutikulanya kurang berkembang, lignifikasi batang belum terjadi sehingga batang kelihatan transparan, perkembangan sel palisade yang kurang baik, jaringan berkas pengangkut belum berfungsi dengan baik dan kinerja stomata yang belum sempurna.

Dengan perbedaan tersebut apabila tanaman hasil budidaya jaringan langsung dipindahkan ke lapangan akan mengalami banyak kegagalan, untuk itu diperlukan suatu tahapan penyesuaian dari kondisi in vitro ke ex vitro. Tahapan-tahapan ini dikenal dengan istilah aklimatisasi. Tahapan tersebut biasanya meliputi usaha mengurangi secara bertahap kelembaban udara dengan harapan proses fotosintesis dan kerja stomata dapat bekerja normal.

Dalam praktikum ini akan dilakukan aklimatisasi pada planlet anggrek yang dari media agar-agar ke media pakis, moss dan arang kayu sehingga diharapkan akan dihasilkan tanaman baru dalam bentuk bibit siap tanam.

(19)

Planlet yang diaklimatisasi dikondisikan :

1. Pada media pengakaran ex vitro contohnya berupa pakis : moss (1:1) atau pakis : arang kayu (1:1).

2. Intensitas cahaya rendah dan meningkat secara bertahap

3. Kelembaban tempat aklimatisasi diatur tetap tinggi pada minggu pertama, menurun secara bertahap pada minggu berikutnya hingga tumbuh akar baru.

4. Suhu tempat aklimatisasi dijaga agar tidak melebihi 32˚C 5. Dilakukan penyungkupan untuk mengurangi penguapan

Alat : Pinset panjang atau kawat yang ujungnya dibengkokkan, baskom kecil, kuas kecil, kertas untuk meniriskan, pot plastik,plastik ukuran 1 kg untuk menyungkup dan

sedotan plastik untuk menyangga sungkup plastik

Bahan : Planlet anggrek siap diaklimatisasi, fungisida, media tanam (pakis, moss, arang kayu), pupuk daun dan vitamin B1 (thiamin)

Langkah kerja :

1. Botol yang berisi planlet diisi dengan air kira-kira 100 ml kemudian planlet dikeluarkan dari botol menggunakan pinset dengan hati-hati (akarnya ditarik terlebih dahulu) kemudian dimasukkan ke baskom yang berisi air bersih

2. Agar-agar pada akar planlet dibersihkan dengan menggunakan kuas kecil.

3. Planlet direndam dalam larutan fungisida selama 3-5 menit.

4. Planlet ditiriskan di atas kertas buram

5. Planlet ditanam dalam pot gelas yang telah diisi media tanam.

6. Diberi label (tulis tanggal penanaman dan kelompok)

7. Pot kemudian disungkup menggunakan plastik dan disangga dengan sedotan plastik kemudian diletakkan di tempat yang teduh, tidak terkena sinar matahari langsung.

8. Semprot tanaman dengan air setiap hari dengan cara sungkup dibuka

9. Disemprot dengan vitamin B1 2 ml/L seminggu sekali dan pupuk daun 2 ml/L pada umur 2 minggu setelah tanam.

10. Pengamatan terakhir dilakukan pada tanggal 15 Maret 2023 Parameter :

1. Persentase hidup

(20)

AKLIMATISASI

Kelas Kelompok Macam Media Planlet Jumlah

A 1 M1 : pakis Anggrek 5 pot

2 M2 : moss Anggrek 5 pot

3 M3 : arang kayu Anggrek 5 pot

4 M1 : pakis Anggrek 5 pot

B 1 M1 : pakis Anggrek 5 pot

C 1 M1 : pakis Anggrek 5 pot

D 1 M1 : pakis Anggrek 5 pot

(21)

ACARA VI BUDIDAYA EMBRIO

Tujuan :

1. Mengetahui cara penanaman embrio secara in vitro pada medium MS 2. Mengetahui pengaruh jenis media alami terhadap pertumbuhan embrio

Dasar Teori

Embrio merupakan bagian dari biji yang pada kondisi lingkungan yang memungkinkan akan tumbuh menjadi tanaman sempurna. Perubahan dari embrio yang berukuran relatif kecil menjadi tanaman terjadi karena adanya dukungan cadangan makanan yang terdapat dalam endosperm.Pada beberapa kasus, endosperm tidak berkembang atau berkembang dalam satuan waktu tertentu dan selanjutnya rusak. Dalam kondisi yang demikian, embrio yang terdapat dalam biji biasanya tidak akan mampu tumbuh apabila dikecambahkan.

Budidaya embrio merupakan tehnik dalam budidaya jaringan yang sangat penting. Pada budidaya ini, embrio dipisahkan dan selanjutnya ditanam pada media buatan sehingga embrio tersebut dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman sempurna.Karena pentingnya teknik budidaya embrio maka dalam praktikum ini maka akan dicoba memisahkan embrio dari kotiledon dan selanjutnya ditanam pada media buatan.

Alat : Laminair Air Flow Cabinet/ Entkas; pinset; pisau blade; petridish; lampu spiritus;

alumunium foil steril,

Bahan : Media alami , biji jagung, klorok, alkohol 70% dan 96 %, akuades steril

Penyiapan Bahan Tanam Langkah kerja :

1. Tongkol jagung yang masih muda biji-bijinya dipipil

2. Dimasukkan kedalam beker glass yang berisi air agar berada dalam kondisi lembab.

3. Di masukkan dalam LAF kemudian disterilisasi dengan klorok 10% selama 5 menit.

Cara membuat Clorox 10 % = 100 ml Clorox dimasukkan ke dalam bekerglass yang berisi 900 ml akuades

4. Dibilas akuades steril 3X masing masing 1 menit.

(22)

7. Untuk data saat tumbuh tunas dan akar diamati setiap hari 8. Pengamatan terakhir tanggal 8 Maret 2023

Parameter

1. Saat tumbuh tunas : diamati setiap hari sejak tabur sampai muncul kecambah yang pertama kali.

2. Saat tumbuh akar : diamati setiap hari sejak tabur sampai muncul akar yang pertama kali.

3. Persentase tumbuh (%) dengan menghitung : Jumlah eksplan yang hidup x 100%

Jumlah eksplan keseluruhan

4. Tinggi tanaman : diukur tinggi tanaman pada akhir pengamatan 5. Jumlah daun : dihitung pada akhir pengamatan

(23)

KULTUR EMBRIO

Kelas Kelompok Macam Media Eksplan Jumlah

A 1 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 2 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 3 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol 4 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 5 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 6 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol B 1 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 2 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 3 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol 4 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 5 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 6 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol C 1 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 2 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 3 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol 4 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 5 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 6 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol D 1 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 2 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 3 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol 4 A1 : Jeruk + Sukrosa 20 g Embrio jagung 5 botol 5 A2 : Jeruk + Sukrosa 30 g Embrio jagung 5 botol 6 A3 : Jeruk + Sukrosa 40 g Embrio jagung 5 botol

(24)

ACARA VII INDUKSI KALUS

Tujuan:

1. Mengetahui pengaruh berbagai konsentrasi auksin dan sitokinin terhadap induksi kalus pada wortel

2. Mengetahui cara sterilisasi eksplan secara fisik

Dasar Teori :

Kalus merupakan sekumpulan sel yang terorganisasi yang akan selalu tumbuh pada media yang sesuai. Kalus tanaman terjadi secara in vitro apabila bahan biakan ditanam pada media budidaya jaringan yang mengandung auksin dan sitokinin dalam perbandingan yang sama sehingga dapat memacu pembelahan sel.

Apabila kalus dihasilkan, selanjutnya kalus dapat ditumbuhkan terus menerus dalam media padat maupun cair. Pada suatu kondisi, kalus yang telah dihasilkan diharapkan mampu berkembang membentuk tanaman baru dari kalus tersebut.

Alat : Laminiar Air Flow / Entkas ; pinset ; pisau blade ; petridish ; lampu spiritus;

aluminium foil steril

Bahan : Media MS, umbi wortel, alkohol 70 % dan alkohol 96%

Langkah kerja :

1. Ambil umbi wortel yang sehat, cuci di bawah air mengalir kemudian dicuci dengan deterjen, bilas sampai sisa deterjen hilang.

2. Kupas dengan pisau yang bersih, cuci kembali.

3. Sterilkan secara fisik dengan cara :

- Umbi wortel di celupkan ke dalam box stainless yang berisi alkohol 96% kemudian bakar di atas lampu spiritus. Lakukan 3 kali.

4. Potong umbi wortel dengan ukuran 1 x 1 cm ( dengan ketebalan 1 cm). Pada saat memotong, kambium harus disertakan karena kalus akan tumbuh dari bagian kambium.

5. Masukkan pada botol media 1 eksplan lalu diberi label.

6. Pengamatan saat tumbuh kalus diamati setiap hari 7. Pengamatan terakhr pada tanggal 15 Maret 2023.

(25)

Parameter yang diamati :

1. Saat tumbuh kalus : diamati setiap hari sejak tabur sampai muncul titik putih yang pertama kali.

2. Persentase tumbuh kalus (%) dengan menghitung : Jumlah eksplan yang hidup x 100%

(26)

INDUKSI KALUS (STERILISASI FISIK)

Kelas Kelompok Macam Media Eksplan Jumlah

A 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol B 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol C 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol D 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml Daging wortel 5 botol

(27)

ACARA VIII ORGANOGENESIS

Tujuan :

Menginduksi akar dan tunas pada eksplan daun dengan berbagai konsentrasi auksin dan sitokinin

Dasar Teori

Organogenesis merupakan suatu proses apabila sel, jaringan maupun organ terinduksi membentuk tunas maupun akar baru. Proses ini dipengaruhi oleh keberadaan zat pengatur tumbuh auksin maupun sitokinin di dalam medium. Beberapa sitokinin tunggal dalam konsentrasi tinggi maupun bersama auksin mampu menyebabkan proses diferensiasi sehingga tunas terbentuk, sebaliknya auksin tunggal dalam konsentrasi tinggi maupun bersama dengan sitokinin mampu menghasilkan akar.

Alat : Laminiar Air Flow / Entkas ; pinset ; pisau blade ; petridish ; lampu spiritus;

aluminium foil steril

Bahan : Media MS, daun tembakau, fungisida, klorok, alkohol 70% dan alkohol 96%

Sterilisasi eksplan dengan metode sterilisasi khemis (daun)

1. Daun dicuci di bawah air mengalir kemudian direndam dengan deterjen

2. Daun direndam dalam larutan fungisida 10 menit, kemudian dicuci bersih masukkan ke dalam LAF.

3. Daun disterilkan dengan klorok 10% selama 5 menit dengan cara beakerglass di goyang pelan-pelan (mohon diperhatikan perubahan secara fisik dari eksplan daun, jika ada tanda- tanda terjadi klorosis segera diakhiri sterilisasinya)

4. Disterilkan dengan klorok 5% selama 2 menit.

5. Dicuci akuades steril dan ulang sebanyak 3x (masing-masing 1 menit).

6. Daun dipotong-potong ukuran 1x1 cm dan tulang daunnya dilukai (disayat)

7. Dimasukkan ke dalam botol media 1 botol 1 eksplan dengan posisi tulang daun menyentuh media

8. Diberi label (ditulis tanggal penanaman, perlakuan, dan kelompok)

(28)

Parameter yang diamati :

1. Saat tumbuh akar : diamati setiap hari sejak tabur sampai muncul titik putih yang pertama kali.

2. Saat tumbuh tunas : diamati setiap hari sejak tabur sampai muncul titik putih yang pertama kali.

3. Persentase hidup (%) dengan menghitung : PT = Jumlah eksplan yang hidup x 100%

(29)

ORGANOGENESIS (STERILISASI SECARA KIMIA)

Kelas Kelompok Macam Media Eksplan Jumlah

A 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml daun 5 botol

2 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml daun 5 botol 3 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml daun 5 botol 4 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml daun 5 botol 5 V2 : MS + NAA 3 ml + Kinetin 2 ml+ Thiamin 2 ml daun 5 botol 6 V3 : MS + NAA 2 ml + 2 ip 2 ml+ Thiamin 2 ml daun 5 botol

B 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml daun 5 botol

C 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml daun 5 botol

D 1 V1 : MS + NAA 2 ml + BA 3 ml + Thiamin 2 ml daun 5 botol