1 SINTESIS, UJI AKTIVITAS DAN STUDI MOLECULAR DOCKING
SENYAWA 4-(5-(4-HIDROKSI-3-METOKSIFENIL)-3- (4-HIDROKSIFENIL)-4,5-DIHIDRO-1H-PIRAZOL-1-IL)
BENZENSULFONAMIDA SEBAGAI INHIBITOR ENZIM TIROSINASE
Arinzha Tri Septia1, Adel Zamri2
1Mahasiswa Program S1 Kimia
2Dosen Bidang Kimia Organik Jurusan Kimia
1,2Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*arinzha.tri0082@student.unri.ac.id ABSTRACT
Hyperpigmentation is a skin problem caused by excessive melanin production by melanocytes. The aim of products containing tyrosinase enzyme inhibitor compound is to prevent and overcome skin hyperpigmentation. One of the compounds with tyrosinase inhibitory activity is pyrazoline which is a five-ring heterocyclic compound with two nitrogen atoms in its ring. The pyrazoline compound 4-(5-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3- (4-hydroxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazole-1-yl)benzensulfonamide was synthesized through a cyclization reaction between chalcone compounds and 4-hydrazinylbenzensulfonamide using reflux method. The structure of pyrazoline was confirmed by UV, FTIR, HRMS and 1H-NMR spectroscopy data analysis. The activity of synthesized pyrazoline as tyrosinase inhibitor was evaluated by in silico and in vitro assay.
Molecular docking simulation carried out on the tyrosinase crystal structure (PDB ID: 2Y9X) with kojic acid as positive control. Molecular docking simulation showed that the synthesized pyrazoline compound had bond free energy (∆Gbind) = -11.5867 kcal/mol while the free bond energy for kojic acid was -8.9122 kcal/mol. Furthermore, in vitro assay result showed that pyrazoline compound had good activity as an inhibitor of the tyrosinase enzyme with value of IC50 16.331 µg/mL.
Keyword: pyrazoline, tyrosinase, docking
ABSTRAK
Hiperpigmentasi merupakan masalah kulit yang disebabkan oleh produksi melanin oleh melanosit secara berlebih. Penggunaan produk dengan kandungan senyawa inhibitor enzim tirosinase menjadi upaya untuk mencegah dan mengatasi hiperpigmentasi kulit. Salah satu
2 senyawa dengan aktivitas penghambat enzim tirosinase adalah pirazolin yang merupakan senyawa heterosiklik lingkar lima dengan dua atom nitrogen pada cincinnya. Senyawa pirazolin 4-(5-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-3-(4-hidroksifenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-il) benzensulfonamida telah disintesis melalui reaksi siklisasi antara senyawa kalkon dengan 4-hidrazinilbenzensulfonamida menggunakan metode refluks. Struktur senyawa target hasil sintesis dikonfirmasi melalui karakterisasi spektroskopi UV, FTIR, HRMS dan 1H-NMR.
Aktivitas senyawa target hasil sintesis sebagai inhibitor enzim tirosinase dievaluasi secara in silico dan in vitro. Studi molecular docking dilakukan terhadap struktur kristal tirosinase (PDB ID:2Y9X) dengan asam kojat sebagai kontrol positif. Simulasi molecular docking menunjukkan bahwa senyawa pirazolin hasil sintesis memiliki energi bebas ikatan (∆Gbind) = -11,5867 kkal/mol sedangkan energi bebas ikatan untuk asam kojat yaitu -8,9122 kkal/mol. Hasil uji aktivitas senyawa target secara in vitro menunjukkan bahwa senyawa pirazolin tersebut memiliki aktivitas yang baik sebagai inhibitor enzim tirosinase dengan nilai IC50 16,331 µg/mL.
Kata kunci: pirazolin, tirosinase, docking
PENDAHULUAN
Produksi melanin secara abnormal memicu penumpukan sejumlah melanin pada bagian tubuh tertentu menyebabkan hiperpigmentasi yang dapat menjadi masalah bagi keindahan kulit. Secara keseluruhan proses pembentukan pigmen gelap atau melanin dinamakan melanogenesis dengan tahap pertama yaitu oksidasi tirosin menjadi dopaquinon yang dikatalisis oleh enzim tirosinase (Chang, 2009; Chang et al., 2005).
Hiperpigmentasi dapat berupa noda hitam, warna kulit tidak merata dan melasma (Putri et al., 2018). Salah satu produk kecantikan yang banyak dicari terutama di wilayah asia adalah krim pencerah karena sebagian besar masyarakat asia memiliki warna kulit kuning langsat hingga cokelat (Yanti et al., 2019).
Enzim tirosinase merupakan enzim yang mengkatalisis dua reaksi pada melanogenesis. Pertama, hidroksilasi L-tirosin menjadi 3,4-dihidroksifenilalanin atau L-DOPA dan oksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon. Dopakuinon atau O-kuinon yang reaktif dapat berpolimerisasi secara spontan membentuk melanin (Chang et al., 2005). Penggunaan hidrokuinon jangka panjang dapat menyebabkan dermatitis kontak, depigmentasi, iritasi kulit, hilangnya elastisitas kulit, katarak, pigmentasi kuku, gangguan penyembuhan luka, kelainan ginjal dan bahkan berefek karsinogenik (Adriani, 2018; Kanthraj, 2010).
Molecular docking memainkan peran penting dalam mendesain suatu obat.
Tujuan utama dari molecular docking adalah untuk mensimulasikan secara
3 komputasi proses identifikasi molekuler
untuk mendapatkan konformasi yang dioptimalkan sehingga energi bebas dari keseluruhan sistem diminimalkan (Chaudhary & Mishra, 2016). Metode ini menggambarkan interaksi antara ligan dengan molekul protein yang menjadi targetnya saat dilakukan pendekatan secara in vitro (Setiawan & Irawan, 2017).
Penelitian yang dilakukan oleh (Thach et al., 2020) menemukan bahwa senyawa pirazolin dengan substituen hidroksi pada cincin fenil memiliki aktivitas antijamur yang tinggi. Penelitian oleh (Qin et al., 2015) telah melaporkan senyawa pirazolin dengan substituen kloro, amida dan metoksi yang terikat pada cincin arilnya memiliki aktivitas penghambatan enzim tirosinase. Menurut (Jasril et al., 2019) toksisitas pirazolin dipengaruhi oleh cincin heterosiklik dan substituen yang terikat pada cincin fenil seperti gugus metoksi.
Berdasarkan uraian di atas, Peneliti tertarik melakukan sintesis, studi molecular docking dan uji aktivitas secara in vitro senyawa triarilpirazolin turunan dari vanilin, 4-hidroksiasetofenon dan 4-hirazinilbenzensulfonamida sebagai inhibitor enzim tirosinase.
METODE
a. Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (NEWTECH), satu set alat destilasi, satu set alat refluks, rotary evaporator,
lumpang, alu, pompa vakum (GAST), corong buchner, bejana KLT, pipet mikro, hotplate (BOECO Germany), alat penentu titik leleh Fisher John (SMP 11-Stuart®), pH meter, lampu UV (Camag® 254 dan 366 nm), spektrofotometer UV-Visible
(Genesys 10S UV-Vis
v4.0022L9N175013), HPLC (UFLC Prominance-Shimadzu LC Solution,
Detektor UV SPD 20AD),
spektrofotometer FTIR (FTIR Shimadzu IR Prestige-21), 1H-NMR (Agilent 500 MHz dengan sistem konsol DD2), spektrometer massa (Water LCT premier XE mode positif), spektrofotometer microplate reader, serta alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium Kimia FMIPA-UNRI.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah natrium nitrit (Merck), vanilin (Sigma Aldrich), sulfanilamida (Sigma Aldrich), 4-hidroksiasetofenon (Sigma Aldrich), kalium hidroksida (Merck), asam klorida (Merck), timah (II) klorida (AR Chemical), natrium sulfat anhidrat (Merck), natrium klorida (Merck), diklorometana, n-heksana, metanol, etil asetat, kloroform, akua DM, enzim tirosinase, asam kojat, disodium fosfat, monosodium fosfat, L-tirosin, dimetil sulfoksida, pelat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254 (Merck) dan indikator universal (Merck).
b. Molecular docking
Molecular docking dilakukan menggunakan seperangkat komputer Asus X441M CPU 1.10 GHz, dengan RAM
4 4 GB. Perangkat lunak yang digunakan
adalah perangkat lunak Molecular Operating Environment (MOE) 2019.0102 (Chemical Computing Group), Discovery Studio Visualizer v21.1.0.20298 (Dassault Systemes BIOVIA), dan ChemDraw Professional 12.0 (PerkinElmer). Struktur kristal protein tirosinase dari Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) dan ligan yang digunakan adalah struktur senyawa target pirazolin hasil sintesis dan 2-hidroksisiklohepta-2,4,6-trien-1-on atau tropolon sebagai ligan alami serta asam kojat sebagai kontrol positif.
c. Sintesis senyawa kalkon 3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1- (4-hidroksifenil)prop-2-en-1-on Campuran senyawa vanilin (0,76 g, 5 mmol) dan 4-hidroksiasetofenon (0,68 g, 5 mmol) diaduk di dalam lumpang hingga tercampur rata. Kalium hidroksida 0,561 g (10 mmol) ditambahkan ke dalam campuran kemudian digerus hingga reaksi selesai dengan kontrol reaksi setiap 5 menit menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Padatan yang terbentuk dilarutkan dengan 10 mL aqua DM lalu dinetralkan dengan menggunakan HCl 3N. Larutan diekstraksi dengan 5x5 mL etil asetat kemudian diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary evaporator. Padatan berwarna kuning pucat yang dihasilkan kemudian diuji kemurniannya menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan dikarakterisasi dengan menggunakan spektroskopi FTIR.
d. Sintesis senyawa 4-hidrazinil- benzensulfonamida
Campuran sulfanilamida (20 mmol) dan asam sulfat pekat 10 mL diaduk menggunakan magnetic stirrer dalam penangas es lalu ditambahkan tetes demi tetes larutan natrium nitrit 20 mmol hingga larutan menjadi tidak berwarna yang menandakan bahwa reasi diazotasi telah selesai. Senyawa azo yang terbentuk kemudian direduksi dengan menuangkan larutan timah (II) klorida 10 g dalam 10 mL asam sulfat pekat dengan tetap mempertahankan suhu 0ºC. Hal ini dikarenakan pada suhu lebih tinggi ion diazo akan lepas sebagai gas N2. Campuran diaduk menggunakan magnetic stirrer hingga terbentuk endapan berwarna putih kemudian disaring menggunakan vakum untuk mendapatkan senyawa 4-hidrazinilbenzensulfonamida. Senyawa diuji kemurniannya dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
e. Sintesis senyawa pirazolin 4-(5-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-3- (4-hidroksifenil)-4,5-dihidro-1H- pirazol-1-il)benzensulfonamida Senyawa alkon 3-(4-hidroksi-3- metoksifenil)-1-(4-hidroksifenil)propenon (0,405 g, 1,5 mmol) dan senyawa 4-hidrazinilbenzensulfonamida (0,841 g, 4,5 mmol) dilarutkan dalam etanol 5 mL lalu HCl 3N ditambahkan sebagai katalis kemudian campuran diaduk dengan hotplate stirring pada suhu 80oC selama 52 jam dengan kontrol reaksi setiap 10 jam. Hasil reaksi ditambahkan 20 gram
5 Gambar 1. Skema sintesis senyawa pirazolin 4-(5-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-3-(4- hidroksifenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-il)benzensulfonamida
es batu yang terbuat dari aqua DM kemudian didiamkan selama 24 jam di dalam lemari pendingin. Padatan yang terbentuk disaring menggunakan vakum.
Dilakukan kromatografi kolom untuk memurnikan senyawa pirazolin hasil sintesis. Senyawa yang diperoleh kemudian diuji kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), pegukuran titik leleh dan high performance liquid chromatography (HPLC).
f. Karakterisasi senyawa
Senyawa murni yang telah berhasil diisolasi dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UV, FTIR, HRMS dan
1H-NMR.
g. Uji aktivitas penghambatan enzim tirosinase
1. Pengujian kontrol blanko (B0)
Larutan dapar pospat sebanyak 70 µL dimasukkan ke dalam microplate 96 wells
dan ditambahkan 30 µL larutan enzim tirosinase 333 U/mL, kemudian diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 5 menit.
Selanjutnya ditambahkan larutan dapar pospat pH 6,5 sebanyak 110 µL dan diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 492 nm.
2. Pengujian blanko (B1)
Larutan dapar pospat sebanyak 70 µL dimasukkan ke dalam microplate 96 wells dan ditambahkan 30 µL larutan enzim tirosinase 333 U/mL, kemudian diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 5 menit.
Selanjutnya ditambahkan larutan substrat L-tirosin 2 mM sebanyak 110 µL dan diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 492 nm.
6 3. Pengujian control sampel (S0)
Larutan sampel (dalam dapar pospat) sebanyak 70 µL dimasukkan ke dalam microplate 96 wells dan ditambahkan 30 µL larutan enzim tirosinase 333 U/mL, kemudian diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan dapar pospat pH 6,5 sebanyak 110 µL dan diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 30 menit. Kemudian absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 492 nm.
4. Pengujian sampel (S1)
Larutan sampel sebanyak 70 µL dimasukkan ke dalam microplate 96 wells dan ditambahkan 30 µL larutan enzim tirosinase 333 U/mL, kemudian diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan substrat L-tirosin 2 mM sebanyak 110 µL dan diinkubasi gelap pada suhu 37oC selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer microplate reader pada panjang gelombang 492 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Sintesis senyawa kalkon 3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1- 4-hidroksifenil)prop-2-en-1-on
Sintesis senyawa kalkon menggunakan metode gerus. Uji kemurnian menggunakan KLT menunjukkan bahwa senyawa kalkon hasil sintesis sudah murni ditandai dengan adanya satu noda pada plat KLT yag diamati menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan
356 nm. Diperoleh senyawa kalkon dengan rendemen 51,45%. Uji titik leleh dilakukan menggunakan Fisher-Johns dan diperoleh titik leleh sebesar 62-64oC yang dapat dikatakan murni karena selisih suhu kristal mulai meleleh hingga meleleh seluruhnya sebesar <2oC.
b. Sintesis senyawa 4-hidrazinil benzensulfonamida
Senyawa 4-hidrazinilbenzensulfonamid berhasil disintesis menggunakan metode yang telah dilaporkan diatas. Sulfanilamida digunakan karena merupakan turunan anilin sehingga gugus amina dapat diubah menjadi hidrazin. Pembentukan hidrazin dari gugus amina melalui reaksi diazotasi dalam suasana asam pada suhu 0oC untuk mencegah dekomposisi. Selanjutnya senyawa intermediet azo direduksi oleh timah (II) klorida membentuk hidrazin. Uji kemurnian menggunakan KLT menunjukkan satu noda pada plat. Titik leleh senyawa hidrazin hasil sintesis diperoleh sebesar 159-160oC dengan rendemen 97,49%.
c. Sintesis senyawa pirazolin 4-(5-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-3- (4-hidroksifenil)-4,5-dihidro-1H- pirazol-1-il)benzensulfonamida Sintesis senyawa pirazolin dilakukan menggunakan metode refluks.
Mereaksikan senyawa kalkon hasil sintesis dengan senyawa 4-hidrazinilbenzen- sulfonamida dengan katalis HCl 3N selama 52 jam pada suhu 80oC. Pembentukan senyawa pirazolin melalui reaksi siklisasi.
Senyawa murni didapatkan melalui proses
7 kromatografi kolom dan didapatkan
senyawa murni berwarna merah bata dengan rendemen 25,37%. Kemurnian senyawa diuji mengunakan KLT yang memperlihatkan satu noda dengan pendar biru pada lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 356 nm.
Kromatogram HPLC pirazolin menunjukkan kemunculan satu puncak dominan pada waktu retensi 3,17 menit yang menunjukkan bahwa senyawa pirazolin bersifat polar dan sudah murni.
Hasil identifikasi spektroskopi UV senyawa pirazolin hasil sintesis menunjukkan puncak serapan pada panjang gelombang 351 nm yang menunjukkan adanya transisi elektron π → π* pada ikatan rangkap terkonjugasi cincin fenil tersubstitusi yang ada pada struktur senyawa pirazolin.
Spektrum FTIR menyajikan beberapa puncak khas yang menandakan adanya vibrasi ikatan spesifik pada senyawa pirazolin hasil sintesis. Vibrasi ikatan N-H terlihat pada bilangan gelombang 3286 cm-1. Puncak pada bilangan gelombang 3210 cm-1 mengindikasikan adanya vibrasi ikatan dari gugus O-H.
Selanjutnya, pada bilangan gelombang 1516 cm-1 merupakan vibrasi khas ikatan C=N, vibrasi ikatan S=O ditunjukkan pada bilangan gelombang 1423 cm-1 dan 1155 cm-1. Munculnya puncak pada bilangan gelombang 1601 cm-1, 1320 cm-1 dan 1238 cm-1 masing-masing mengindikasikan vibrasi ikatan C=C aromatik, C-N dan C-O.
Spektrum 1H-NMR menunjukkan adanya puncak proton Ha, Hb dan Hx secara berturut-turut muncul pada pergeseran kimia δ3,10, δ 3,85 dan δ 5,40 ppm dengan orientasi doublet of doublet. Nilai konstanta kopling dari proton visinal dan geminal.
Proton Ha muncul dengan nilai konstanta kopling geminal Jab = 17,4 Hz dan nilai konstanta kopling visinal Jax = 11,9 Hz.
Selanjutnya proton Hx dengan konstanta kopling visinalnya yaitu Jax = 5,4 Hz dan Jbx = 11,9 Hz. Sinyal proton pada C2’ dan C6’ muncul pada pergeseran kimia δ 7,09 ppm sedangkan untuk proton pada C3’ dan C5’ muncul pada pergeseran kimia δ 7,55 ppm. Kedua sinyal muncul dengan orientasi doublet dan nilai konstanta kopling berturut-turut sebesar J = 8,6 Hz dan J = 8,7 Hz. Pergeseran kimia untuk C2’’ ditunjukkan pada δ 6,86 ppm dengan orientasi doublet yang disebabkan karena proton pada C2’’ memiliki kopling meta (Jmeta = 2,1 Hz) dengan proton pada C6’’.
Proton pada C5’’ muncul pada pergeseran kimia δ 6,68 ppm dengan orientasi doublet sedangkan proton pada C6’’ muncul pada pergeseran kimia δ 6,56 ppm dengan orientasi doublet of doublet dikarenakan adanya pengaruh dari kopling orto dan kopling meta. Pada cincin fenil ketiga, proton pada C2’’’, C3’’’, C5’’’ dan C6’’’
muncul pada pergeseran kimia δ7,67–7,59 ppm dengan orientasi multiplet.
Puncak proton pada gugus NH2 muncul pada pergeseran δ 6,98 ppm sedangkan puncak yang mewakili proton pada gugus OH muncul di daerah downfield pada
8 pergeseran kimia δ 9,86 dan δ 10,56 ppm
dengan orientasi singlet.
Spektrum HRMS dari senyawa pirazolin hasil sintesis menunjukkan puncak ion molekul ditemukan pada (m/z) 440,1269 merupakan [M+H]+ yang artinya massa molekul relatif dari molekul ditambah dengan satu buah hidrogen. Sedangkan massa terhitung dari senyawa C22H22N3O5S adalah 440,1280. Spektrum menunjukan selisih sebesar 0,0011 dimana selisih massa ditemukan dan terhitung kecil dari 5 ppm mengindikasikan bahwa senyawa pirazolin hasil sintesis sudah murni.
d. Molecular docking
Metode molecular docking adalah metode yang digunakan untuk melihat interaksi antara protein dan ligan secara komputasi serta menjadi dasar dalam proses penemuan senyawa obat (Setiawan & Irawan, 2017). Studi ini dilakukan terhadap reseptor target berupa kristal protein dari Agaricus bisporus PDB ID: 2Y9X yang terikat dengan tropolon sebagai ligan alami.
Gambar 2. Overlay konformasi redocking ligan alami tropolon.
Validasi metode molecular docking dilaukan dengan melihat nilai RMSD (Root Mean Square Deviation). dan sesudah dilakukan docking untuk
mengetahui nilai penyimpangannya.
Metode docking dikatakan valid apabila nilai RMSD ≤ 2 Å, yang artinya metode docking dapat digunakan untuk docking senyawa uji.
Tropolon sebagai ligan alami memiliki interaksi metal-acceptor dengan Cu400 dan Cu401, interaksi π -alkil dengan residu asam amino Val283, π- π T shape dengan His85 dan π-anion dengan His263. Asam kojat sebagai kontrol positif memiliki interaksi metal-acceptor dengan Cu400 dan Cu401. Interaksi π- π T shape dengan Phe264 dan His259. Interaksi π-alkil dengan residu asam amino Val283.
Selanjutnya interaksi van der waals dengan residu asam amino Met280. Senyawa target pirazolin memiliki interaksi yang mirip dengan tropolon dan ligan alami yaitu interaksi metal-acceptor terhadap Cu400 dan Cu401, interaksi π-sulfur dengan His263 dan Met257, interaksi C dan H antara ligan dengan residu asam amino Gly249, His85, His259, His561 dan Glu322. Interaksi π –alkil dengan Val248 dan Val283. Kemudian ikatan van der waals dengan residu asam amino His244.
Hasil uji in silico menjunjukkan bahwa senyawa target pirazolin memiliki energi bebas ikatan (∆Gbind) = -11,5867 kkal/mol.
Terlihat dari asam kojat sebagai kontrol positifnya yang memiliki energi bebas ikatan (∆Gbind) = -8,9122 kkal/mol. Energi bebas ikatan (∆Gbind) merupakan hasil penjumlahan energi pada setiap interaksi yang terbentuk pada kompleks ligan- reseptor.
RMSD = 0,4560 Å
9
(a) (b)
(c)
Gambar 3. Hasil visualisasi reseptor dengan (a) tropolon; (b) asam kojat; (c) pirazolin
e. Uji in vitro penghambatan enzim tirosinase
Pendekatan secara in vitro terhadap senyawa pirazolin 4-(5-(4-hidroksi-3- metoksifenil)-3-(4-hidroksifenil)-4,5- dihidro-1H-pirazol-1-il)benzensulfonamid sebagai inhibitor enzim tirosinase menggunakan L-tirosin sebagai substrat dan asam kojat sebagai kontrol positif.
Prinsip dari pengujian ini adalah substrat
akan melewati reaksi enzimatik dan mengalami oksidasi membentuk dopakrom yang dapat mengabsorpsi sinar UV sehingga dapat dianalisis menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 492 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan nilai IC50 dan % inhibisi dari sampel.
Mekanisme kerja untuk menghambat aktivitas enzim tirosinase adalah mereduksi
10 bahan yang dapat menyebabkan oksidasi
dopakuinon.
Hasil analisis penghambatan aktivitas enzim tirosinase menunjukkan bahwa senyawa pirazolin hasil sintesis memiliki nilai IC50 sebesar 16,331 µg/mL sedangkan asam kojat sebagai kontrol positifnya memiliki nilai IC50 sebesar 21,2169 µg/mL.
Nilai IC50 menunjukkan konsentrasi yang mampu menghambat 50% aktivitas enzim tirosinase. Semakin kecil nilai IC50 maka senyawa yang diuji semakin berpotensi sebagai inhibitor enzim tirosinase. Suatu senyawa dikatakan memiliki aktivitas inhibitor aktif apabila nilai IC50<1000 µg/mL. Proses penghambatan aktivitas enzim tirosinase oleh senyawa pirazolin hasil sintesis bekerja secara reversibel kompetitif. Hal ini terjadi ketika inhibitor dan substrat memiliki kemiripan pada strukturnya sehingga substrat dan inhibitor dapat saling berkompetisi untuk dapat menempati sisi aktif enzim.
Pengujian senyawa pirazolin secara in vitro menunjukkan bahwa senyawa tersebut aktif sebagai inhibitor enzim tirosinase. Hal ini juga dipertegas dengan hasil uji secara in silico menggunakan metode molecular docking dengan nilai energi bebas ikatan yang lebih kecil daripada asam kojat sebagai kontrol positif.
KESIMPULAN
Senyawa pirazolin telah berhasil disintesis mengunakan metode refluks dengan rendemen sebesar 25,37%.
Senyawa pirazolin hasil sintesis memiliki
aktivitas yang baik sebagai inhibitor enzim tirosinase yang dikonfirmasi melalui pendekatan in silico dengan nilai energi bebas ikatan (∆Gbind) = -11,5867 kkal/mol lebih kecil daripada asam kojat sebagai kontrol positif dengan nilai energi bebas ikatan (∆Gbind) = -8,9122 kkal/mol. Hasil uji in vitro didapatkan nilai IC50 pirazolin hasil sintesis sebesar 16,331 µg/mL yang lebih baik daripada nilai IC50 asam kojat yaitu 21,2169 µg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Adriani, R. S. 2018. Analisa hidrokuinon dalam krim dokter secara spektrofotometri UV-Vis. Lantanida Journal. 6(2): 103–113.
Chang, T. 2009. An updated review of tyrosinase inhibitors. International Journal of Molecular Sciences.
10(6): 2440–2475.
Chang, T. S., Ding, H. Y., & Lin, H. C.
2005. Identifying 6,7,4′- trihydroxyisoflavone as a potent tyrosinase inhibitor. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry.
69(10): 1999–2001.
Chaudhary, K. K., & Mishra, N. 2016. A review on molecular docking : novel tool for drug discovery. JSM Chem.
4(3): 1–4.
Jasril, Teruna, H. Y., & Hendra, R. 2019.
Microwave assisted synthesis and evaluation of toxicity and antioxidant activity of pyrazoline derivatives.
Indonesian Journal of Chemistry.
19(3): 583–591.
Kanthraj, G. 2010. Skin-lightening agents:
New chemical and plant extracts.
Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology. 76(1):
11 3–6.
Putri, W. E., Kurniawati, Y., & Djauhari, T.
2018. Depigmenting agent melanotoksik. Medical and Health Science Journal. 2(2): 23–31.
Qin, H.-L., Shang, Z.-P., Jantan, I., Tan, O.
U., Hussain, A., Sher, M., & Bukhari, S. 2015. Molecular docking studies and biological evaluation of chalcone based pyrazolines as tyrosinase inhibitors and potential anticancer agents. Royal of Society Chemistry.
5(57): 46330–46338.
Setiawan, H., & Irawan, M. I. 2017. Kajian pendekatan penempatan ligan pada protein menggunakan algoritma genetika. Jurnal Sains dan Seni ITS.
6(2): 2–6.
Thach, T. D., Le, T. T. V., Nguyen, H. T.
A., Dang, C. H., Dang, V. S., &
Nguyen, T. D. 2020. Synthesis of sulfonamides bearing 1,3,5- triarylpyrazoline and 4- thiazolidinone moieties as novel antimicrobial agents. Journal of the Serbian Chemical Society. 85(2):
158–162.
Yanti, L. N., Purba, A. V., & Djamil, R.
2019. Pengembangan sediaan krim pencerah kulit dari kombinasi ekstrak rimpang temulawak (curcuma xanthorrhiza roxb) dan ekstrak biji kacang kedelai (glycine max (L.) Merill). Buletin Penelitian Kesehatan. 47(1): 55–66.
