1 SINTESIS DAN UJI TOKSISITAS HIDRAZON (E)-N’-((E)-3-(4-
METOKSIFENIL)-1-(NAFTALEN-1-IL)ALLILIDEN)-4- METILBENZENSULFONOHIDRAZID
Siti Rahmawati1*, Jasril2
1Mahasiswa Program S1 Kimia
2Dosen Bidang Kimia Organik Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*siti.rahmawati0174@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Hydrazone is an imine-derived compound that has various biological activities, such as anticancer, antimalarial, antimicrobial, and antioxidant,. Hydrazone compound (E)-N'- ((E)-3-(4-methoxyphenyl)-1-(naphthalen-1-il)alliliden)-4-methylbenzensulfonohidrazid (HDZ-1-NFT-4-TSH) has been successfully synthesized. Begins with the formation of chalcone (E)-3-(4-methoxyphenyl)-1-(naphtalene-1-yl)-prop-2-en-1-one by reacting 1-acetylnaphtalene and 4-methoxybenzaldhyde with KOH 3N as catalyst then produced yield 29.70%. The next step was reacted chalcone and p-toluensulfonyl hydrazine with HCl 3N as catalyst then produced yield 77.87%. The hydrazone compound was tested with TLC test, melting point and HPLC analysis. The compound was analyzed by UV-Vis and FTIR spectrophotometer. The toxicity of the compound was evaluated by BSLT (brine shrimp lethality test) method using Artemia salina Leach larvae. The test results showed that the hydrazone compound was non-toxic with LC50 value of 251,18 μg/mL.
Keywords: hydrazone, synthesis, toxicity
ABSTRAK
Hidrazon merupakan senyawa turunan imin yang memiliki aktivitas biologis yang beragam, diantaranya sebagai antikanker, antimalaria, antimikroba dan antioksidan.
Senyawa hidrazon (E)-N’-((E)-3-(4-metoksifenil)-1-(naftalen-1-il)alliliden)-4- metilbenzensulfonohidrazid (HDZ-1-NFT-4-TSH) berhasil disintesis. Diawali dengan pembentukan senyawa kalkon (E)-3-(4-metoksifenil)-1-(naftalen-1-il)-prop-2-en-1-on dengan mereaksikan 1-asetilnaftalen dan 4-metoksibenzaldehid dengan katalis KOH 3N menghasilkan rendemen sebesar 29,70%. Kalkon selanjutnya direaksikan dengan p-toluensulfonil hidrazin dengan katalis HCl 3N menghasilkan rendemen sebesar 77,87%. Senyawa hidrazon target dilakukan uji KLT, titik leleh dan analisis HPLC.
2 Senyawa telah dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR. Toksisitas senyawa diuji dengan metode BSLT (brine shrimp lethality test) menggunakan larva Artemia salina Leach. Hasil uji menunjukkan senyawa hidrazon tersebut bersifat tidak toksik dengan nilai LC50 sebesar 251,18 μg/mL.
Kata kunci: hidrazon, sintesis, toksisitas PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan yang tidak terkontrol dari sel-sel abnormal dan dapat menyerang jaringan disekitarnya.
(Matiadis & Sagnou, 2020). World Health Organization (2020) menyatakan bahwa kanker adalah penyakit penyebab utama kematian di seluruh dunia. Pada tahun 2018, 18,1 juta orang di dunia menderita kanker dan 9,6 juta diantaranya meninggal dunia.
Diperkirakan juga, angka tersebut akan mencapai dua kali lipat pada tahun 2040 mendatang. Peningkatan jumlah pengidap kanker ini menjadi alasan untuk menemukan obat-obatan baru yang dapat mengatasi hal tersebut.
Sintesis senyawa organik merupakan dasar perkembangan industri kimia dan farmasi dengan mereaksikan beberapa senyawa kimia dalam berbagai variasi metode untuk menghasilkan molekul target dengan aktivitas biologis yang beragam dan berguna sebagai obat.
Sintesis senyawa organik banyak dilakukan untuk mendapatkan senyawa kimia terutama yang keberadaannya terbatas bahkan tidak tersedia di alam.
Salah satu senyawa yang menarik perhatian para peneliti untuk disintesis adalah hidrazon. Senyawa turunan imin yaitu hidrazon dan turunannya
menunjukkan kelompok senyawa yang penting dengan aktivitas biologis yang beragam, sejumlah turunan hidrazon juga telah dikembangkan dengan sifat antikanker (Hussain & Akbar, 2017).
Hidrazon adalah produk substitusi bertipe imina stabil yang dapat disintesis dari hidrazin (NH2-NH2) ataupun turunan hidrazin (RNH-NH2) dengan senyawa karbonil, aldehida atau keton melalui reaksi kondensasi.
(Fessenden & Fessenden, 1997).
Hidrazon yang memiliki gugus azometin (-NHN=CH) merupakan kelompok senyawa yang penting untuk pengembangan obat baru. Oleh karena itu, banyak peneliti telah mensintesis senyawa ini dan mengevaluasi berbagai aktivitas biologis yang dimilikinya (Rollas & Küçükgüzel, 2007), seperti antioksidan (Afriana et al, 2020) antikanker, antiinflamasi, analgesik, antihipertensi, antimalaria, dan antidepresan (Hussain & Akbar, 2017) antibakteri (Aksöz et al., 2021) antitubekular (Shah et al., 2012) serta antivirus (HIV-1) (Tian et al., 2009).
Salah satu uji yang dapat dilakukan sebagai uji awal atau pra- screening senyawa sebagai antikanker adalah melalui uji toksisitas secara in vitro menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT). Uji toksisitas ini adalah salah satu metode yang
3 digunakan untuk mengetahui
kemampuan toksik terhadap suatu sel dari senyawa yang dihasilkan oleh ekstrak tanaman, pengujian ini dilakukan dengan menggunakan larva udang A. salina Leach sebagai hewan uji (Kanwar, 2007). Pada metode BSLT, suatu senyawa murni dikatakan memilki sifat toksik jika harga LC50 ≤ 200 μg/mL (Anderson et al., 1991).
Berdasarkan uraian diatas, penulis telah berhasil melakukan penelitian sintesis dan uji bioaktivitas dengan uji toksisitas secara in vitro menggunakan metode BSLT terhadap senyawa hidrazon (E)-N’-((E)-3-(4- metoksifenil)-1-(naftalen-1-il)alliliden)- 4-metilbenzensulfonohidrazid.
METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah hotplate, satu set alat destilasi, neraca analitik, monowave 50 (Anton Paar), tabung reaksi tertutup, oven, microwave, pompa vakum, corong buchner, bejana KLT, chamber, alat penentu titik leleh Fisher John, lampu UV (254 dan 366 nm), spektrofotometer UV-Visible (Genesys 10S UV-VIS v4.0022L9N175013), HPLC (UFLC Prominance-Shimadzu LC Solution, Detektor UV SPD 20AD), spektrofotometer FTIR (FTIR Shimadzu, IR Prestige-21), serta alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium Kimia FMIPA Universitas Riau.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1-asetil naftalen, 4-metoksi benzaldehid, kalium
hidroksida, p-toluensulfonil hidrazin, asam klorida, plat KLT GF254, aluminium foil, metanol, etilasetat, n-heksana dan akua DM.
b. Sintesis senyawa kalkon (E)-3-(4- metoksifenil)-1-(naftalen-1-il)- prop-2-en-1-on
Senyawa 1-asetilnaftalen 1,21 g (7 mmol), 4-metoksibenzaldehid 0,62 g (5 mmol) dan larutan KOH 3 N sebanyak 12 mL dilarutkan dalam pelarut etanol absolut 14 mL di dalam erlenmeyer. Campuran reaksi kemudian diiradiasi gelombang mikro dengan daya 180 Watt selama 4 menit (sampai selesai bereaksi). Reaksi dikontrol setiap 1 menit menggunakan KLT. Hasil reaksi didiamkan semalaman di dalam lemari pendingin. Campuran hasil reaksi didekantasi dan senyawa kalkon yang belum murni kemudian dimurnikan menggunakan kolom kromatografi.
Selanjutnya, senyawa yang diperoleh diuji kemurniannya dengan KLT dan analisis HPLC.
c. Sintesis senyawa hidrazon HDZ-1- NFT-4-TSH
Senyawa kalkon 0,28 g (1 mmol) dilarutkan dalam 5 mL metanol dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup yang dilengkapi dengan stirrer.
Setelah itu, ditambahkan senyawa p-toluensulfonil hidrazin 0,74 g (4 mmol); HCl 3 N sebanyak 3 mL dan dilakukan monowave selama 2 jam pada suhu 80°C. Reaksi dikontrol setiap 1 jam menggunakan KLT. Hasil reaksi ditambahkan akua DM dingin dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 24 jam. Padatan yang terbentuk disaring menggunakan corong Buchner
4 dan dicuci dengan akua DM, n-heksana
dan metanol dingin. Padatan pirazolin yang tidak murni dicuci dengan etanol panas. Kemurnian senyawa yang diperoleh diuji menggunakan KLT, pengukuran titik leleh menggunakan alat Fisher Jhon dan HPLC.
d. Karakterisasi senyawa
Senyawa murni yang diperoleh kemudian dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UV-Vis dan FTIR yang dilakukan di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Riau.
e. Uji toksisitas BSLT (brine shrimp lethality test)
1. Pembiakan larva A. salina Leach Telur udang (A. salina Leach) yang diambil dari koleksi Laboratorium Oseanografi Jurusan Ilmu Kelautan Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Riau ditetaskan kedalam wadah yang berisi air laut. Wadah tersebut kemudian dibagi menjadi dua bagian menggunakan pembatas yang sudah dilapisi aluminium foil. Wadah bagian pertama diberi cahaya lampu dan aerasi sedangkan bagian yang kedua tidak terkena cahaya lampu. Telur udang tersebut kemudian dibiakkan selama 48 jam agar menetas menjadi larva.
Larva udang yang baru menetas akan bergerak ke bagian bawah wadah yang terkena cahaya lampu. Larva inilah yang siap untuk digunakan sebagai hewan uji coba toksisitas.
2. Uji toksisitas
Masing-masing vial uji yang akan digunakan dikalibrasi sebanyak 5 mL lalu sampel hidrazon sebanyak 5 mg
dilarutkan dalam 5 mL etil asetat (larutan induk, konsentrasi 1000 µg/mL).
Larutan induk dilakukan proses pengenceran bertingkat untuk memperoleh variasi konsentrasi 100; 10;
1 dan 0,1 µg/mL. Larutan sampel dipipet kedalam masing-masing vial sebanyak 0,5 mL, lalu pelarut diuapkan hingga kering. Konsentrasi yang digunakan untuk uji senyawa hidrazon berturut- turut 1000; 100; 10; 1 dan 0,1 µg/mL.
Selanjutnya kedalam masing-masing vial ditambah 50 µg DMSO dan air laut secukupnya. Kemudian, masing-masing vial tersebut dimasukkan larva udang A.
salina Leach sebanyak 10 ekor dan ditambahkan air laut sampai tanda batas.
Vial lain yang telah dikalibrasi 5 mL disiapkan sebagai kontrol, vial itu diisi dengan 50 µg DMSO menggunakan pipet mikro dan ditambahkan sedikit air laut, kemudian ditambahkan larva udang A. salina Leach sebanyak 10 ekor dan ditambahkan air laut sampai batas kalibrasi. Selanjutnya, vial uji dan kontrol dibiarkan selama 24 jam lalu larva udang yang mati dihitung dan dicatat. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan dengan perlakuan yang sama untuk masing- masing konsentrasi. Tingkat toksisitas diukur dengan melihat persentase larva yang mati. Data yang diperoleh dianalisis untuk menentukan nilai LC50
dengan metode kurva menggunakan tabel analisis probit.
3. Analisis data toksisitas
Pengaruh penambahan senyawa hidrazon terhadap larva A. salina Leach diamati dengan melakukan perhitungan
5 statistik analisis probit. Perhitungan ini
dilakukan dengan membandingkan antara larva yang mati terhadap jumlah larva keseluruhan sehingga diperoleh persen kematian. Kemudian dilihat dari tabel nilai probit, dari tabel inilah akan diketahui nilai probit dan dimasukkan kedalam persamaan regresi, sehingga diperoleh nilai LC50.
Persamaan regresi:
y = ax + b LC50 = anti log x Keterangan :
x : Log konsentrasi y : Nilai probit
a : Slope (kemiringan) b: Intersept (garis potong)
Gambar 1. Skema sintesis senyawa kalkon dan hidrazon HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis senyawa hidrazon HDZ-1- NFT-4-TSH telah dilakukan pada penelitian ini melalui dua tahapan reaksi.
Reaksi diawali dengan mensintesis senyawa kalkon menggunakan iradiasi gelombang mikro dengan daya 180 Watt. Energi iradiasi yang dihasilkan langsung berinteraksi dengan senyawa yang bersifat polar. Sehingga terjadi penyerapan iradiasi gelombang mikro oleh senyawa-senyawa polar yang menyebabkan molekul-molekul berotasi dan saling bertumbukan dan dihasilkan energi kinetik yang kemudian diubah menjadi energi kalor secara merata.
Senyawa kalkon disintesis melalui reaksi Claisen-Schmidt atau kondensasi aldol. Uji kemurnian dilakukan menggunakan uji KLT dengan sistem 3 eluen berbeda dan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa senyawa kalkon hasil sintesis sudah murni, hal ini ditandai hanya ada satu noda pada plat KLT yang diamati menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 356 nm. Senyawa kalkon yang diperoleh adalah karamel berwarna kuning dengan berat 0,385 gram dan rendemen 29,70%. Angka rendemen yang kecil dari sintesis senyawa ini dikarenakan proses reaksi yang belum selesai. Kemurnian senyawa kalkon juga
6 dipertegas oleh kromatogram HPLC
dengan adanya satu puncak dominan pada panjang gelombang 254 nm dengan waktu retensi 10,817 menit dan pada panjang gelombang 365 nm dengan waktu retensi 10,825 menit.
Analisis spektroskopi FTIR senyawa kalkon hasil sintesis menunjukkan beberapa puncak pada bilangan gelombang yang sesuai dan vibrasi ikatan yang khas untuk gugus fungsi pada senyawa kalkon target.
Spektrum FTIR senyawa kalkon mengindikasikan adanya vibrasi ikatan C-H aromatik, gugus karbonil (C=O), C=C alkena dari sistem keton α, β tak jenuh, C=C aromatik dan C-O eter pada cincin p-metoksifenil. Serapan gugus fungsi tersebut berturut-turut muncul pada bilangan gelombang 2976 cm-1, 1688 cm-1, 1573 cm-1, 1564 cm-1 dan 1268 cm-1.
Sintesis senyawa hidrazon pada penelitian ini diperoleh dari reaksi antara kalkon (E)-3-(4-metoksifenil)-1- (naftalen-1-il)-prop-2-en-1-on dan p-toluensulfonil hidrazin menggunakan pelarut metanol dengan bantuan katalis HCl 3N. Reaksi senyawa dilakukan menggunakan bantuan monowave selama 2 jam menggunakan tabung reaksi tertutup yang dilengkapi stirrer (kecepatan putaran 1000 rpm), pemanasan dengan suhu suhu 80°C dan adanya tekanan.
Senyawa hidrazon HDZ-1-NFT-4- TSH disintesis melalui reaksi kondensasi. Reaksi dapat dianggap selesai bila pada hasil KLT menunjukkan noda senyawa yang tidak lagi sejajar dengan noda senyawa prekursor. Campuran reaksi kemudian
ditambahkan dengan aqua DM dingin untuk memaksimalkan terbentuknya endapan dan dimasukkan dalam lemari pendingin selama 24 jam. Senyawa hidrazon yang diperoleh berupa padatan kuning dengan berat 0,359 gram dan rendemen sebesar 77,87%.
Analisis kemurnian senyawa hidrazon ini dilakukan dengan menggunakan uji KLT, pengukuran titik leleh dan analisis HPLC. Hasil uji KLT senyawa ini menunjukkan satu noda pada plat dalam tiga eluen berbeda dengan nilai Rf yang berbeda juga. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa telah murni. Hasil pengukuran titik leleh yang diperoleh adalah 154-156oC, selisih titik leleh ≤ 2oC ketika padatan mulai meleleh hingga meleleh sempurna yang menunjukkan senyawa sudah murni.
Kemurnian senyawa juga dipertegas oleh kromatogram HPLC dengan adanya satu puncak dominan pada panjang gelombang 254 nm dengan waktu retensi 5,829 dan pada panjang gelombang 366 nm dengan waktu retensi 5,831 menit
Senyawa hidrazon yang telah disintesis kemudian dikarakterisasi menggunakan spektroskopi UV-Vis dan FTIR. Analisis spektrofotometer UV-Vis menunjukkan adanya serapan maksimum pada λ 221 dan 321 nm. Pada λmaks 221 nm merupakan panjang gelombang terjadinya transisi elektronik π→π* pada ikatan C=C alkena senyawa hidrazon.
Sedangkan untuk λmaks 321 nm merupakan transisi elektronik π→π*
pada sistem terkonjugasi antara cincin fenil yang tersubstitusi metil dan metoksi serta cincin naftalen. Serapan pada panjang gelombang cincin naftalen lebih
7 besar daripada ikatan C=C alkena. Hal
ini dikarenakan sistem terkonjugasi pada ikatan rangkap cincin naftalen lebih banyak yang menyebabkan energi yang diperlukan elektron untuk mengalami transisi akan semakin kecil sehingga absorbansi akan semakin mendekati panjang gelombang yang lebih besar.
Spektrum FTIR senyawa hidrazon hasil sintesis menunjukkan serapan yang sesuai dengan gugus fungsi pada senyawa hidrazon target. Berdasarkan data yang diperoleh, serapan pada bilangan gelombang 3177 cm-1 dan 2950 cm-1 yang masing-masing menunjukkan adanya vibrasi ikatan dari gugus N-H dan C-H aromatik. Vibrasi gugus metoksi (Ar-OCH3) muncul pada bilangan gelombang 2830 cm-1. Serapan pada bilangan gelombang 1605 cm-1 menunjukkan vibrasi ikatan C=N.
Serapan pada bilangan gelombang 1508 cm-1 menunjukkan vibrasi ikatan C=C aromatik. Serapan pada bilangan gelombang 1243 cm-1, serta 1348 dan 1168 cm-1, masing-masing menunjukkan vibrasi ikatan C-O, dan ikatan S=O.
Perbedaan besarnya bilangan gelombang suatu gugus berbanding lurus dengan energi yang dipengaruhi oleh jenis dan ukuran atom serta kekuatan ikatan gugus tersebut. Berdasarkan data yang diperoleh, hasil sintesis menunjukkan serapan yang sesuai dengan gugus fungsi dan ikatan pada senyawa target.
Senyawa hidrazon hasil sintesis dilakukan uji toksisitas sebagai uji awal atau pra-screening senyawa sebagai antikanker. Uji toksisitas menggunakan metode BSLT dipilih karena pengerjaannya yang cepat, mudah, dan menggunakan sampel uji dalam jumlah
kecil. Uji toksisitas pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan variasi konsentrasi yang berbeda yaitu 1000, 100, 10, 1, 0,1 ppm dan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali pada setiap konsentrasi. Toksisitas dari suatu senyawa ditentukan berdasarkan nilai LC50 yang diperoleh dari persentasi kematian hewan uji yang menunjukkan konsentrasi dimana 50% dari hewan uji tersebut mengalami kematian.
Pada metode BSLT, suatu senyawa murni dikatakan bersifat toksik jika memiliki harga LC50 ≤ 200 μg/mL (Anderson et al., 1991). Dari hasil pengujian BSLT yang telah dilakukan menunjukkan bahwa senyawa hidrazon HDZ-1-NFT-4-TSH bersifat tidak toksik karena nilai LC50 = 251,18 μg/mL.
KESIMPULAN
Senyawa kalkon (E)-3-(4- metoksifenil)-1-(naftalen-1-il)-prop-2- en-1-on berhasil disintesis menggunakan metode iradiasi gelombang mikro dengan rendemen 29,70%. Senyawa hidrazon HDZ-1-NFT-4-TSH juga telah berhasil disintesis menggunkan bantuan monowave dengan rendemen 77,87%.
Hasil karakterisasi spektroskopi UV-Vis dan FTIR menunjukkan bahwa struktur senyawa hidrazon yang disintesis telah sesuai dengan senyawa yang diharapkan.
Hasil uji menunjukkan senyawa hidrazon tersebut bersifat tidak toksik dengan LC50 = 251,18 μg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Afriana, N., Frimayanti, N., Zamri, A dan Jasril. 2020. Microwave- assisted synthesis, antioxidant
8 and toxicological evaluation of a
hydrazone,1-(4-chlorobenzylide ne)-2-phenylhydrazine. Journal of Physics : Conference Series.
1655.
Aksöz, B. E., Onurdağ. F. K., Aksöz, E., dan Özgacar, S. Ö. 2021.
Biological activity screening of some hydrazone and chalcone derivates. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi. 78(2):
159-166.
Anderson, J.E., Goetz, C.M. dan Laughlin, L.C. 1991. A blind comparison of simple bench-top bioassays and human tumour cell cytotoxicities as antitumor prescreens. Pytochemical Analysis. 2: 107-111.
Fessenden, R. J., dan J. S, Fessenden.
1997. Dasar-Dasar Kimia Organik. Binarupa Aksara, Jakarta.
Hussain, I., Akbar, A. 2017. Exploring the pharmacoligical activities of hydrazone derivatives : a review.
Journal of Phytochemistry &
Biochemisttry. 1 : 1-5.
Kanwar, A. S. 2007. Brine shrimp (A.
salina) a marine animal for simple and rapid biological assays. Chinese Clinical Medicine. 2(4): 35-42.
Matiadis, D dan Sagnou, M. 2020.
Pyrazoline hybrids as promising anticancer agents: an up-to-date overview. International Journal of Molecular Science. 21(5507).
Rollas, S., dan Küçükgüzel, Ş. G. 2007.
Biological activities of hydrazone derivates. Molecules. 12: 1910- 1939.
Shah, P. J., Patel, B. P., dan Patel, H. S.
2012. Synthesis, characterization and antibacterial activity of novel pyrazolone derivatives. Journal
of the University of Chemical Technology and Metallurgy.
47(3): 257–262.
Tian, B., He, M., Tang, S., Hewlett, I., Tan, Z., Li, J., Jin, Y., dan Yang, M. 2009. Synthesis and antiviral activities of novel acylhydrazone derivatives targeting HIV-1 capsid protein. Bioorg Med Chem Lett. 19(8).
World Health Organization (WHO).
2020. WHO report on cancer : setting priorities, investing wisely and providing care for all.
http://www.who.int/
publications/i/item/who-report- on-cancer-seting-priorities- investing-wisely-and-providing- care-for-all/. Diakses pada : 24 juli 2022.
