SINTESIS ONE-POT DAN UJI TOKSISITAS SENYAWA 3-(4-KLOROFENIL)-5-(2-METOKSIFENIL)-1-FENIL-4,5-
DIHIDRO-PIRAZOL
Syarifah Siti Sarah 1, Adel Zamri 2
1Mahasiswa Program S1 Kimia FMIPA Universitas Riau
2Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Riau
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
Syarifah.siti@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Pyrazoline is five ring heterocyclic compounds with two adjacent nitrogen atoms which is known to have diverse biological activities such as antitoxicity, anticancer, antioxidant, antimalarial, antibacterial and antituberculosis. Pyrazoline analogue 3-(4- chlorophenyl)-5-(2-methoxyphenyl)-1-phenyl-4,5-dihydro-pyrazole (PF-4Cl-2OMe) was synthesized by microwave irradiation method using one-pot reaction involving condensation and cyclization reaction of 2-methoxybenzaldehyde, 4-chloroacetophenon and phenylhydrazine. Purity of the PF-4Cl-2OMe compound was checked on TLC test, determination of melting point and HPLC analysis. Pyrazoline compound have been characterized using UV, FTIR, and NMR spectrometers. The yield obtained from the synthesis of PF-4Cl-2OMe compound was 44.85%.The toxicity of pyrazoline were evaluated by Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Pyrazoline PF-4Cl-2OMe compound showed non-toxic activity with LC50 = 572.79 µg/mL.
Keywords : Brine Shrimp Lethality Test, microwave, pyrazoline, toxicity ABSTRAK
Pirazolin merupakan salah satu senyawa heterosiklik lingkar lima yang terdiri dari dua atom nitrogen dengan posisi yang saling berdekatan. Senyawa pirazolin memiliki berbagai macam bioaktivitas seperti antitoksisitas, antikanker, antioksidan, antimalaria, antibakteri dan antituberkulosis. Analog pirazolin 3-(4-Klorofenil)-5-(2-Metoksifenil)- 1-Fenil-4,5-Dihidro-Pirazol (PF-4Cl-2OMe) disintesis dengan metode iradiasi gelombang mikro menggunakan reaksi one-pot yang melibatkan reaksi kondensasi dan siklisasi antara 2-metoksibenzaldehid, 4-kloroasetofenon dan fenilhidrazin. Kemurnian senyawa PF-4Cl-2OMe diketahui melalui uji KLT, penentuan titik leleh dan analisis HPLC. Karakterisasi senyawa PF-4Cl-2OMe menggunakan spektrometer UV, FTIR, NMR, dan HRMS. Rendemen yang didapatkan dari hasil sintesis senyawa PF-4Cl- 2OMe ialah sebesar 44,85%. Pengujian aktivitas biologis senyawa PF-4Cl-2OMe dilakukan dengan uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Hasil uji toksisitas menunjukkan senyawa PF-4Cl-2OMe hasil sintesis tidak toksik dengan nilai LC50 = 572.79 µg/mL.
Kata kunci : Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), gelombang mikro, pirazolin, toksisitas.
1
PENDAHULUAN
Pirazolin berasal dari hasil reduksi senyawa pirazol (Sumardjo, 2009) yaitu senyawa heterosiklik lingkar lima dengan tiga atom karbon dan dua atom nitrogen yang posisinya saling berdekatan (Rahman & Siddiqui, 2010).
Senyawa pirazolin kaya akan bioaktivitas, seperti sebagai antimalaria dan antitumor (Insuasty et al., 2013), antiinflamasi dan analgesik (Jadhav et al., 2013), antitoksik (Ethiraj et al., 2012), antioksidan (Khalil et al., 2012), antibakteri (Gupta et al., 2010), serta antituberkulosis (Ahmad et al., 2016).
Namun, ketersediaan senyawa pirazolin di alam sangat terbatas dan sulit didapatkan Pirazolin juga sulit diperoleh melalui proses isolasi bahan alam karena menggunakan tahapan kerja yang rumit dengan biaya yang mahal dan butuh waktu yang lama serta hasil yang diperoleh tidak bervariasi, sehingga dibutuhkan cara lain untuk mendapatkan senyawa pirazolin dengan stuktrur yang bervariasi, yaitu menggunakan cara sintesis sebagai salah satu cara alternatif untuk mengatasi masalah tersebut.
Pada penelitian ini, senyawa pirazolin disintesis melalui reaksi one- pot antara 2-metoksibenzaldehid, 4- kloroasetofenon dan fenilhidrazin menggunakan metode iradiasi gelombang mikro. Reaksi one-pot adalah reaksi tiga komponen atau lebih dalam satu wadah. Reaksi one-pot dipilih karena memiliki beberapa kelebihan yaitu waktu reaksi yang relatif cepat dan dapat mengurangi penggunaan limbah kimia (Hayashi, 2016). Metode iradiasi gelombang mikro juga memiliki beberapa kelebihan seperti, penggunaan alat yang lebih sederhana dan praktis, laju reaksi cepat, serta rendemen yang
dihasilkan banyak (Azarifar &
Ghasemnejad, 2003). Senyawa pirazolin yang dihasilkan, diuji toksisitasnya dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), untuk mengetahui efek racun dari senyawa pirazolin terhadap suatu organisme. Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk senyawa yang diduga memiliki aktivitas sebagai antikanker.
METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah microwave Samsung ME109F, alat penentu titik leleh Fisher Johns (SMP 11-Stuart), lampu UV (Camag 254 dan 366 nm), spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S UV-VIS v4.002 2L9N175013), IR (FTIR Shimadzu, IR Prestige-21), HPLC (Shimadzu LC solution), spektrometer NMR (Agilent 500 MHz) dan spektrometer massa (Water LCT premier XE mode positif)
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah 2- metoksibenzaldehid (Sigma Aldrich), 4- kloroasetofenon (Merck), natrium hidroksida (NaOH) (Merck), fenilhidrazin (Merck), etanol absolut (Merck), dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck), pelat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) GF254 (Merck), diklorometan (DCM), metanol, n-heksana, etilasetat, kloroform, dan akua DM.
b. Sintesis senyawa pirazolin (PF-4CL-2OMe)
Senyawa 2-metoksibenzaldehid (0,4084 g; 3 mmol), 4-kloroasetofenon (0,4634 g; 3 mmol), fenilhidrazin (0,6488 g; 6 mmol) dan larutan NaOH
2
(10 mL) dilarutkan dengan pelarut etanol absolut (30 mL) didalam Erlenmeyer.
Campuran senyawa diiradiasi gelombang mikro dengan daya 180 W selama 2 menit. Kontrol reaksi dilakukan setiap 30 detik menggunakan KLT. Campuran reaksi yang diperoleh kemudian didiamkan selama 24 jam di dalam lemari pendingin untuk memaksimalkan terbentuknya endapan. Endapan yang terbentuk disaring menggunakan corong buchner, dan dicuci dengan akua DM, n- heksana dan metanol dingin, lalu dikeringkan pada suhu ruang. Padatan pirazolin yang tidak murni direkristalisasi dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Selanjutnya padatan yang diperoleh diuji kemurniannya melalui uji KLT, pengukuran titik leleh dan analisis HPLC.
c. Karakterisasi Senyawa
Senyawa murni yang diperoleh dikarakterisasi melalui analisis spektroskopi UV, FTIR, NMR dan HRMS. Analisis UV dan FTIR dilakukan di Jurusan Kimia FMIPA UR, Analisis spektroskopi NMR dilakukan di Institut Teknologi Bandung dan analisis spektroskopi HRMS dilakukan di Universitas Padjajaran..
d. Uji toksisitas
Sampel PF-4Cl-2OMe sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 5 mL etilasetat (larutan induk, konsentrasi 1000 µg/mL).
Konsentrasi sampel yang diuji yaitu 1000 µg/mL, 100 µg/mL dan 10 µg/mL yang masing-masing dibuat dengan cara pengenceran bertingkat. Vial yang sudah dikalibrasi 5 mL disiapkan untuk masing-masing konsentrasi. Sampel dipipet ke dalam masing-masing vial
sebanyak 0,5 mL, lalu pelarut diuapkan hingga mengering. Selanjutnya, ke dalam masing-masing vial ditambahkan 50 µL DMSO dan sedikit air laut. Larva udang Artemia salina Leach sebanyak 10 ekor dan air laut ditambahkan kedalam vial sampai batas kalibrasi. Setelah 24 jam, larva udang yang telah mati dihitung dan dicatat. Tingkat toksisitas diukur dengan melihat persentase larva yang mati yaitu selisih antara jumlah larva yang dimasukkan dengan jumlah larva yang masih hidup. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan dengan perlakuan yang sama untuk masing-masing konsentrasi.
Data yang diperoleh dianalisis untuk menentukan nilai LC50 dengan metode kurva menggunakan tabel analisis probit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Skema sintesisi senyawa pirazolin PF-4CL-2OMe dapat dilihat pada Gambar 1. Senyawa pirazolin PF-4Cl- 2OMe disintesis menggunakan reaksi one-pot tiga komponen antara 2- metoksibenzaldehid, 4-kloroasetofenon, dan fenilhidrazin yang dilarutkan dengan pelarut etanol menggunakan katalis basa kuat NaOH didalam satu wadah dengan metode iradisasi gelombang mikro pada daya 180 W. Tahapan reaksi yang pertama ialah pembentukan senyawa
intermediet kalkon melalui reaksi kondensasi Clasein-Schmidt antara 2-metoksibenzaldehid dan 4-kloroasetofenon. Tanpa adanya proses
pemisahan, secara langsung terjadi reaksi siklisasi antara seyawa intermediet kalkon dengan fenilhidrazin membentuk molekul target PF-4Cl- 2OMe.
3
Spektrum UV menunjukkan tiga puncak serapan maksimum pada panjang gelombang 205, 245 nm dan 366 nm.
Serapan pada panjang gelombang 205 nm menunjukkan transisi elektronik π→π* pada sistem terkonjugasi cincin fenil yang berikatan pada cincin N1 senyawa pirazolin, serapan pada panjang gelombang 245 nm menunjukkan transisi elektronik π→π* pada cincin fenil tersubtitusi o-metoksi serta serapan pada panjang
gelombang 366 nm menunjukkan transisi elektronik π→π* pada cincin fenil tersubtitusi p-kloro.
Spektrum FTIR menunjukkan serapan pada bilangan gelombang (cm-1) 3073 (C-H aromatik), 2968 (C-H alifatik), 1598 (C=N), 1504 (C=C), 1389 (C-N), 1138 (C-O) dan 829 (C-Cl). Hasil karakterisasi dengan spektrokopi 1H- NMR dari senyawa PF-4CL-2OMe menunjukkan puncak proton yang khas untuk senyawa pirazolin dan juga menunjukkan jumlah proton yang sesuai dengan senyawa target yang diharapkan.
Ciri khas spektrum 1H-NMR pirazolin
ditandai dengan munculnya puncak pola sistem ABX dari cincin pirazolin. Hal ini dapat dilihat dari puncak proton Ha, Hb
dan Hx pada pergeseran kimia 3,00 ppm,
3,85 ppm dan 5,63 ppm yang sama-sama memiliki orientasi puncak
doublet of doublets. Proton Ha dan Hb
merupakan proton yang berikatan pada atom karbon yang sama disebut dengan posisi geminal, namun kedua proton ini memiliki lingkungan yang berbeda, dimana proton Ha berada pada posisi ekuatorial dan proton Hb berada pada posisi aksial terhadap Hx. Proton Hb pada posisi aksial memiliki interaksi yang lebih besar terhadap ikatan N-N pada cincin pirazolin dibandingkan proton Ha, sehingga pergeseran kimia Hb berada di daerah downfield dibandingkan Ha
karena proton Hb lebih tak terlindungi (deshielding). Puncak proton Hx berada di daerah downfield dibandingkan Ha dan Hb karena interaksinya lebih besar terhadap ikatan N-N pada cincin pirazolin yang hanya berjarak 2 ikatan.
.
Cl
O
NaOH 3N , EtOH
Iradiasi Gelombang Mikro 180 W, 2 menit
N N
Cl
H3CO
+ H +
O
H3CO N
H NH2
Gambar 1. Skema sintesis senyawa pirazolin PF-4CL-2OMe
4
Proton Ha memiliki kopling geminal dengan proton Hb karena sama-sama terikat pada karbon C-4 dan kopling vicinal dengan proton Hx karena terikat pada karbon yang berbeda yaitu karbon C-5 (Jab = 17,1 Hz dan Jax =6,8 Hz).
Pada proton Hb juga terdapat kopling geminal dengan proton Ha dan kopling vicinal dengan proton Hx (Jba = 17,1 Hz
dan Jbx = 12,4 Hz), sedangkan proton Hx memiliki kopling vicinal dengan dua
proton Ha dan Hb (Jbx = 12,4 Hz dan Jax = 6,8 Hz).
Spektrum HRMS dari senyawa PF- 4Cl-2OMe menunjukkan bahwa muncul puncak ion molekul yang teramati sebagai [M+H]+ dengan m/z 363,1307 dengan kelimpahan 100%. Massa terhitung dari senyawa target menunjukkan [M+H]+= 363,1264 dengan rumus molekul C22H20ClN2O Spektrum menunjukkan selisih perbedaan yang sangat kecil antara ion molekul yang teramati dan massa yang terhitung yaitu sebesar 0,0043. Selain puncak ion molekul, terdapat puncak isotop pada m/z 365,1432 yang menunjukkan ciri khas atom Cl yang memiliki isotop 37Cl dan 35Cl dengan perbandingan 1:3.
Toksisitas senyawa PF-4CL-2OMe dilakukan dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Menurut Lisdawati et al., (2006), metode BSLT merupakan metode yang mudah dilakukan dan relatif tidak mahal, serta tidak perlu peralatan khusus (sederhana) dalam pelaksanaannya dengan tingkat kepercayaan 95%. Selain itu, metode BSLT memiliki korelasi positif dengan antikanker, sehingga dapat digunakan untuk uji pendahuluan senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antikanker. Pada uji toksisitas senyawa PF-4Cl-2OMe ini digunakan larva Artemia Salina Leach
sebagai hewan uji dan nilai LC50 sebagai tolak ukur sifat toksik.
Hasil uji BSLT menunjukkan senyawa pirazolin PF-4CL-2OMe memiliki nilai LC50 yaitu 572.79 µg/mL.
Pada metode BSLT, suatu senyawa murni dikatakan memiliki sifat toksik jika memiliki harga LC50 ≤ 200 µg/mL (Meyer et al., 1982). Jadi, senyawa senyawa pirazolin PF-4CL-2OMe yang telah disintesis bersifat tidak toksik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Laboratorium Kimia Organik Sintesis, Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam dan Laboratorium HPLC FMIPA Universitas Riau serta Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam FMIPA ITB dan UNPAD.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, A., Husain, A., Khan, S.A., Mujeeb & M., Bhandari, A.
2016. Synthesis antimicrobial and antitubercular activities of some novel pirazoline derivative. Journal of Saudi Chemical Society, 20: 577-584.
Azarifar, D & Ghasemnejad H. 2003.
Microwave-assisted synthesis of Some 3,5-arylated 2- pyrazolines. Molecule, 8: 642- 648.
Ethiraj, K.R., Nithya, P., Khrisnakumar, V., Mathew, A.J. & Khan, F.N.
2012. Synthesis and cytotoxicity study of pyrazoline derivatives of metoxy subtituted
naphtyl chalcones. Research on Medical Intermediets, 39: 1833-1841.
Gupta, R., Gupta, N. & Jain, A. 2010.
Improved synthesis of chalcone 5
and pyrazoline under ultrasonic irradiation. Indian Journal of Chemistry, 49: 351-355.
Hayashi, Y. 2016. Pot economy and one- pot synthesis. Royal Society of Chemistry, 2: 1-15.
Insuasty, B., Ramirez, J., Becerra, D., Echeverry, C., Quiroga, J., Abonia, R., Robledo, S.M., Velez, I.D., Upegui, Y., Munoz, J.A., Ospina, V., Nugueras, M.
& Cobo, J. 2015. An efficient synthesis of new
caffeine-based chalcones, pyrazolines and pyrazolo[3,4-
b][1,4]diazepines as potential antimalarial, antitrypanosomal and antileishmanial agents.
European Journal of Medicinal Chemistry, 93: 401-413.
Jadhav, S.Y., Shirame, S.P., Kulkarni, S.D., Patil, S.B., Pasale, S.K., Raghunath B. Bhosale, R.B.
2013. PEG mediated synthesis and pharmacological evaluation of some fluoro substituted pyrazoline derivatives as anti- inflammatory and analgesic agents. European Journal of Medicinal Chemistr, 67: 252- 262
Khalil, N.A., Ahmed, E.M., El-Nassan, H.B., Ahmed, O.K. & Al-Abd, A.M. 2012. Synthesis and biological evaluation of novel pyrazoline derivatives as anti- inflammatory and antioxidant agents. Archives of Pharmacal Research, 35: 995-1002.
Lisdawati, V., Wiryowidagdo, S. &
Kardono, L.B. 2006. Brine shrimp lethality test (bslt) dari berbagai fraksi ekstrak daging buah dan biji mahkota dewa (phaleria macrocarpa). Buletin Peneltian Kesehatan, 34: 111-118.
Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putman, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E. & McLaughiin, J.L. 1982.
Brine shrimp: a convencient general bioassay for active plants consistuent. Journal of Plant Medical, 45: 31-34.
Rahman, M.A. & Siddiqui, A.A. 2010.
Pyrazoline derivatives: a worthy insight into the recent advances and potential pharmacological activities. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, 2: 165-175.
Sumardjo, D. 2009. Buku Panduan Mahasiswa Kuliah Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
6
