1
SINTESIS DAN UJI TOKSISITAS ANALOG 5-(3-FLUOROFENIL)-3-(NAFTALEN-2-IL)-1-FENIL- 1H-PIRAZOL
Asda Nurhayati
1*, Jasril
21
Mahasiswa Program S1 Kimia FMIPA Universitas Riau
2
Dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Riau
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*asda.nurhayati2730@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Pyrazole is an important group of five circular heterocyclic compounds containing two adjacent nitrogen atoms. Pyrazole compounds also have two endocyclic double bonds which is known to have diverse interesting biological activities such as, anticancer, antitumor and antioxidant. In this study, the pyrazole analogue 5-(3-fluorophenyl)-3- (naphthalene-2-yl)-1-phenyl-1H-pyrazole (PZL 2N-3F) was successfully synthesized through the synthesis of one-pot cyclization of pyrazoline which was then continued. By oxidative aromatization reaction of pyrazoline 5-(4-fluorophenyl)-3-(naphthalene2-yl)- 1-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazole with glacial acetic acid under reflux for 42 hours.
The purity of the synthesized compound was determined using the TLC, melting point and HPLC analysis. Structure identification was carried out through spectroscopic analysis of UV and FTIR. The yield obtained from the synthesis of PZL 2N-3F compound was 14.8%. The toxicity of pyrazole compounds was determined by the BSLT method using shrimp Larvae (Artemia salina Leach). The results of the BSLT for the PZL 2N-3F compound were non-toxic with an LC
50value of = 606.7 µg/mL.
Keywords : Brine Shrimp Lethality Test, pyrazole, pyrazoline, reflux, toxicity
ABSTRAK
Pirazol adalah kelompok senyawa penting dari heterosiklik lingkar lima dimana mengandung atom nitrogen yang saling berdekatan. Selain itu, senyawa pirazol juga memiliki dua ikatan rangkap endosiklik yang diketahui memiliki aktivitas biologi yang menarik, seperti sebagai antikanker, antitumor dan antioksidan. Pada penelitian ini, analog pirazol 5-(3-fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil-1H-pirazol (PZL 2N-3F) telah berhasil disintesis melalui sintesis one-pot siklisasi pirazolin yang kemudian dilanjutkan reaksi aromatisasi oksidatif dari senyawa pirazolin 5-(4-fluorofenil)-3-(naftalen2-il)-1- fenil-4,5-dihidro-1H-pirazol dengan asam asetat glasial menggunakan refluk selama 42 jam. Kemurnian senyawa hasil sintesis ditentukan dengan menggunakan uji KLT, titik leleh dan analisis HPLC. Identifikasi struktur dilakukan melalui analisis spestroskopi UV dan FTIR. Rendemen yang didapatkan dari hasil sintesis senyawa PZL 2N-3F adalah sebesar 14,8%. Uji toksisitas dari senyawa pirazol ditentukan dengan metode BSLT menggunakan larva udang (Artemia salina Leach). Hasil uji BSLT senyawa Pirazol PZL 2N-3F bersifat tidak toksik dengan nilai LC
50= 606,7 µg/mL.
Kata kunci: Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) pirazol, pirazolin, refluks, toksisitas
2
PENDAHULUAN
Pirazol adalah kelompok senyawa penting dari heterosiklik lingkar lima dimana mengandung atom nitrogen yang termasuk kedalam salah satu senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid (Marliza, 2012). Selain mengandung dua atom nitrogen yang berdekatan, senyawa pirazol juga memiliki dua ikatan rangkap endosiklik (Chauhan et al., 2011). Hal tersebut membuat senyawa ini memiliki aktivitas biologi yang menarik. Berbagai penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa senyawa pirazol mempunyai aktivitas yang beragam diantaranya sebagai antitumor, antiinflamasi (Pasin et al., 2010), antioksidan (Shahrokhi, 2013), antimikroba (Kovvuri et al., 2018) dan antikanker (El-sayed et al., 2019).
Penelitian ini menjadi menarik karena adanya modifikasi terhadap struktur pirazol dengan inti fenil yang diketahui memiliki bioaktivitas yang tinggi selain itu adanya subsituen halogen fluoro pada cincin diketahui dapat meningkatkan aktivitas farmakologi suatu senyawa (Olsen et al., 2017). Selain itu, penelitian terbaru senyawa pirazol telah dilakukan oleh Astuti, (2020) yaitu sintesis pirazol yang tersubtitusi p-fluoro melalui reaksi aromatisasi oksidatif antara senyawa pirazolin dan asam asetat dengan menggunakan refluks. Senyawa hasil sintesis pada penelitian ini memiliki nilai toksisitas yang baik. Senyawa pirazol yang akan disintesis menggunakan metode refluks. Selanjutnya senyawa pirazol hasil sintesis dilakukan uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven microwave (Electrolux), satu set alat destilasi, neraca analitik, pompa vakum, corong buchner, chamber, peralatan refluks, alat kromatografi kolom, alat penentu titik leleh Fisher John (SMP 11-Stuart®), pipet mikro, lampu UV 254 dan 366 nm (Cole-Parmer), spektrofotometer UV- Visible (Genesys 10S UV-VIS v4.002 2L9N175013), HPLC (UFLC Prominance-Shimadzu LC Solution, Detektor UV SPD 20AD), spektrofotometer FTIR (FTIR Shimadzu, IR Prestige-21), serta alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium Kimia FMIPA Universitas Riau.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2-asetilnaftalen (Merck), 3-fluorobenzaldehid (Merck), natrium hidroksida (NaOH) (Merck), fenilhidrazin (Merck), asam asetat glasial (Merck), etanol absolut (Merck), dimetil sulfoksida (DMSO) (Merck), indikator universal, pelat KLT GF
254(Merck), metanol, n-heksana, etilasetat, kloroform dan akua DM.
b. Sintesis senyawa pirazolin 5-(3- fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1- fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolin Senyawa 3-fluorobenzaldehid (1 mmol), 2-asetilnaftalen (1 mmol), fenil hidrazin (3 mmol) dan larutan NaOH 3N (2 mL) dilarutkan dalam pelarut etanol absolut (6 mL) di dalam erlenmeyer.
Campuran kemudian diiradiasi gelombang mikro dengan daya 180 Watt selama 1-3 menit (sampai selesai bereaksi). Kontrol reaksi dilakukan setiap 10 detik menggunakan KLT.
Campuran reaksi yang diperoleh
3
kemudian didiamkan semalaman di
dalam lemari pendingin untuk memaksimalkan terbentuknya endapan.
Endapan yang terbentuk disaring menggunakan corong buchner dan dicuci dengan akua DM, n-heksana dan metanol dingin lalu dikeringkan pada suhu ruang. Padatan pirazolin yang tidak murni direkristalisasi dengan pelarut yang sesuai. Selanjutnya, padatan yang diperoleh diuji kemurniannya melalui uji KLT, pengukuran titik leleh dan analisis HPLC.
c. Sintesis senyawa pirazol PZL 2N- 3F
Senyawa pirazolin 5-(3- fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil-4,5 -dihidro-1H-pirazolin (0,195 g; 0,5 mmol) dimasukkan ke dalam labu refluks kemudian ditambahkan senyawa asam asetat glasial (5 mL). Campuran di refluks selama 42 jam di dalam penangas minyak pada suhu 85
0C.
Reaksi dikontrol setiap 6 jam menggunakan KLT. Hasil reaksi dituangkan pada erlenmeyer yang telah diisi akua DM dingin (10 mL) dan kemudian dinetralkan dengan menggunakan NaOH 3N.
Padatan yang diperoleh disaring menggunakan corong Buchner dan dicuci dengan akuades dingin dan n- heksan dingin. Senyawa pirazol yang belum murni dimurnikan menggunakan kolom kromatografi. Selanjutnya senyawa yang diperoleh diuji kemurniannya dengan KLT, pengukuran titik leleh, dan analisis HPLC.
d. Karakterisasi Senyawa
Senyawa murni yang diperoleh dikarakterisasi melalui analisis spektroskopi UV dan FTIR. Analisis UV
dan FTIR dilakukan di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Riau.
e. Uji toksisitas
Senyawa pirazol PZL 2N-3F sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 5 mL etil asetat (larutan induk, konsentrasi 1000 μg/mL), kemudian dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda 1000;
100; 10; 1 dan 0,1 μg/mL dengan cara pengenceran bertingkat. Larutan dengan konsentrasi yang berbeda tersebut dipipet ke dalam masing-masing vial sebanyak 0,5 mL dengan tiga kali pengulangan, lalu pelarut diuapkan hingga mengering. Selanjutnya, ke dalam masing-masing vial ditambahkan 50 μL DMSO dan air laut secukupnya.
Sebanyak 10 ekor larva udang yang sudah ditetaskan dari telur udang (Artemia salina Leach) dimasukkan ke dalam vial tersebut dan ditambah air laut hingga batas kalibrasi 5 mL. Toksisitas diukur dengan cara menghitung jumlah larva udang yang mati dalam waktu 24 jam. Data yang diperoleh dianalisis untuk menentukan nilai LC
50dengan metode kurva menggunakan tabel analisis probit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini, sintesis senyawa
pirazol PZL 2N-3F (molekul target)
(Gambar 1) diperoleh dari senyawa
awal senyawa pirazolin 5-(3-
fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil-4,5-
dihidro-1H-pirazol yang diperoleh
melalui reaksi satu wadah (one pot)
senyawa 2-asetilnaftalen, 3-
fluorobenzaldehid serta fenil hidrazin
dengan dikatalisis oleh NaOH dalam
pelarut etanol. Reaksi senyawa pirazolin
menggunakan metode iradiasi
gelombang mikro pada daya 180 W.
4
Pada penelitian ini, kontrol reaksi
senyawa pirazolin dilakukan setiap 10 detik dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang bertujuan untuk mengetahui apakah reaksi pirazolin sudah selesai. Reaksi pirazolin selesai dalam waktu 1 menit yang ditandai dengan hasil KLT yang menunjukkan bahwa noda produk (senyawa pirazolin) dan starting material (3-fluorobenzaldehid dan 2- asetilnaftalen) tidak menghasilkan noda yang sejajar. Kemudian senyawa pirazolin yang masih terdapat di dalam Erlenmeyer tadi disimpan kedalam lemari pendingin selama 24 jam yang bertujuan untuk terbentuknya endapan yang maksimal. Endapan yang didapat kemudian disaring dan dicuci dengan menggunakan akua DM dan n-heksana dingin untuk menghilangkan pengotor sehingga diperoleh senyawa murni.
Senyawa pirazolin murni yang didapatkan berwarna kuning dengan berat 0,195 g dan jumlah rendemen yang dihasilkan sebesar 53,27% (tanpa rekristalisasi). Selanjutnya, untuk memastikan kemurnian senyawa pirazolin tadi, dilakukan uji KLT sistem 3 eluen berbeda dan hasil yang didapatkan menunjukkan satu noda pada pelat. Hasil pengukuran titik leleh yang didapatkan yaitu 96-97
0C. Adanya selisih titik leleh ≤ 2
0C ketika padatan mulai meleleh hingga meleleh sempurna juga menunjukkan senyawa sudah murni.
Pada penelitian ini, sintesis senyawa pirazol PZL 2N-3F dilakukan dengan cara mereaksikan senyawa pirazolin 5- (3-fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil- 4,5-dihidro-1H-pirazol dan asam asetat glasisal dengan melalui reaksi aromatisasi oksidatif. Reaksi pembentukan senyawa pirazol ini dilakukan dengan metode refluks dengan
pengadukan menggunakan stirrer dan pemanasan dengan suhu 85
0C. Hal ini dikarenakan pada reaksi pembentukan senyawa pirazol membutuhkan bantuan pengadukan dan pemanasan yang berlangsung lama. Digunakan suhu 85
0C. Reaksi sintesis senyawa pirazol PZL 2N-3F telah selesai disintesis selama ±42 jam dengan kontrol reaksi setiap 6 jam menggunakan uji KLT.
Reaksi dianggap selesai apabila pada hasil KLT menunjukkan noda senyawa pirazol tidak lagi sejajar dengan noda senyawa pirazolin. Selain itu, perbedaan yang menandakan senyawa pirazol telah terbentuk dapat dilihat dari warna noda yang dihasilkan. Ketika dikontrol, warna noda dari senyawa pirazol lebih menuju hitam dan tidak ada pendar pada UV 365 nm dimana pada senyawa pirazolin akan terlihat warna yang spesifik pada UV 365 nm yaitu pendar biru.
Setelah reaksi sintesis selesai, campuran dituangkan kedalam gelas Beaker yang berisi akua DM dingin yang bertujuan untuk mengurangi kelarutan dari senyawa pirazol dalam asam asetat glasial. Kemudian, campuran dinetralkan dengan menambahkan larutan NaOH 3N yang bertujuan untuk menetralkan pH campuran senyawa sehingga memaksimalkan pembentukan endapan.
Endapan yang terbentuk yaitu berwarna
putih kecoklatan. Kemudian dilakukan
penyaringan untuk memisahkan endapan
dari larutan. Padatan yang didapatkan
dicuci dengan menggunakan akua DM
dingin dan n-heksana dingin yang
bertujuan untuk menghilangkan pengotor
berdasarkan sifat kepolarannya. Namun,
senyawa pirazol yang didapatkan belum
murni. Oleh karena itu, dilakukan proses
pemisahan selanjutnya yaitu secara
kromatografi kolom. Kolom dibuat
dengan fasa diam berupa silika gel dan
fasa geraknya berupa eluen
5
(perbandingan antara n-heksana dan etil
asetat). Senyawa murni diperoleh pada fraksi 42-60 yang dibuktikan dengan hanya ada satu noda dari hasil uji KLT.
Larutan fraksi 42-60 tersebut diuapkan
pada suhu ruang. Senyawa murni yang diperoleh berupa kristal berwarna kuning dengan berat 0,054 g dan rendemen sebesar 14,83%.
N N
F
Gambar 1. Molekul Target
Analisis kemurnian senyawa PZL 2N-3F dilakukan dengan menggunakan uji KLT, pengukuran titik leleh dan HPLC. Hasil uji KLT senyawa tersebut murni dengan menggunakan system 3 eluen berbeda. Hasil pengukuran titik leleh senyawa PZL 2N-3F yang didapatkan adalah 126-127
0C, dimana senyawa tersebut dapat dikatakan murni karena memiliki range titik leleh sebesar 1
0C. Kemudian, pada analisis HPLC yang menunjukkan satu puncak dominan pada waktu retensi 19,079 menit yang mempertegas kemurnian senyawa PZL 2N-3F.
Senyawa PZL 2N-3F hasil sintesis yang telah murni diidentifikasi strukturnya menggunakan analisis spektroskopi UV dan FTIR. Analisis spektroskopi UV (Gambar 2) senyawa PZL 2N-3F menunjukkan adanya dua serapan maksimum pada panjang gelombang (λ) 259 dan 290 nm. Nilai λ maksimum yang lebih besar dari 200 nm menandakan bahwa adanya ikatan rangkap yang terkonjugasi dalam senyawa. Pada λ 259 nm merupakan nilai panjang gelombang yang menunjukkan adanya transisi elektron dari π→π* pada sistem terkonjugasi cincin fenil tersubstitusi m-fluoro.
Sedangkan pada λ 290 nm merupakan transisi elektron π→π* pada cincin naftalen. Adanya perbedaan nilai serapan maksimum pada panjang gelombang antara cincin naftalen dengan cincin fenil tersubstitusi m-fluoro disebabkan oleh sistem terkonjugasi pada ikatan rangkapnya.
Spektrum FTIR menunjukkan serapan pada bilangan gelombang yang sesuai dan vibrasi ikatan yang khas untuk gugus fungsi pada senyawa PZL 2N-3F. Serapan pada bilangan gelombang 3048 cm
-1mengindikasikan adanya vibrasi ikatan C-H aromatik.
Pada bilangan gelombang 1595 cm
-1menunjukkan adanya vibrasi ikatan yang khas untuk C=N. Sedangkan pada bilangan gelombang 1053 cm
-1merupakan nilai serapan dari ikatan antara C=C aromatik. Vibrasi ikatan C-N pada atom C-5 pada senyawa PZL 2N- 3F juga memiliki vibrasi yang khas, yaitu muncul pada bilangan gelombang 1372 cm
-1dan untuk ikatan C-F pada fenil yang tersubstitusi m-fluoro muncul pada bilangan gelombang 1202 cm
-1.
Senyawa PZL 2N-3F hasil sintesis
dilakukan uji toksisistas untuk
mengetahui sifat racun dari obat dan
juga untuk menilai keamanan obat
6
sebelum digunakan oleh manusia. Uji ini
dilakukan dengan menggunakan metode BSLT sebagai uji awal atau uji pra- screening senyawa sebagai anti kanker atau anti tumor. Metode BSLT dipilih karena metode ini mudah dilakukan dan cepat serta memiliki korelasi yang positif terhadap aktivitas anti kanker. Hasil uji BSLT senyawa pirazol PZL 2N-3F memiliki harga LC
50yaitu 606,7 µg/mL.
Pada penelitian ini, senyawa PZL 2N-3F tidak bersifat toksik dikarenakan pola resonansi dari cincin fenil tersubstitusi m-fluoro tidak mencapai ikatan N-N pada cincin pirazol yang menyebabkan kerapatan elektron pada ikatan tersebut tidak terlalu besar. Selain itu, posisi subsituen juga mempengaruhi sifat toksik suatu senyawa. Penelitian yang telah dilakukan oleh Astuti (2020) telah berhasil mensintesis senyawa pirazol 5- (4-fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil- 1H-pirazol yang tersubstitusi p-fluoro menunjukkan senyawa ini bersifat toksik dengan nilai LC
50= 43 μg/mL. Senyawa murni dikatakan memiliki sifat toksik jika memiliki harga LC
50≤ 200 µg/mL (Anderson et al., 1991).
KESIMPULAN
Senyawa pirazolin berhasil disintesis secara one pot dari starting material 2- asetilnaftalen, fenil hidrazin, dan 3- fluorobenzaldehid dengan metode iradiasi gelombang mikro menghasilkan rendemen sebesar 53,27%. Senyawa PZL 2N-3F dengan asam asetat menggunakan peralatan refluk dan menghasilkan rendemen sebesar 14,83%.
Senyawa PZL 2N-3F yang disintesis sesuai dengan molekul target yang diharapkan berdasarkan hasil analisis data spektroskopi UV dan FTIR.
Hasil uji toksisitas senyawa PZL 2N-3F menunjukkan senyawa ini bersifat tidak
toksik dengan nilai LC
50= 606,07 µg/ml.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Laboratorium Kimia Organik Sintesis, Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam dan Laboratorium HPLC FMIPA Universitas Riau.
DAFTAR PUSTAKA
Anderson, J.E, Goetz, C.M &
McLaughin, J.L. 1991. A blind comparison of simple bench-top bioassay and human tumor cell cytotoxicities as antitumor presreen.
Phytochemical Analysis. 2: 107-111.
Astuti, R. 2020. Sintesis dan uji toksisitas analog pirazol 5-(4- fluorofenil)-3-(naftalen-2-il)-1-fenil- 1H-pirazol. Skripsi. Universitas Riau, Pekanbaru.
Chauhan, A., Sharma, P.K., Khausik, N.
dan Kumar, N. 2011. Synthesis of noval pyrazole analogues as efficacious antimicrobial agents.
Intern J. of Pharmacy and Pharmaceu Science. 3(5): 0975- 1491.
El-sayed, A. A., Amr, A. E. E., & El- ziaty, A. K. 2019. Cytotoxic effects of newly synthesized heterocyclic candidates containing nicotinonitrile and pyrazole moieties on hepatocellular and cervical carcinomas. Molecules. 24(10):
1–14.
Kovvuri, J., Nagaraju, j., Kumar, G., Sirisha, K., Chandrasekhar, C., Alarifi, A. dan Kamal, A. 2018.
Catalyst-free synthesis of pyrazole- aniline linked coumarin derivatives and their antimicrobial evaluation. J.
of Saudi Chem Soc. 22(6): 665–677.
7
