STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA
I. TUJUAN
Melakukan pembuatan media dan mempersiapkan peralatan untuk kerja mikrobiologi dan melakukan sterilisasi dengan autoclave
II. DASAR TEORI
Media atau medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat yaitu mengandung nutisi dasar seperti sumber karbon, sumber nitrogen, mineral (Fosfor, Magnesium, Kalsium, Natrium), dan vitamin (Sutedjo, 1991).
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik ditambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk dan Wheeler, 1993).
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni dengan cara disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit (Fathir, 2009).
Media dibedakan menjadi:
1. Media umum, yaitu media yang dapat dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan satu atau lebih kelompok mikroba secara umum.
2. Media pengaya, yaitu dipergunakan dengan maksud “memberikan kesempatan” terhadap suatu jenis atau kelompok mikroba untuk tumbuh menjadi cepat.
3. Media selektif, yaitu media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu tetapi akan menghambat atau mematikan untuk jenis-jenis lainnya.
4. Media diferensiasi, yaitu media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba.
5. Media penguji, yaitu media yang dipergunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba.
6. Media enumerasi, yaitu media yang dipergunakan untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu bahan.(Suriawiria, 2005).
Garis besar pembuatan media yang tersusun atas beberapa bahan adalah sebagai berikut:
a. Mencampur bahan – bahan, dilarutkan dalam air suling dan dipanaskan dalam pemanas air supaya larutannya homogen.
b. Menyaring dengan kertas saring, kain, atau kapas. Untuk media agar atau gelatin, penyaringan harus dilakukan dalam keadaan panas.
c. Menentukan dan mengatur pH.
d. Memasukkan media ke dalam tempat tertentu. Sebelum disterilkan, media dimasukkan ke dalam erlenmeyer atau wadah lain yang bersih, kemudian ditutup kapas atau kertas sampul (kertas perkamen) supaya tidak basah sewaktu disterilkan.
e. Sterilisasi umumnya dilakukan dengan udara panas dalam autoclave pada suhu 121° C selama 15- 30 menit (Sutedjo, 1991).
PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro, 1994).
Sterilisasi adalah proses atau kerja untuk membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan mikroba ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus bisa membunuh jasad renikyang paling tahan panas seperti spora bakteri (Fardiaz, 1992).
Hampir semua tindakan yang dilakukan dalam diagnosa mikrobiologis, sterilisasi sangat diutamakan baik alat-alat yang siap pakai maupun medianya. Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun spora. Oleh karena itu, bagi seorang pemula di bidang mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi, pembuatan media serta teknik penanaman, hal ini semua merupakan dasar- dasar kerja dalam laboratorium mikrobiologi.
Sterilisasi berarti proses pemusnahan bakteri dengan cara membunuh mikroorganisme.
Dalam kegiatan penelitian mikroba, digunakan alat dan medium yang steril, maka sterilisasi ini adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan atau kontaminasi oleh mikroba. Sterilisasi ini dapat dilakukan dengan cara-cara sebagai berikut:
1. Pemanasan, meliputi:
a. Sterilisasi dengan pemijaran (pembakaran alat-alat di atas lampu spiritus sampai pijar).
b. Sterilisasi dengan udara panas (kering). Temperatur yang digunakan 170°C – 180°C selama 2 jam.
c. Sterilisasi dengan uap air panas. Digunakan untuk cairan dengan suhu 100°C.
d. Sterilisasi dengan uap panas bertekanan, menggunakan otoklaf dengan suhu 121°C selama 12 – 30 menit.
2. Penyaringan
Dilakukan terhadap bahan cair yang sangat peka terhadap pemanasan (misal:
serum darah, toksin, larutan garam fisiologis) dan tidak dapat disterilkan dengan pemanasan tinggi. Untuk itu digunakan filter bakteri, misalnya Berkeled filter, Chamberland filter.
3. Sterilisasi Bahan Makanan
Sterilisasi bahan makanan dapat dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam uap air panas selama 1 jam dengan suhu 100°C diulang selama tiga kali. Cara lain adalah dapat disterilkan dengan menggunakan autoklaf (Pustekkom, 2005).
Faktor–faktor yang mempengaruhi sterilisasi pemanasan:
1. jenis pemanasan, kering atau basah 2. suhu dan waktu
3. jumlah organisme yang ada
4. apakah organisme tersebut memiliki kemampuan untuk membuat spora 5. jenis bahan yang mengandung organisme yang harus dibunuh
(Gupte, 1990):
Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).
III. METODOLOGI a. Alat & Bahan
Alat :
1. Tabung reaksi 2. Labu Erlenmeyer 3. Beaker Gelas 4. Piet Tetes 5. Gelas Ukur 6. pH meter 7. Autoclave 8. Alumunium foil 9. Kapas
10. Koran 11. Cawan Petri Bahan:
1. Media NA 2. Media NB b. Cara Kerja
1. Sterilisasi Alat
Tabung reaksi, labu Erlenmeyer, ditutup dengan kapas berbalut kassa dan alumunium foil. Piring petri, pinset, blue tip, yellow tip, dibungkus kertas payung
Disteririlisasi dengan autoclave 121°C, 20 menit
Dikeringkan dalam oven 2. Pembuatan Media
Ditimbang masing-masing medium sesuai kebutuhan dan ketentuan yang tertera pada label medium
Dilarutkan medium tersebut pada sebagian aquadest
pH medium diatur dengan penambahan HCl dan NaOH
Setelah pH sesuai, sisa sir dicampur homogen, dibagi dalam wadah yang sesuai
Ditutup wadah medium dengan kapas berbalut kassa dan alumunium foil
Strerilisasi dengan autoclave 121°C, 15 menit
Untuk membuat medium padat ditambah agar sebanyak 1,5-2% b/v sebelum sterilisasi dilakukan
Medium yang tidak langsung digunakan disimpan dalam refrigerator
Untuk membuat media agar miring, segera setelah sterilisasi selesai media dimiringkan dengan kemiringan yang sesuai, biarkan memadat
IV. DATA PENGAMATAN 1. Sterilisasi Alat
a. Piring petri = 15 buah b. Gelas ukur 10 mL = 6 buah 2. Pembuatan Media
a. Larutan NA yang dilarutkan dalam 550 mL air dibagi ke dalam:
11 labu Erlenmeyer berukuran 100 mL masing-masing 50 mL, dan labu terakhir 60 mL
b. Larutan NB yang dilarutakn ke dalam 40 mL air dibagi ke dalam:
19 tabung reaksi masing-masing 2 mL pada 16 tabung reaksi pendek, 1 ml pada tabung reaksi pendek, dan 4 mL pada tabung reaksi panjang
Piring petri yang akan disterilisasi Larutan media NA dan NB yang akan disterilisasi
V.
PEMBAHASAN
Autoklave merupakan alat sterilisasi untuk media agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang. Di laboratorium terbagi menjadi dua yaitu yang digunakan untuk sterilisasi alat dan medium yang akan dipakai, serta yang digunakan untuk destruksi atau sterilisasi kotor.
Rongga di dalam autoklave tidak boleh terlalu penuh diisi dengan benda-benda yang akan disterilisasikan agar dapat terjadi aliran uap yang cukup baik.
Sterilisasi tidak hanya dilakukan pada awal percobaan saja, tetapi juga perlu dilakukan setelahnya pada bahan yang sudah selesai dipakai dengan cara destruksi. Destruksi adalah suatu cara untuk merusak/menghancurkan bakteri penelitian yang tidak digunakan lagi.
Berfungsi agar bahan tersebut tidak menimbulkan bahaya bagi lingkungan yang dikenai/dikontaminasi olehnya.
Sterilisasi merupakan proses penting yang harus dilalui sebelum melakukan penelitian yang berhubungan dengan mikroorganisme. Sterilisasi dilakukan pada semua alat dan dan bahan yang akan digunakan dalam percobaan, baik peralatan laboratorium maupun medium pertumbuhan mikroba. Melalui sterilisasi, seluruh mikroba patogen dapat mati, sehingga tidak sempat berkembang biak dan tidak dapat mengkontaminasi apa yang akan diujikan.
Sterilisasi pada percobaan ini merupakan sterilisasi secara fisik yang menggunakan panas dari dalam autoklav, di mana panas yang digunakan berasal dari uap air sehingga disebut
Alat dan media yang dimasukkan ke dalam
Autoclav
strerilisasi basah. Dengan kondensasi akan terbentuk embun yang dapat menyebabkan keadaan lembab yang cukup untuk membunuh kuman, sehingga bahan menjadi steril.
Pada percobaan ini, alat yang disterilisasi ialah piring petri, gelas ukur, serta media yang telah dibuat. Piring petri dibungkus dengan koran hingga rapat dan ditumpuk bersama agar bungkusan tidak terbuka. Pembungkusan dengan koran ini bertujuan agar piring petri tidak rusak dan tidak tergores saat dimasukkan ke dalam autoclave, serta tidak dimasuki kontaminan di udara ketika dikeluarkan dari alat.
Untuk sterilisasi gelas ukur, setelah dibersihkan lubang gelas ukur ditutupi kapas dan alumunium foil. Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba dan tidak ada lagi spora mikroba yang masuk. Alumunium foil digunakan karena tahan air sehingga dapat menahan uap air dari autoclave masuk.
Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer.
Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Nutrien Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.
Untuk membuat media Nutrien Broth, media Broth yang telah disediakan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan dilarutkan dalam 40 ml aquades. Larutan yang dihasilkan berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Broth dipanaskan menggunakan hot plate hingga larut sempurna. Setelah dilakukan pemanasan, larutan NB dibagi kedalam tabung reaksi. Yaitu 17 tabung reaksi pendek sebanyak masing-masing 2 ml, dan 2 tabung reaksi panjang sebanyak masing-masing 4 ml. Namun, pada percobaan ini hanya 16 tabung reaksi pendek yang terisi sebanyak 2 ml, sisa 1 tabung reaksi hanya berisi 1 ml, hal ini dapat disebabkan kurang telitinya dalam penuangan larutan maupun menguapnya air saat pemanasan.
Sedangkan untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 500 ml aquades. Namun karena kurang berhati-hati air yang digunakan menjadi 550 ml. Nutrien agar dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning tua keruh. Warna kuning tua keruh ini berarti larutan masih belum steril sehingga dipanaskan juga menggunakan hot plate hingga berwarna bening. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna. Setelah dilakukan pemanasan, dibagi ke dalam 11 labu Erlenmeyer berukuran 100 ml masing-masing 50 ml. karena kelebihan air saat pelarutan, labu terakhir menjadi lebih banyak yaitu 60 ml. Kemudian, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil agar proses sterilisasi media Nutrien Broth dan Nutrien Agar berjalan lancar dan menghasilkan media
yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121℃ selama 15-20 menit.
VI. KESIMPULAN
1. Sterilisasi adalah proses penghilangan mikroorganisme untuk menjaga kemurnian suatu kerja mikrobiologi agar diperoleh hasil yang sesuai.
2. Sterilisasi pada percobaan ini menggunakan autoclave dengan suhu 121°C selama 20 menit.
3. Alat yang disterilisasikan yaitu 15 buah piring petri, dan 6 buah gelas ukur 10 ml.
4. Medium ialah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang berguna untuk membiakkan mikroba.
5. pH dan suhu mempengaruhi pembuatan media.
6. Medium yang dibuat yaitu medium Nutrien Agar dan Nutrien Broth.
7. Medium yang dihasilkan berwarna kuning jernih kecoklatan sebanyak 19 tabung reaksi untuk medium NB dan 11 labu Erlenmeyer untuk medium NA.
8. Medium juga disterilisasi agar tidak terkontaminasi.
VII.
DAFTAR PUSTAKAAnna, 2010, Percobaan 2 Teknik Sterilisasi Dan Pembuatan Media, http://choalialmu89.blogspot.com/2010/11/percobaan-2-teknik-sterilisasi-dan.html diakses pada 15 Mei 2014 pukul 16.30 WIB.
Nikku, 2010, Sterilisasi Alat dan Bahan Pada Pengujian Mikrobiologi, http://nikku92.wordpress.com/2010/10/21/sterilisasi-alat-dan-bahan-pada-
pengujian-mikrobiologi/ diakses pada 15 Mei 2014 pukul 16.30 WIB.
Pratiwi,Sylvia, 2004, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga: Jakarta.
Waluyo,Lud, 2008, Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi, UMM Press: Jakarta.
Yogyakarta, 8 Mei 2014
Asisten, Praktikan,
1.Anthia Dinti S. (09626) 2.Mirza Amrina (09627) 3.Febilla Restu R. (09629)
( ) 4. Ferlita Aprillia (09631)
