Rekayasa Protein/Enzim
Laksmi Ambarsari
⮚ Protein
⮚ Polipeptida
⮚ Globular/serat
⮚ Ikatan peptida
⮚ Urutan asam amino
⮚ urutan gen
⮚ kode genetik.
Struktur dan Fungsi Protein
✔ Desain dan konstruksi protein atau enzim baru dengan fungsi baru atau sesuai yang diinginkan, melalui modifikasi urutan asam amino dengan teknologi DNA rekombinan.
✔ Ukuran dan konformasi tiga dimensi molekul
protein/enzim juga dimanipulasi melalui rekayasa protein.
Rekayasa Protein/Enzim
Alasan:
⮚ Untuk menjelaskan dasar molekuler hubungan struktur dan fungsi protein dan untuk memahami mekanisme katalitik.
⮚ Untuk mengubah struktur dan fungsi protein baik secara terarah maupun acak, misalnya desain protein.
(Tujuannya yaitu merancang fungsi baru pada protein yang strukturnya telah diketahui
Rekayasa Protein/Enzim
Rekayasa Protein/Enzim
Apa yang direkayasa ??
Folding (Struktur):
• Stabilitas Termodinamika
• Stabilitas Termal dan Lingkungan (Suhu, pH, Pelarut, Deterjen, Garam…..)
Fungsi:
• Pengikatan (Interaksi protein dengan lingkungannya)
• Pengikatan suatu molekul dengan afinitas tinggi
• Katalisis bentuk pengikatan yang berbeda
(pengikatan keadaan transisi suatu reaksi kimia)
No Enzyme Industri Kebutuhan
1 xylanase feed 1. Stabil pada suhu tinggi
2. Kondisi asam
pulp and paper 1. Stabil pada suhu tinggi 2. Kondisi basa
3. Stabil pada pH alkalin
2 glucoamylase starch pH tinggi
3
glucose isomerase fructose 1. Subtrat spesifik 2. Kondisi asam
3. Stabil pada suhu tinggi
4 proteinase detergent 1. Termostabilitas
2. Kondisi basa
Perubahan karakteristik enzim dengan rekayasa protein
Rekayasa Protein/Enzim
No Target Metode 1 Struktur protein Kristalisasi
x-ray crystallography NMR
2 modeling dan simulasi Komputer (in silico)
3 Gen plasmid
Ekspresi
Mutasi terarah PCR
Merubah urutan gen Mutasi acak
Alat dalam rekayasa protein
Rekayasa Protein/Enzim
• Xilanase telah dimurnikan dan dikristalkan
• Mutagenesis yang dirancang, stabilitas termalnya
meningkat 2000 kali pada 70
oC dan pH-optimal bergeser ke arah basa dengan satu unit pH
Rekayasa Protein/Enzim
Site-directed mutagenesis:
Mega-primer method
Megaprimer needs to be purified prior to PCR 2
Allows placement of mutation anywhere in a piece of DNA
A
B Wild type
template
First PCR
Second PCR
Random mutagenesis
• Chemical mutagenesis
– expose short piece of DNA to mutagen, make “library” of clones, test for
phenotypes
• PCR mutagenesis by base misincorporation
– Include Mn
2+in reaction
– Reduce concentration of one dNTP
IN SILICO
Shobiroh Nuur’Alimah, Tony Ibnu Sumaryada, Waras Nurcholis, Laksmi Ambarsari. (2022). Molecular Docking Study of
IPBCC.08.610 Glucose Oxidase Mutant for Increasing Gluconic Acid Production, JKSA (2022)
Shobiroh Nuur’Alimah
MUTASI RESIDU DAN PERUBAHAN TINGKAT KODON
Keberhasilan metode mutasi yang digunakan dapat dilihat dari perubahan urutan kodon serta struktur protein dengan plot Ramachandran (Studer et al. 2013)
RMSD ≤2 Å
Perbedaan koordinat lebih kecil dan tumpang tindih struktur kristal dan lebih
mirip (Miladiyah et al. 2018)
Memiliki interaksi yang spontan dan stabil serta memiliki ikatan ligan-reseptor semakin kuat
(Syahputra et al. 2014)
Nilai Km ↑ = pengikatan ↓untuk substratnya dan membutuhkan konsentrasi substrat ↑ untuk
mencapai setengah Vmax
Nilai Km ↓ =pengikatan (atau afinitas untuk substrat) ↑ (lebih ketat)
(Bassingthwaighte dan Chinn 2013) ΔG yang lebih negatif = afinitas ligan yang lebih tinggi
terhadap situs aktif dari reseptor yang digunakan (Pratama dan Suhartono 2018)
