REKAYASA GENETIKA
RESUME
untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Genetika II
yang Dibina oleh Ibu Siti Zubaidah dan Bapak Andik Wijayanto
Oleh: Kelompok 3 Offering C/ 2014
Docilis Safira Febrianti 140341602442 Stevany Dea Shima 140341605052
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI
RESUME REKAYASA GENETIKA
Berikut ini dikemukakan arti rekayasa genetika (genetic enginecring) yang dikutip dari tiga sumber
o Rekayasa genetika adalah manipulasi sifat genetik suatu organisme dengan cara mengintroduksi atau mengeliminasi gen-gen tertentu.
o Rekayasa genetika adalah manipulasi genetic dalam sel untuk menghasilkan suatu sifat yang dikehendaki yang disebut teknologi rekombinan DNA.
o Rekayasa genetika adalah teknik mengubah konstitusi genetik sel atau individu dengan cara pemindahan selektif, insersi atau dengan modifikasi gen balik yang individual maupun yang berupa perangkat gen.
Berdasarkan kutipan tersebut,pada rekayasa genetika terdapat manipulasi atas materi genetik dengan cara menambah atau menghilangkan gen tertentu. Berbagai fenomena genetik alami jika dicermati sebenarnya menjadi model alami dari teknik rekayasa genetika contohnya crossing over, gene pick up, transduksi, dll. Fenomena genetika alami itu terjadi pemutusan, penyambungan, serta perpindahan bagian materi genetik yang dapat mengakibatkan penambahan atau perpindahan suatu gen atau beberapa gen.
PROSES REKAYASA GENETIKA
Menurut Smith dan Byars (1990) terdapat berbagai teknik yang digunakan dalam teknik rekayasa genetika meliputi teknik vektor, injeksi mikro, fusi protoplas, dan elektoporasi. Selain itu klug menambahkan juga teknik kopresipitassi kalsium pospat dan endositosis dan dikenal pula teknik proyektil mikro.
Transfer Vektor
Transfer vektor merupakan cara memasukan suatu gen ke sel baru dengan menggunakan pembawa (carrier) khusus yang memanfaatkan proses alami seperti pada transfer DNA oleh bakteri dan virus. Vektoryang digunakan memasukan gen adalah plasmid, bakteriofage dan cosmid (russel, 1992).
Secara kimiawi vektor-vektor tersebut adalah molekul DNA. Sebagai vektor suatu molekul DNA harus memiliki sifat-sifat yang harus dimiliki DNA seperti di bawah ini (Klug, dkk.,1994)
1. Molekul DNA mampu melekukan replikasi sendiri maupun replikasi segmen DNA yang diinsersikan bebas dari replikasi kromosom sel inang dengan cara membuahi suatu “ori”
2. Molekul DNA harus mengandung sejumlah tapak pemutusan enzim retrisi khusus yang bermanfaat untuk insersi segmen-segmen DNA.
3. Molekul DNA harus membuhai suatu penenda yang dapat dimanfaatkan. 4. Molekul DNA harus mudah terbebas kembali ari sel inang.
a. Plasmid
Plasmid terbentuk secara alami invitro. Plasmid terdapat pada E. coli (plasmid RSF 2124 merupakan derifat dari plasmid ColE1).
b. Bakteriofag
Bakteriofag yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pada E.coli adalah fag . Seluruh gen fag sudah diidentifikasiƛ ƛ dan dipetakan urut-urutan genom secara keseluruhan sudah diketahui. Seluruh derivat fag yang digunakan sebagai vektor transfer sudah direkayasaƛ sehingga hanya siklus titik saja. Derivat-derivat fag lebih dari 100 derivatƛ yang dimanfaatkan sebagai vektor dibuat dengan cara membuang berbagai bagian kelompok gen di daerah tengah.
Vektor lain setelah bakteriofage adalah M 13. Materi genetik pada M 13 berupa DNA unting tunggal. Jika M 13 menginfeksi suatu sel bakteri, DNA unting tunggal bereplikasi menghasilkan suatu model molekul DNA unting ganda yang disebut RF (Replikasi Form). RF setara dengan plasmid dan DNA
asing dapat diinsersikan ke tapak pemutusan enzim retriksi tunggal yang ada pada genom. Susunan RF terdiri dari suatu unting tunggal (+) yang mengandung satu unting segmen DNA yang diinsersikan. Klon DNA unting tunggal yang di hasilkan oleh M 13 dapat digunakan untuk pengurutan DNA atau sebagai templet untuk perubahan urut-urutan klon akibat mutasi.
c. Kosmid (cosmid)
Kosmid merupakan vektor yang dibangun di laboratorium memanfaatkan urut-urutan cos dan fag ƛ yang berguna untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-urutan (bagian tengah kosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kosmid dirakit dan plasmid dan fag , contohƛ plasmid yang digunakan Pbr322.
d. Vektor ulang-alik (Shuttle vectors)
Selain vektor-vektor transfer seperti plasmid, bakterio fag , danƛ kosmid yang digunakan untuk pengklonan DNA, vektor lain yang dapat dimanfaatkkan untuk memanfaatkan untuk memasukkan molekul-molekul DNA rekombinan ke dalam sel prokariotik maupun eukariotik. Vektor-vektor semacam itu disebut vektor ulang alik atau shuttlr vectors. Vektor ulang alik atau shuttlr vectors adalah vektor pengklon yang dapat bereplikasi di dalam dua atau lebih mahkluk hidaup inang.
Injeksi Mikro, Fusi Protoplas, Elektroporasi, Kopresipitasi Kalsium Fosfat dan Endositosis, serta Proyeksi Mikro
Pada injeksi mikro menggunakan jarum mikroskopis,untuk memasukkan DNA melalui membran sel sasaran, termasuk ke dalam inti sel. Pada fusi protoplas terjadi pelarutan dua membran sel dari sel-sel yang berbeda sehingga dua sel dapat di gabung menjadi satu, misalnya fusi antara sel sel-sel yang di kultur dengan protoplas bakteri yang mengandung DNA eksogen. Fusi protoplas, suatu sistem transformasi yang memanfaatkan liposom yang tersusun dari suatu lipida kationik. Pemanfaatan liposom sebagai suatu sistem transformasi atau transfeksi yang disebut sebagai lipofeksi (lipofection).
Pada teknik eletroporasi menggunakan listrik untuk menciptakan lubang kecil di membran sel yang akan dimanfaatkan untuk pemindahan DNA ke dalam sel. Berkenaan dengan elektroporasi informasi dari Old dan Primrose (1989) menyebutkan bahwa pada pendedahan singkat kejutan listrik berkekuatan antara 4000-8000 V, sel-sel memperoleh DNA eksogen dan larutan sekitar (tampaknya melalui lubang-lubang yang terbentuk sesaat pada membran plasma) dengan kejutan listrik akan meningkatkan frekuensi efisien transformasi (Potter dkk., 1984 dalam Old dan Primrose, 1989).
Pada teknik kopresipitasi kalsium fosfat dan endositosis tampaknya butir-butir kopresipitas kalsium fosfat dan DNA masuk ke dalam sel melalui endositosis fagositosis (Old dan Primrose, 1989). Pada teknik ini merupakan cara umum memasukkan suatu DNA ke dalam sel-sel mamalia.
Pada teknik proyeksi mikro, DNA ataupun RNA ditembakkan ke dalam sel (Klein dkk., 1987 dalam Old dan Primrose 1989), teknik ini merupakan suatu cara yang sama sekali baru untuk memasukkan asam nuklet ke dalam sel tumbuhan memanfaatkan kecepatan tinggi. Pada teknik proyeksi mikro membutuhkan kultur sel ataupun perlakuan jaringan resipien.
Prosedur Dasar Teknologi DNA Rekombinan
1. Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik
2. Segmen-segmen digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor. Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul DNA yang baru terbentuk.
3. Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin yang disebut klon-klon.
4. Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang.
5. Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel identik yang semua membawahi urut-urutan yang dklon.
6. Secara potensial, DNA diklon dapat ditranskripsikan, RNA-d ditranslasikan serta produk-produk gen diisolasi dan di kaji.
Peran Enzim Endonuklease Retriksi
Pada proses dasar teknik DNA rekombinan yang diperantai vektor enzim endonuklease dibutuhkan untuk memotong molekul DNA dalam rangka pembuatan fragmen DNA. Enzim yang memang dapat memotong molekul DNA unting ganda pada urutan pasangan nkleotida spesifik yang dikenal sebagai tapak restiksi. Pada makhluk hidup prokariotik tidak terdapat enzim endonuklease restriksi.
Enzim endonuklease retriksi terbagi menjadi dua kelompok atau tipe (Russel, 1992). Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Karena tapak pemotongan tidak spesifik, jadi tipe ini tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan (Russel,1992). Enzim endonuklease restriksi bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Untuk pengenalan ezim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan (Russel, 1992). Dalam urutan basa 5’ 3’ pada unting DNA sama dengan urutan basa 5’ 3’ pada komplementernya.
Enzim endonuklease restriksi juga sudah diisolasi dari sejumlah besar strain bakteri yang berbeda. Oleh karena itu setiap enzim memotong DNA pada suatu pasangan nukleotida yang spesifik untuk enzim yang bersangkutan, jumlah potongan yang dibuat enzim pada suatu molekul DNA tertentu tergantung pada jumlah berapa kali urutan pengenalan ditemukan pada DNA.
Enzim endonuklease restriksi tipe II menghasilkan ujung-ujung lancip yang memiliki nilai khusus pada pengklonal fragmen-fragmen DNA jika kedua ujung tajam hasil pemotongan bertemu dalam larutan, maka akan berbentuk pasangan basa yang sempurna.
Peluang jumlah tapak pemutusan pada suatu DNA oleh enzim endonuklease restriksi II dapat dihitung dalam kaitannya dengan jumlah pasangan nukleotida pada setiap urutan pengenal, sepanjang keberadaan tiap pasangan nukleotida bersifak acak.
Seleksi Klon Rekombinan
Urutan fragmen DNA restriksi yang ditranskripsikan menjadi RNA atau membuat peta urut-urutan hasil hibridisasi dengan fragmen-fragmen restriksi. Oleh karena itu, Southern mengembangkan suatu metode untuk mendeteksi fragmen-fragmen di dalam sel agarose yang komplementer denga urutan RNA atau DNA tertentu, metode ini dikenal dengan Southern Blotting (yang diuji adalah DNA) yang kemudian dikembangkan untuk menganalisis RNA dan protein yang dikenal dengan Nothern dan Western (yang diuji RNA). Pada inti metode ini mentransfer makro molekul dari gel yang berarti telah di pisahkan secara elektroforesis ke suatu permukaan membran.
MANFAAT DAN RESIKO REKAYASA GENETIKA
Manfaat rekayasa genetika dapat dilihat kaitannya dengan analisis genetik, diagnosis atas penyakit manusia, terapi gen, sidik jari DNA, serta bioteknologi (Klug dkk, 1994).
Analisis Genetika
Teknik DNA rekombinan digunakan untuk analisis genetik (Klug dkk, 1994). Teknik-teknik ini memungkinkan pengadaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan klon, demikian pula memungkinkan pemetaan genetika maupun fisik yang lengkap, serta memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan kromosom. Peta fisisk yang dihasilkan memperlihatkan seluruh gen pada genom yang di tandai oleh urutan nukleotida, tanpa pula memperhatikan mutan bahkan sering tanpa dukungan pengetahuan awal tentang fungsi atau fenotip dari gen-gen yang dipetakan.
Diagnosis Molekuler atas Penyakit Manusia
Teknologi DNA rekombinan terbukti menjadi alat yang teliti untuk mendeteksi kelainan genetik. Pemanfaatan urutan DNA yang diklon memungkinkan pengamatan langsung terhadap genotip dari pada pengamatan atas suatu produk gen yang belum di kenal atau yang tidak terekspresi. Contoh deteksi molekuler dapat dilakukan atas Thelessemia dan Sickle cell anemia.
Terapi Gen
Kemampuan mengisolasi dan mengklon gen-gen spesifik manusia yang pada mulanya dikembangkan sebagai suatu penelitian. Proses terapi semacam ini di sebut terapi gen. Metode ini dikembangkan untuk memasukkan gen ke dalam sel manusia, termasuk pemanfaatan vektor virus maupun fusi sel dengan vesikula buatan yang mengandung urutan DNA yang diklon, transfer kimiawi yang mendorong pengangkutan gen melewati membran sel jika sudah dilakukan.
Panduan terapi gen sudah disusun dan mencakup beberapa persyaratan (Klug dkk., 1994) yang akan dikemukan lebih lanjut.
1. Gen harus diisolasi dan ditransfer. 2. Cara transfer gen yang efektif harus ada.
3. Jaringan target harus dapat dicapai, sebagai contoh percobaan terapi gen yang pertama menggunakan sel-sel darah putih ataupun prekursornya sebagai jaringan target.
4. Terapi gen tidak boleh menyakiti pasien dan sudah tidak ada cara terapi lain yang efektif.
Sidik Jari DNA
RELP digunakan untuk membedakan salinan gen normal dari yang mutan dan dapat digunakan sebagai penanda genetik, karena polimorfisme tersebut diwariskan dalam pola kodominan (Klug, 1994). Fenotip penanda beupa fragmen DNA. DNA yang berada di antara dua tapak enzim endonuklease restriksi. Urutan tersebut berasal dari dua hingga dua puluh nukleotida. Pola pita yang dihasilkan tatkala urutan VNTR dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi dan divisualisasikan dengan southern bhotting adalah yang dikenal sebagai sidik jari DNA. RELP tersebut ekuivalen dengan sidik jari konvensional karena pola pita yang dihasilkan berbeda beda dari orang per oran. Bioteknologi
Selain hal yang disebutkan diatas maka DNA rekombinan dapat dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi. Misalnya rekayasa genetika dalam pertanian. Menurut analisis kesulitan analisis disebabkan karena (1) pertumbuhan tanaman yang lambat dan umur pergantian generasi yag lama. (2) besarnya genom tanaman, termasuk banyaknya kromosom poliploid. (3) memiliki kotak kayu, yaitu dinding sel berupa selulosa yang mengelilingi tanaman. Oleh karena itu difokuskan pada penelitian tanaman gen tunggal.
PERTANYAAN
Stevany Dea Shima
1. Apakah yang membedakan antara enzim endonuklease retriksi tipe 1 dan 2? Jawab: Tipe I akan mengenali suatu urutan pasangan nukelotida yang spesifik pada DNA dan selanjutnya memotong DNA pada suatu tapak tidak spesifik jauh dari urutan. Enzim endonuklease restiksi tipe I tidak terlalu bermanfaat untuk pembentukan molekul DNA rekombinan. Enzim endonuklease restiksi tipe II suatu urutan pasangan nukleotida spesifik pada DNA namun tipe ini memotong DNA di dalam urutan. Enzim endonuklease restriksi tipe II memeliki suatu sumbu simetri yang melewati titik tengah urutan pengenalan. Dalam urutan basa 5’ 3’ pada unting DNA sama dengan urutan basa 5’ 3’ pada komplementernya.
2. Sebutkan prosedur dasar teknologi DNA rekombinan!
Jawab: (1) Pembuatan fragmen DNA dengan bantuan enzim nuklease retriksi yang mengenal dan memotong molekul DNA pada urut-urutan nukleotida yang spesifik, (2) Segmen-segmen digabung ke molekul DNA lain dengan bantuan vektor. Vektor dapat bereplikasi secara otonom sehingga memfasilitasi manipulasi dan identifikasi molekul DNA yang baru terbentuk, (3) Vektor yang sudah terinsersi segmen DNA ditransfer ke suatu sel inang. Molekul DNA rekombinan direplikasi menghasilkan berlusin-lusin yang disebut klon-klon, (4) Segmen-segmen DNA yang diklon dapat diambil dari sel inang, (5) Sel-sel inang yang mengandung DNA rekombinan mewariskan kepada seluruh sel turunan, menghasilkan suatu populasi sel-sel identik yang semua membawahi urut-urutan yang dklon, (6) Secara potensial, DNA diklon dapat ditranskripsikan, RNA-d ditranslasikan serta produk-produk gen diisolasi dan di kaji.
3. Apakah perlu melakukan seleksi pada klon rekombinan?
Jawab: Perlu, karena teknik DNA rekombinasi memungkinkan pengadaan suatu kumpulan klon yang meliputi keseluruhan klon, demikian pula memungkinkan pemetaan genetika maupun fisik yang lengkap, serta
memungkinkan penetapan urutan nukleotida dari keseluruhan kromosom. Oleh karena itu perlu melakukan seleksi agar mengetahui cocok atau tidaknya dengan target yang kita inginkan.
Docilis Safira Febrianti
1.Mengapa dalam pengaplikasian terapi gen harus mengikuti panduan dan beberapa persyaratan tertentu?
Jawab: Karena terapi gen tidak boleh menyakiti pasien. Misal kita melakukan percobaan terapi gen yang pertama menggunakan sel darah putih sebagai jaringan target maka gen yang diisolasi dan ditransfer harus mencapai jaringan target tersebut.
2. Mengapa menggunakan sidik jari DNA dalam beberapa kasus tertentu seperti membedakan pelaku dalam suatu pembunuhan?
Jawab: Sidik jari DNA atau RELP digunakan untuk membedakan salinan gen normal dari yang mutan dan dapat digunakan sebagai penanda genetik, karena polimorfisme tersebut diwariskan dalam pola kodominan. Fenotip penanda beupa fragmen DNA. DNA yang berada di antara dua tapak enzim endonuklease restriksi. Urutan tersebut berasal dari dua hingga dua puluh nukleotida. Pola pita yang dihasilkan tatkala urutan VNTR dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi dan divisualisasikan dengan southern bhotting adalah yang dikenal sebagai sidik jari DNA. RELP tersebut ekuivalen dengan sidik jari konvensional karena pola pita yang dihasilkan berbeda beda dari orang per orang.
