アイソトープからアイ ソトポマーへ - J-Stage

化学の 窓

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化学と生物 Vol. 51, No. 11, 2013

アイソトープからアイ ソトポマーへ

一酸化二窒素発生源解析の高精度解析ツール

はじめに

温室効果ガスの一種である一酸化二窒素（亜酸化窒 素，N2O）は大気中の濃度が約320 ppbと低いものの，

1800年代から上昇を続けており，100年あたりの地球温 暖化係数は二酸化炭素の約300倍程度強力であり，京都 議定書により削減が義務づけられている^（1）．さらに，

N2Oは成層圏オゾンの破壊物質であり，Ravishankara ら^（2） は，N2Oは21世紀の最大規模の成層圏オゾンの破 壊物質になりうると述べている．そのため，N2Oの発生 機構の解明および発生抑制技術の開発が求められてお り，その一つとして安定同位体比分析の一種であるアイ ソトポマー（isotopomer；同位体分子種）を用いたN2O の発生機構解析が期待されている．これまでN2Oアイ ソトポマー分析は特殊な装置を用いたごく一部の専門家 だけに可能な特殊技術であったが，近年の分析装置の発 展により徐々に一般化しつつある．今回は，質量分析法 とレーザー分光法という異なる2つのN2Oアイソトポ マー分析手法とその発展について紹介する．

自然生態系からのN2O生成経路

N2Oの人為的発生源のうち最大のものは農業であ り^（3），N2Oは農耕地に施用された窒素肥料が微生物の酵 素反応によって生成される．N2O生成に関与する酵素反 応には，好気的条件下で硝化過程としてアンモニウムが ヒドロキシルアミン，亜硝酸イオンを経て硝酸イオンま で酸化される際にNOが副産物として生成され，さらに 副次的反応としてN2Oが生成される反応と，嫌気的条 件下で脱窒過程として硝酸イオンが亜硝酸イオン，NO,  N2Oを経てN2まで還元される際の中間反応によるもの などが挙げられる^（4）．これらの反応は基質が異なるのは 言うまでもなく，湛水・非湛水などによる土壌中の酸素

の有無，土壌中の炭素含量の違いなど反応が起こる環境 も異なるため，どの反応をターゲットとするかでN2O 発生抑制策も全く異なったものになりうる．そのため，

効率的なN2O発生抑制策を議論するためには，農耕地 でN2Oがどのような反応によって生じているかを知る ことが極めて重要となってくる．

安定同位体比とは

同位体とは，同じ元素で，原子核中の陽子数が同じで 中性子数が異なるもの，すなわち同じ元素で重さ（原子 量）が異なるものを指す．同位体の中でも，長期にわた り安定で自然界に普遍的に存在するものを安定同位体と いう．安定同位体自然存在比とその変動は小さいため，

標準物質との千分率偏差という特有の表示法を用いるの が便利である．単位は（‰；パーミル）を使用する．窒 素原子を例にとると，標準物質は大気中の窒素分子N2  であり，

δ

¹⁵N試料（‰）＝［（R試料/R標準物質）−1］×1000 R=¹⁵N/¹⁴N

となる．したがって，試料の同位体比 （¹⁵N/¹⁴N） が大気 中のN2より高い場合は 

δ

¹⁵Nは正の値を，低い場合は負 の値をとる．

15Nと¹⁴Nは電子状態は同じなので化学的性質がほぼ 同一であるが，¹⁵Nは¹⁴Nに比べて重いため，分子拡散 や酵素反応において環境中での挙動がわずかに異なる．

これは同位体効果あるいは同位体分別と呼ばれ，その効 果は反応経路や反応の程度によって異なってくる．ま た，化学反応の結果できる生成物の同位体比は反応前の 基質の同位体比を反映したものとなる．つまり，生成物 の同位体比は基質の同位体比と反応経路の両方について の情報を併せ持つことになり，同位体比を知ることによ

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り起源物質や生成プロセスを推測することが可能とな る．

N2Oの生成プロセスを議論する場合，N2Oの同位体比 の結果のみから生成プロセスを解析するのは困難であ る．たとえば，

δ

¹⁵N＝−30‰のアンモニウムが硝化に よって＋30‰の同位体分別が起こった場合と，

δ

¹⁵N＝

−10‰の硝酸イオンが脱窒によって10‰の同位体分別 が起こった場合を比較すると，両者とも生成したN2O の 

δ

¹⁵Nは0‰となり，区別がつけられない（図1_a）．こ のため，基質となりうる物質の同位体比や濃度など，

ターゲットとするN2O以外の情報を収集する必要があ る．

アイソトポマーとは

同位体 （isotope） が原子を対象とした概念であるのに 対して，アイソトポマー（isotopomer；同位体分子種）

は同位体組成が異なる分子を対象とした概念である．こ れは，これまで問題にされなかった原子の分子内での配 置がアイソトポマーの議論では区別されることを意味す

る．N2Oの場合，図2に示した5種類のアイソトポマー が主に存在する．N2OはN‒N‒Oの順番で並ぶ非対称の 直線分子であるため，中央（

α

 位）の窒素原子と末端

（

β

 位）の窒素原子は区別可能である．このN2O分子内 の2つの異なる窒素原子の同位体比の差 

δ

¹⁵Nα−

δ

¹⁵Nβ を サイトプレファランス （site preference ; SP） と定義す る．N2Oの2つの窒素原子はどちらも同じ基質を起源と する一方，SP値は生成プロセスに固有の値をとるため，

N2Oの同位体比のみから生成プロセスを議論することが 可能となる^（5）．前述した硝化と脱窒では，硝化によって 生成したN2OのSP値はおよそ33‰となるのに対し，脱 窒によって生成したN2OのSP値はおよそ0‰となるた め，N2OのSP値を測定することで，生成プロセスのみ を議論することが可能となる（図1b）．

N2Oアイソトポマー分析の実際

1.  質量分析法

N2Oの窒素・酸素安定同位体の測定方法としては，こ れまで質量分析法が主流であった．質量分析法は，まず 液体窒素でN2Oが濃縮された後，ガスクロマトグラ

N O

α β

酵素反応による

同位体分別 +30

N

N N O

N N O

N N O

+10 基質のδ¹⁵N(‰) -30 -10

N₂O のδ¹⁵N_bulk(‰) -30+30 = 0 -10+10 = 0 区別できない NH₄⁺

NH₄⁺ NO₃^-

+46.5 +10

基質のδ¹⁵N(‰) NH₄⁺ -30 NO₃^- -10 酵素反応による

同位体分別

α β

+13.5 +10

N₂O のδ¹⁵N_α(‰) -30+46.5 = 16.5 -10+10 = 0

区別できる N₂O のδ¹⁵N_β(‰) -30+13.5 = -16.5 -10+10 = 0 N₂O の SP(‰) 16.5-(-16.5) = 33 0-0 = 0

硝化 脱窒

(a)N₂O のα位とβ位を区別できない場合

（b)N₂O のα位とβ位を区別できる場合

図1■硝化と脱窒で生成されるN2Oの同位体比の例

（a） N2Oの α 位と β 位を区別できない場合は，δ¹⁵Nbulk（平均値）

の情報しか得られないため，硝化由来のN2Oと脱窒由来のN2Oを 区別できない．（b） N2Oの α 位と β 位を区別できる場合は，α 位 と β 位の δ¹⁵N値を区別可能なため，硝化由来のN2Oと脱窒由来の N2Oを区別できる．

14

N

14

N

¹⁶

O

15

N

15

N

¹⁴

N

¹⁶

O

14

N

¹⁶

O

14

N

14

N

¹⁷

O

14

N

14

N

¹⁸

O

β α

図2^■5種類のN2Oアイソトポマー

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フィー （GC） で同じ質量をもつCO2と分離され，質量 分析機に導入される．N2Oが真空中でイオン化される と，電荷数あたりの質量の比  / が 44, 45, 46 の5つの イオン（¹⁴N¹⁴N¹⁶O^＋, ¹⁴N¹⁵N¹⁶O^＋, ¹⁵N¹⁴N¹⁶O^＋, ¹⁴N¹⁴N¹⁷O^＋, 

14N¹⁴N¹⁸O^＋） が生成される．これらのイオンに一定の電 圧をかけて加速したのち適切な強さの磁場をかけること により，各イオンはそれぞれの  /  に応じた曲率半径 の弧を描く．分離したイオンを適切な位置に設置された イオンコレクタでイオン強度を測定することにより各イ オンの存在比を求めることができる（図3_{）．ここでは，}

46/44の比から 

δ

¹⁸Oが，また45/44の比から 

δ

¹⁵Nbulk（2 つの窒素原子の同位体比の平均値）が求められる．

δ

¹⁷O は ¹⁸O/¹⁶O比と一定の関係にあることが多く，46/44の 比から求められる．また，N2Oがイオン化される際に一 定の割合で末端の 

β

 位にある窒素原子が取り除かれ，

NO^＋フラグメントが生成される．このときに生成される イオンは  /  が30, 31, 32の（¹⁴N¹⁶O^＋, ¹⁵N¹⁶O^＋, ¹⁴N¹⁷O^＋, 

14N¹⁸O^＋） であり，31/30の比から 

δ

¹⁵Nα が求められる．

SP＝2 （

δ

¹⁵Nα−

δ

¹⁵Nbulk） の関係があるので，先に求め た 

δ

¹⁵Nbulkと 

δ

¹⁵Nα からSPが求められる．これまでN2O アイソトポマー質量分析には  /  が30, 31, 32, 44, 45,  46のそれぞれの質量に応じた位置に設置されたイオン コレクタを用意する必要があり，N2Oアイソトポマー質 量分析に特化した高額な質量分析機を要したが，筆者ら

が開発したトラップ温度コントローラーで微妙な温度調 整を行い，N2, O2などのN2O分子またはNO^＋ フラグメ ントと重複する成分を取り除くことにより，比較的安価 な質量分析機に採用されるさまざまな質量に対応可能な ユニバーサルコレクタでもN2Oアイソトポマーの高精 度分析に対応できるようになってきている．

2.  レーザー分光法

一方，レーザー分光法では，アイソトポマー分子ごと に特有の赤外線吸収波長をもつことを利用する．N2Oは 赤外線領域に分子内振動に起因する特性吸収をもち，そ の吸収波長は質量や原子の並び順でそれぞれ異なるの で，N2Oの5種類のアイソトポマーはそれぞれ特有の吸 収波長をもつことになる．反射鏡を有するフローセル内 に試料を連続的に導入し，セル内に赤外線レーザー光を 照射すると，セル内でレーザー光が繰り返し反射する．

その間に特定の波長が吸収され，アイソトポマー分子ご とに異なる吸収波長をもつ赤外線吸収スペクトルが得ら れる．その吸収強度を測定することによって安定同位体 比を測定する．レーザー分光法はこれまでCO2 濃度や 同位体比の測定など，比較的高濃度の気体を測定するた めに使われてきたが，最近になってN2O同位体のよう な低濃度の気体を測定するための技術が飛躍的に発展し つつある．レーザー分光法には使用する波長帯や吸収強 度の測定方式の違いによってCDRS方式，QCL方式，

Off-Axis ICOS法などが存在するが，ここでは割愛す る．

N2Oアイソトポマー測定技術のこれから

同位体分析のための質量分析機については高精度の機 器が数十年前から実用化されており完成度が高い技術で ある．しかしながら試料を質量分析機に導入するための 前処理が煩雑であったため，近年は試料前処理技術の簡 素化，自動化など，簡単かつ多量に測るための技術が発 達してきており，今後もこのような流れが続くと思われ る．一方，レーザー分光法によるN2Oの同位体分析は ごく最近になって急速に発展しつつある手法で，温度依 存性や長時間測定時に測定値が安定しないなど，装置と しては未完成の部分も多いが，今後の改善が期待され る．質量分析法は精度が高いが，サンプリングは基本的 に手動で，かつ1点の分析に数十分から2時間程度要す るため，分析点数が稼げないというデメリットがある．

一方，レーザー分光法は低濃度域での精度は低いもの の，時間分解能が高く，サンプルガスを連続的に流すこ

44 45 46 N₂O⁺

30 31 32 NO⁺

イオンコレクタ イオンソース

e^- N₂O⁺

NO⁺ GC

N₂O

液体窒素 N₂O 試料

図3^■GC-IRMSの概略図

GCでN2O成分を精製・分離した後，イオンソース部でイオン化 し，磁力によって質量の異なるイオンを分離し，各イオンコレク タで検出する．N2Oアイソトポマー分析の場合，まず  / が45 のN2O^＋イオンが中央のイオンコレクタで補足されるよう磁場の 強さを調整し， / が44, 45, 46のイオンの存在比を求める．次に 

/ が31のNO^＋フラグメントイオンが中央のイオンコレクタで 補足されるよう磁場の強さを変えて  / が30, 31, 32のイオンの 存在比を求める．両端のイオンコレクタは広範囲の  / に対応で きるよう幅が広い構造になっている．

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とによって秒単位での変化を観察することが可能であ る．またレーザー分光法の装置は比較的コンパクトで，

圃場などの野外や船舶などでの測定が可能な設計がなさ れている．このように両者の利点，欠点はそれぞれ異な るため，大気サンプルや圃場などの比較的濃度が低い フィールド上のサンプルについては質量分析法で，また 微生物や土壌の培養実験などの濃度が高く，同位体比が 急激に変動するようなサンプルについてはレーザー分光 法で測定するなど，用途に応じて使い分ける，あるいは 組み合わせて使う方法が主流となってくると思われる．

土壌圏からのN2Oの発生経路は前述のように多様で あるため，N2O発生経路を把握することが重要である．

そのために，より正確に発生経路を把握できるN2Oア イソトポマーの分析技術の発展と普及が期待される．

文献

  1）  P.  Forster  &  V.  Ramaswamy :“Climate  Change  2007 :   The Physical Science Basis. Fourth Assessment Report  of  the  Intergovernmental  Panel  on  Climate  Change,” 

Cambridge University Press, 2007, p. 131.

  2）  A.  R.  Ravishankara,  J.  S.  Daniel  &  R.  W.  Portmann :   , 326, 123 （2009）.

  3）  P.  Smith  &  D.  Martino :“Climate  Change  2007 : Mitiga- tion. Fourth Assessment Report of the Intergovernmen- tal  Panel  on  Climate  Change,”  Cambridge  University  Press, 2007, p. 499.

  4）  M.  Hayatsu,  K.  Tago  &  M.  Saito : ,  54, 33 （2008）.

  5）  木庭啓介： 流域環境評価と安定同位体 ，永田 俊，宮

島利宏編，京都大学学術出版会，2008, p. 388.

（中島泰弘，農業環境技術研究所）

プロフィル

中島 泰弘（Yasuhiro NAKAJIMA）  

＜略歴＞1993年東京工業大学理学部生命 理学科卒業／1998年同大学大学院生命理 工学研究科バイオサイエンス専攻博士課 程修了／同年農林水産省（現 農業環境技 術研究所），現在に至る＜研究テーマと抱 負＞安定同位体を用いた生態系における窒 素循環過程の解析，安定同位体分析技術の 開発・改良＜趣味＞スキー，アウトドア，

音楽，ポタリング（自転車で散歩），ゲー ム