822 化学と生物 Vol. 53, No. 12, 2015
古典的分析化学手法の現代天然物化学研究への活用
溶液内イオン平衡を使いこなす
最初にピロリン酸（PPi）の比色分析とその応用例と してのアデニル化酵素のアッセイ法を紹介する．モリブ デン酸がほかの酸素酸を取り込んで有色のヘテロポリ酸 を生成する反応は，古くからオルトリン酸（Pi）の分析 法などとしてよく知られている．他方，PPiは酸性条件 下の有機溶媒‒水混合溶媒中において黄色の18-モリブド ピロリン酸（［（P2O7）Mo18O54］4−）を生成することから，
PPiを比色定量できる（図
1
a）．この反応を利用すれば，アミノ酸のアデニル化酵素（図1b）のようにATPを消 費してPPiを生じる酵素活性を測定することが可能であ
る(1〜3)．その操作法は，まず，反応液にアセトニトリル
とモリブデン酸を加え［（P2O7）Mo18O54］4−を生成させた 後，4級アンモニウムとの沈殿を得る．これをアセトニ トリルないしはプロピレンカーボネートに再溶解しアス コルビン酸を加え還元すると，8電子還元体となり判別 が容易な青色を呈する（図1b）．一方，反応液に残存し たATPは，モリブデン酸を加えた際に非酵素的に微量 のPiを放出し［（PO4）Mo12O36］3−を生じるが，この生成 反応とアスコルビン酸による還元反応は比較的遅いため
Piによるバックグラウンドは無視できるほど小さい．
また，アデニル化酵素の反応液にヒドロキシルアミンを 加えることで逆反応を抑制でき（不可逆的にacyl- - AMPよりヒドロキサム酸を生じる），高感度に酵素活 性を測定できる．従来，この種の酵素活性測定は，リン の放射性同位体を利用したRI法に頼らざるをえなかっ たことから，本法を開発できた意味は大きいと考える．
次に，単糖の比色分析とそれを応用した糖化酵素・異 性化酵素の活性測定法について紹介する．上記のPPi アッセイで利用したように，黄色を呈するポリ酸を還元 することで青色のポリ酸を得ることができる．還元糖一 般の比色分析法としてよく知られるSomogyi法は，ア ルカリ性条件下で還元糖によってCu（II）をCu（I）とし た後，Cu（I）を還元剤として青色ポリ酸を生じる分析法 である．われわれは，たとえば，50 mM Na2SiO3, 600 mM Na2MoO4, 1.5 M CH3COOH（pH 4.9），30％ DMSO の組成からなる弱酸性条件下の溶液中に還元糖を加え，
70 Cで反応させると黄色のポリ酸種（この場合，12-モ リブドケイ酸，［（SiO4）Mo12O36］4−）が生成することを
図1■（a）PPi比色分析と（b）アデニル 化酵素アッセイ
今日の話題
823
化学と生物 Vol. 53, No. 12, 2015
見いだした．さらに，単糖であれば比較的速くMo（VI）
種を直接還元して青色ポリ酸を生成する．従来の還元糖 の化学的分析法は，所定の時間，反応液を煮沸する必要 があるものや，操作に熟練を要するものが多いが，本法 の操作は極めて簡便であり再現性が高いことが利点であ る．本法のグルコースに対する感度は，デンプンのみな らずマルトース，セロビオースといった二糖のそれより も格段に高く，デンプンまたはセルロースをグルコース にまで分解する糖化酵素のハイスループットスクリーニ ングに適用できる(4)．また，酸および有機溶媒の濃度な ど溶液条件の調整によりフルクトースの感度をグルコー スの20倍程度に向上でき，グルコースを基質としたグ ルコースイソメラーゼの活性測定にも適用可能とな る(5)．
つづいて，
ε
-ポリ-L-リジン（ε
PL）の検出への本手法 の利用も興味深い．ε
PLは，25〜35残基のL-リジンが直 鎖上につながったポリカチオン性ホモポリアミノ酸であ り放線菌によって生産される．ε
PLの定量法として，ア ニオン性色素であるメチルオレンジとの沈殿生成反応を 利用するものがあるが，ε
PLに対し特異的かつ定量的に 反応し，感度良く分析できる沈殿試薬は知られていな かった．［（SiO4）Mo12O36］4−は，酸性条件下でも多価ア ニオンとして存在するが，その表面電荷密度は低く疎水 性である．このため，酸性条件下でε
PLを定量的に沈 殿させることができ，これを利用したε
PL合成酵素の アッセイが可能となる(6)．また，同法はポリカチオン性 のβ
-リジンペプチドを有する抗生物質ストレプトスリ シンの合成酵素アッセイにも適用できることから(7)，よ り強力な抗菌活性が期待できる長鎖β
-リジンペプチド のストレプトスリシンを合成できる変異型合成酵素のスクリーニングに利用できる．また，塩基性ポリペプチド 抗生物質の分析にも有用と考えられる．
最後に，以上述べてきた溶液内イオン平衡を応用し，
溶液での操作のみによる天然有機化合物の単離精製につ いて紹介する．一般に，天然物化学の研究において，対 象物の単離精製はカラム精製に頼る場合が多いが，通 常，時間がかかりその収率も乏しい．一方，沈殿生成反 応，再溶解，イオン交換反応などを組み合わせた，いわ ば溶液操作のみによる天然物の精製方法を用いることが できれば，簡易で迅速な単離精製法となる．テトラフェ ニルボレートアニオン（TPB−）は，古くからK＋や NH4＋イオンの沈殿試薬として用いられてきたが，ポリ カチオン性の
ε
PLも定量的に沈殿回収できることを見 いだした．これを培養液に添加すれば，ε
PLだけでなく NH4＋イオンなどとの混合沈殿が得られるが，その沈殿 物にアセトンを加えると，1価や2価のカチオンとの塩 はこれに易溶であるのに対し，高分子電解質であるポリ カチオン性のε
PLとTPB−との塩は難溶のため遠心分離 により単離できる．そして，これに塩酸を加えれば TPB−はベンゼンとトリフェニルボランに分解するた め，この混合物を有機溶媒に加えれば，高純度のε
PLが 塩酸塩として析出し，回収できる．本法は，遠心操作を 主として30分程度で操作が完結するため(8)，マイクロ プレートを用いるε
PLの同定が可能である．また，本 法は，4〜15残基程度の短鎖長ε
PLの単離精製にも利用 でき，このような短鎖長ε
PLを生産する菌株のスクリー ニングにも応用利用できた(9)．さらに，本法は，ほかのポリカチオン性の天然物にも 適用できる．たとえば，オリゴキトサンはビス（2-エチ ルヘキシル）リン酸アニオンと水に難溶の沈殿を形成す
図2■Soyaponin Bbの単離精製
今日の話題
824 化学と生物 Vol. 53, No. 12, 2015
るが，この沈殿をエタノールと接触させると，四量体以 上の塩が溶解する．このエタノール画分に塩酸を加えれ ば，同オリゴキトサンを塩酸塩として得ることができ る．同法はキチンを含む粗精製物からの単離に適用で き，キチンキトサン化学の研究分野に有用なオリゴキト サン試料を与えている(10)．
これら疎水性イオンとの沈殿生成反応を利用する手法 は，従来精製が難しいとされる強極性天然有機化合物に 関する研究のブレークスルーとなり，また，低コストで の精製にも寄与すると考えられる．なお，溶媒抽出のよ うに，溶質と溶媒との相互作用に基づく分離法は天然物 化学の分野でも古くから行われてきたが，最近，われわ れは有機溶媒‒水混合溶媒への溶解性の違いに基づき，
心血管系保護作用などが報告されている大豆サポニンの 粗精製物から生体利用性が良好で大豆中の含量も高いソ ヤサポニンBbが簡単に単離できることを示した(11)．同 粗精製物はソヤサポニンBbを10 wt％程度含むが，ほか のソヤサポニン（Aa, Ab, and Ba）も含まれる．従来の カラム精製では，これを出発物質としても，ソヤサポニ ンBbを得るのに2週間の期間を要し，また精製収率は 5％程度と容易ではなかった．一方，本法では，まず出 発物質を3 : 7（v/v）アセトン‒水で洗浄することで，主 としてソヤサポニンBbおよびBaを含む沈殿を得た後，
次に，この沈殿を1 : 1（v/v）アセトン‒水と混合する と，ソヤサポニンBbがいくぶん溶解する一方，ソヤサ ポニンBaの多くはこの混合溶媒に溶解できない．その 上澄みに大過剰の純水を加えて生じた沈殿を回収するこ とで，90 wt％純度のソヤサポニンBbを得ることができ る．本法の収率は30％であるが，全操作を30分程度で 完了できる優れた手法と言える（図
2
）．以上，簡単ではあるが，天然物研究のための溶液内イ オン平衡に基礎を置く分離・分析法のいくつかを記し た．これらの構築は分析化学者と共同で行い，個々の研 究における目的にかなうよう，古典的分析法を選択し，
溶液条件の最適化を試みたものである．また，その過程 で，ここで取り上げた天然物の新しい応用や物性研究法 も見いだされているが，これらは後日項を改めて述べた い．いずれにせよ，本稿が天然物化学における分離・分 析の方法論に新たな視点を与えられれば幸いである．
1) H. Katano, R. Tanaka, C. Maruyama & Y. Hamano:
, 421, 308 (2012).
2) H. Katano, H. Watanabe, M. Takakuwa, C. Maruyama &
Y. Hamano: , 29, 1095 (2013).
3) H. Katano, K. Uematsu, C. Maruyama & Y. Hamano:
, 30, 17 (2014).
4) H. Katano, S. Taira, K. Uematsu, H. Kimoto & Y. Hama- no: , 29, 1095 (2013).
5) H. Katano, M. Takakuwa, T. Itoh & T. Hibi:
, 79, 1057 (2015).
6) H. Katano, C. Maruyama & Y. Hamano:
, 16, 542 (2012).
7) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M.
Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano:
, 8, 791 (2012).
8) H. Katano, T. Yoneoka, N. Kito, C. Maruyama & Y. Ha- mano: , 28, 1153 (2012).
9) Y. Hamano, N. Kito, A. Kita, Y. Imokawa, K. Yamanaka,
C. Maruyama & H. Katano: ,
80, 4993 (2014).
10) H. Katano, A. Fujiwara & H. Kimoto:
, 2, 75 (2014).
11) H. Katano, N. Okamoto, M. Takakuwa, S. Taira, T. Kam- be & M. Takahashi: , 31, 85 (2015).
（濱野吉十，木元 久，高橋正和，片野 肇，福井県立 大学生物資源学部）
プロフィル
濱野 吉十（Yoshimitsu HAMANO）
＜略歴＞2002年富山県立大学大学院工学 研究科博士課程修了／同年アリゾナ大学博 士研究員／2003年福井県立大学生物資源 学部助手（助教）／2008年同講師／2011年 同 准 教 授／2015年 同 教 授，現 在 に 至 る
＜研究テーマと抱負＞天然有機化合物の生 合成研究＜趣味＞自転車
木 元 久（Hisashi KIMOTO）
＜略歴＞1996年福井医科大学大学院医学 研究科博士課程修了／同年同大学医学部生 化学第一講座助手／2006年福井県立大学 生物資源学部助教授／2012年同教授，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞糖質分解微 生物の有効利用に関する研究＜趣味＞ソル トルアーフィッシング
高橋 正和（Masakazu TAKAHASHI）
＜略歴＞1990年京都大学農学部食品工学 科卒業／1995年同大学大学院農学研究科 博士後期課程修了（農学博士）／同年岡崎 共同研究機構基礎生物学研究所非常勤研究 員／1999年福井県立大学生物資源学部助 手／2006年同講師／2012年同准教授＜研 究テーマと抱負＞食素材由来機能性化合物 の単離・解析＜趣味＞自然鑑賞
今日の話題
825
化学と生物 Vol. 53, No. 12, 2015
片 野 肇（Hajime KATANO）
＜略歴＞1994年神戸大学大学院自然科学 研究科博士課程修了／同年福井県立大学生 物資源学部助手／1997年同講師／2005年 同助教授／2007年同准教授／2011年同教 授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞天然 有機物の単離精製法，比色分析とHTアッ セイ＜趣味＞洋楽
Copyright © 2015 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.53.822
