化学の 窓
qHNMR の食品添加物 分析への応用
核磁気共鳴（NMR）は，スペクトル上の共鳴シグナル の化学シフトやシグナルの多重度，分裂幅，面積強度な どを通じて測定対象化合物に関する多種多様な構造情報 を与える．またNMRは測定対象化合物を非破壊で分析 できることから，天然化合物，化学合成品などさまざま な有機化合物の構造決定などにおける重要なツールとし て広く使用されている．さらに近年では，超伝導マグ ネットの高磁場化，プローブの改良などに伴い，定性に とどまらず定量における実用的な分析技術とも考えられ るようになっている．特に1H核はほかの核種と比較し て感度や汎用性の面で優れていることから，1H NMRを 用いた天然抽出物や食品に含まれる成分の定量分析など への利用が増えてきている（1）．本稿では， 1H NMRによ る内標準法（quantitative 1H NMR；qHNMR）を使っ た加工食品中の食品添加物分析について，その研究の一 端を紹介する．
加工食品中の食品添加物分析の現状
日本では食品添加物の安全性や品質を確保する目的 で，食品添加物の性状，含量（純度）などの成分規格や 食品添加物を使用できる食品の種類，使用量などの使用 基準などが設定され，第8版食品添加物公定書に記載さ れている．これに伴い，食品添加物の純度や食品中の食 品添加物の使用量に関して規格，基準が守られているか を監視するための分析法が定められている．このうち，
食品中の使用量を試験するための分析法 （いわゆる食 品中の食品添加物分析法）では，測定対象物質を食品か ら抽出，精製した後，ガスクロマトグラフィー，液体ク ロマトグラフィーなどを用いることが多いが，試料に よっては煩雑な前処理などを必要とする場合が多い．ま た，定量には対象化合物と同一かつ純度が正確な標準物 質が必要であるが，計量学的に妥当な手順によって純度
が算出され，その不確かさが明確な認証標準物質は非常 に少ない．このため，各種クロマトグラフィーによる定 量分析では，試薬メーカーの定量用標品が一般的に利用 されている．しかし，この純度は自社規格により保証さ れたもの，すなわち計量学的に正確とは言えず，結果と して分析値の信頼性が損なわれる可能性を否定できない．
そこで，筆者はこれらの問題を解決する方法の一つとし て，qHNMRの利用が有効と考えた．
qHNMRとは
qHNMRは，2つの化合物間のシグナル面積強度（積分 値）比が「各化合物のモル濃度×各置換基上の水素数」
に比例する原理を利用した定量法である． NMRは原子 核を対象に測定を行っているため，これら2つの化合物 は同一の化学構造である必要はない．したがって，濃度 や純度が明確な一つの標品を内標準物質として用いるこ とにより，内標準物質と測定対象化合物のシグナル面積 強度比，水素数，秤量濃度の関係から，さまざまな測定 対象化合物の含量や純度を求めることが可能である（2, 3）
（図1）．
qHNMRで精確な定量を行うためには，シグナル面積 強度を正確に得ることが重要である． 通常1H NMRで は，構造解析のために積算効率すなわち測定の迅速性や / （感度）の向上に重点をおいて測定することが多い．
しかし，この測定条件は水素の数に比例した正確なシグ ナル面積強度を示さないことから，定量分析には不向き と言える．Sugimotoら（4）やIharaら（5）は，十分なパルス 繰り返し時間やポイント数（デジタル分解能）の設定，
データ取り込み中の13C核のデカップリングなど，定量 用に最適化された測定条件を確立し，その条件を用いた qHNMRの実例を報告している．また，最近では測定結 果の計量計測トレーサビリティを確保するため，内標準
物質として認証標準物質を用いたqHNMRが報告され た（6）．一般に，市販されている認証標準物質の数は非常 に少ないため，測定対象化合物と同一の標準物質を必要 とする各種クロマトグラフィーでの利用には限界がある．
qHNMRでは，その測定原理から，一 つの認証標準物質を 利用することでさまざまな測定対象化合物の国家標準へ とつながる定量値を得ることができ，定量値の信頼性の 向上に大きく貢献できる．このような特徴から，qHNMR は，残留農薬試験用標品や日本薬局方試薬の純度分析（7, 8）， 生薬や既存添加物中の主要成分の含量分析（9〜11）へ利用 されている．また， 2011年以降に食品添加物として指定 されたフルジオキソニル，アゾキシストロビン，ピリメ タニルの定量法（食品添加物の純度分析）で使用する定 量用試薬の純度分析法としてqHNMR法が採用されるな ど，本法の公的な試験法への導入も進みつつある（12〜14）．
加工食品中の食品添加物分析へのqHNMRの利用 に向けて
このように，qHNMRは，測定対象物質の絶対量の算 出が可能な方法で，その分析値は計量学的に正確である ため信頼性は高い．さらに，qHNMRは食品を対象とし た分析において表1に示す特徴を有している．
それゆえ，qHNMRを食品中の食品添加物分析へ利用 すれば，食品添加物の使用基準の評価における分析値の 計量計測トレーサビリティが確保され，国民の要望が高 い食品添加物の安全の一層の確保に貢献できると考えら れる．こうした背景から，筆者はqHNMRを用いた食品 中の食品添加物分析法の確立に関する検討を行っている．
ここからは，加工食品中のソルビン酸分析を例に，性能 評価や妥当性確認など分析法の確立における一連のプロ セスを概説する．
qHNMRを用いた加工食品中のソルビン酸分析（15）
1. ソルビン酸標品のqHNMR測定
ソルビン酸は，保存料として使用される食品添加物で あり，日本ではチーズ，魚肉ねり製品，みそ，マーガリ ンなどへの使用基準が設けられている．これらの加工食 品中のソルビン酸をqHNMRで分析するにあたり，ソル ビン酸由来の各水素の化学シフトや定量に適用可能なシ グナルをまず確認しておかなければならない．そこで，
市販のソルビン酸標品について定量用測定条件で1H NMR 測定を行った．なお，化学シフト値は，定量用内標準物 質であるDSS- 6のメチルプロトンシグナルを基準（
δ
0 ppm）とし，δ
値をppm単位で表した．図2には，ソル ビン酸の代表的な1H NMRスペクトルを示した．測定溶媒としてDMSO- 6を使用したとき，
δ
1.84 ppm（水素数3），
δ
5.79 ppm（水素数1），δ
6.26 ppm（水素 数2），δ
7.18 ppm（水素数1）およびδ
12.2 ppm（水素 数1）にソルビン酸に由来するシグナルがそれぞれ観察さ れた．これらのうち，δ
12.2 ppmのシグナルはカルボン酸 のヒドロキシ基に由来するが，このような交換性のプロ トンシグナルは正確なシグナル面積強度を算出できない 恐れがあり，定量には不適と考えられる．また，ほかの 表1■食品分析におけるqHNMRの特徴とそのメリット特徴 メリット（従来法との比較）
1 検出手法が化合物の物性値
（吸光や蛍光など）に依存し ない
たった一つの認証標準物質で さまざまな化合物の正確な絶 対定量が可能
2 検量線を必要としない 少ない前処理で夾雑物の影響 を受けずに定量が可能
●分析の迅速化，簡便化
●環境負荷の低減
（使用溶媒量の大幅な減少）
3 試料を密封状態で測定 ●装置が汚染しない
（LCやMSなどにおける検出 部の汚染，カラムの劣化なし）
●感度低下の防止 図1■qHNMRの原理
qHNMRは（A）に示すように原子核 を基準にした定量法であるため，一 つの標品で化学構造の異なるさまざ まな有機化合物を（B）に示す関係 式に基づいて定量することができる．
4種のシグナルのソルビン酸の含量値を比較したところ，
δ
6.26 ppmのシグナルからの含量値（99.7%）は，ほかの 3種のシグナルから得られる含量値（δ
1.84 ppm：99.2%,δ
5.79 ppm：99.3%,δ
7.18 ppm：99.0%）よりやや高めに 算出された．δ
6.26 ppm付近には，メチル基に隣接する 多スピン系のメチンプロトンシグナルおよびそれに隣接 する2スピン系のメチンプロトンシグナルが存在してい る．また，これらのシグナルは部分的に重なり合うとと もに左右に若干幅が広がったシグナルとして観察された．したがって，定量の際には，このシグナルの積分範囲が ほかのシグナルより若干広がるため，得られる含量値が 高めに算出されたと予想された．以上の結果や各シグナ ルの相対標準偏差を考慮すると，積分範囲が狭く，多重 度の小さい
δ
1.84 ppm，δ
5.79 ppmおよびδ
7.18 ppmの シグナルがソルビン酸の定量に適していると考えられた．2. 前処理および添加回収試験
加工食品中の食品添加物を分析する際には，抽出，精 製，場合によっては濃縮操作などの前処理操作が必要で
ある．このような操作は，食品や食品添加物の種類，性 状によってさまざまな方法が用いられており，ソルビン 酸の分析では主に水蒸気蒸留法が利用されている．しか し，この方法をqHNMRの前処理操作に利用することは 困難と考えられた．1H NMRでは，水を多く含む試料を 測定した場合，水由来の巨大なシグナルが測定対象のシ グナルの帰属や定量の妨害となる．したがって，この問 題を回避するためには，得られた留液を減圧乾燥させ，
完全に水分を除去した試料を調製する必要があるが，操 作に多くの時間を要することが予想された．そこで，筆 者は試験溶液に水が極力混入しない溶媒を用いてソルビ ン酸を効率的に抽出するため，ジエチルエーテルを用い た溶媒抽出法を前処理法として選択した． 次に，この 溶媒抽出法とqHNMRを組み合わせた分析法の真度，精 度を明らかにするため，ソルビン酸およびその塩類の使 用が認められている食品のうち，チーズなど12種類に ついて各食品の使用上限濃度および0.13 g/kg（乳酸菌 飲料では0.013 g/kg）で添加回収試験を行った．なお，
定量に際しては，定量に用いるシグナルの / 比や多重 図2■ソルビン酸の化学構造と1H NMRスペクトル
ISは内標準物質（DSS- 6）を示す．
図3■食品中のソルビン酸分析にお ける1H NMRスペクトルの一例
（A）ソルビン酸添加および無添加の さきいかより調製した試験溶液の1H NMRスペクトル．（B）ソルビン酸の 使用が表示されたソーセージより調 製した試験溶液の1H NMRスペクト ル．各スペクトル中の矢印は，定量 に用いたソルビン酸のシグナルを示
8 6 4 2 0 す．
IS
2.0 4.0 6.0
8.0 0 (ppm)
(A) (B)
IS
8 7 6 5 4 3 2 1 0
8 7 6 5 4 3 2 1 0
0
8.0 6.0 4.0 2.0
0
8.0 6.0 4.0 2.0
IS
(ppm) (ppm)
PPM
12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0
PPM
12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0
carboxy proton
H-4 H-2 and 3
H-5
H-1
IS
(ppm) 0 5
.
7 5.0 2.5
10.0 12.5
water solvent residual
signal 4(δH7.18)
6(δH12.2) 2(δH6.26)
3(δH6.26) 5(δH5.79) 1(δH1.84)
4(δH7.18)
6(δH12.2) 2(δH6.26)
3(δH6.26) 5(δH5.79) 1(δH1.84)
度のみならず，ソルビン酸由来のシグナルと夾雑物のシ グナルが十分に分離していることが非常に重要である．
今回の検討では，前項で示したシグナルのうち，さきい かおよび乳酸菌飲料では
δ
7.18 ppm，そのほかの食品で はδ
5.79 ppmのシグナルが，夾雑物のシグナルと十分に 分離していたため（図3（A）），これらを定量用シグナル として選択し回収率を算出した．その結果，両濃度での 各試料からのソルビン酸の回収率は80%以上，併行精 度（日内精度）は6.8%以下と良好であった．また，本 法の室内精度を明らかにするため，めんつゆおよびソー セージを対象に1日1回（2併行）の添加回収試験（各 食品の使用上限濃度および0.13 g/kg）を5日間行い得 られたデータの一元配置の分散分析により室内精度を算 出したところ，3.6 〜6.9%と良好な結果が得られた．3. ソルビン酸，ソルビン酸カリウムを含有する加工食 品の分析
次に筆者は，実際にソルビン酸やソルビン酸カリウム が使用されている市販食品への本法の適用性を明らかに するため，それらの使用が表示された5種の加工食品に ついて分析し（図3（B）），得られた結果を通知法（試料 溶液調製：水蒸気蒸留，分析：逆相HPLC）（16）と比較し た．その結果，ちくわ，シロップ，ジャムでは，本法は 通知法と同程度に正確な定量結果を与えることが判明し た．一方，さきいかやソーセージでは本法と通知法から 得られた結果に0.9 〜1.2倍の差異が認められたものの，
これは溶媒抽出と水蒸気蒸留におけるソルビン酸類の抽 出効率の違いが主な原因であることが確認され，添加回 収試験の結果を考慮すると，得られた両法の結果はほぼ 同等と考えられた． また，本法は通知法とほぼ同等の 真度，精度を有しながら，分析時間は1検体当たり最短 で55分と通知法（125分）と比べ迅速性に優れた方法で あることも確認された．なお，qHNMRにおいて，定量 に用いるシグナルの / 比が分析精度に大きく影響する ことが報告されている（17）が，筆者らの検討では / 比 が100以上あれば，1%の誤差範囲で精確な定量が可能 であることを確認している．今回のソルビン酸分析にお いて，定量に用いたシグナルは，この / 比をすべて 満たしているものであった．
以上より，今回確立した溶媒抽出法とqHNMRを組み 合わせた分析法は，食品中のソルビン酸の含量分析法と して有用であることが判明した．
おわりに
これまで述べたように，qHNMRは食品のような夾雑 成分を多く含む試料中の対象化合物を迅速かつ精確に定 量できる有用なツールの一つと言え，筆者は加工食品中 の保存料2種（安息香酸およびデヒドロ酢酸）（18, 19）や甘 味料の分析への適用性も明らかにしている．一方で，食 品添加物は，保存料，甘味料，着色料などを複数組み合 わせて加工食品へ使用されることが多い．qHNMRは，
定量シグナルが夾雑成分などほかのシグナルと十分に分 離していれば，化学構造の異なるさまざまな化合物を同 一の条件で分析することが可能である．したがって，対 象となる食品添加物に適した前処理操作を行うことで，
qHNMRは加工食品中の複数の食品添加物の一斉分析へ も応用できると考えられる．また，標品の存在しない食 品成分由来の分解物や酸化生成物などの食品中の含量測 定に対しても，本法はその威力を発揮するだろう．最近 では，qHNMR用の認証標準物質やデータ処理，解析，
定量値の計算などの一連の操作を一括で処理できるソフ トウェアが販売されるなどqHNMRが利用しやすい環境 が整備されつつあり，さまざまな有機化合物の定量分析 への適用拡大が期待される．なお，qHNMR測定を行う うえで，定量値の精確さを保証するためには，本稿で述 べた認証標準物質の利用や定量用に最適化された測定条 件の設定，適切な定量用シグナルの選択のほかに，試料 や標準物質の精密な秤量，十分なシム調整，データ解析 時の位相補正，ベースライン補正および積分区間の適切 な設定（20）などが重要である．これらの点に注意を払い ながらqHNMRを利用されることが望まれる．
文献
1） C. Simmler, J. G. Napolitano, J. B. Mcalpine, S.-N. Chen &
G. F. Pauli : Curr. , 25, 51（2014）.
2） N. Sugimoto, M. Tahara, T. Suematsu & T. Miura : , 53, J-228（2012）.
3） 合田幸広：医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，
44，753（2013）.
4） N. Sugimoto, A. Tada, T. Suematsu, K. Arifuku, T. Saito, T. Ihara, Y. Yoshida, R. Kubota, M. Tahara, K. Shimizu
: , 51, 19（2010）.
5） T. Ihara, T. Saito & N. Sugimoto : , 2, 12
（2009）.
6） T. Saito, T. Ihara, M. Koike, S. Kinugasa, Y. Fujimine, K.
Nose & T. Hirai : , 14, 79（2009）.
7） M. Tahara, N. Sugimoto, T. Suematsu, K. Arifuku, T.
Saito, T. Ihara, Y. Yoshida, A. Tada, R. Kubota, K. Shi-
mizu : , 16, 28（2009）.
8） J. Hosoe, N. Sugimoto & Y. Goda :
, 41, 960（2010）.
9） K. Hasada, T. Yoshida, T. Yamazaki, N. Sugimoto, T.
Nishimura, A. Nagatsu & H. Mizukami : , 65, 262（2011）.
10） A. Tada, K. Takahashi, N. Sugimoto, T. Suematsu, K.
Arifuku, T. Saito, T. Ihara, Y. Yoshida, K. Ishizuki, T.
Nishimura : , 51, 205（2010）.
11） T. Yoshida, K. Terasaka, S. Kato, F. Bai, N. Sugimoto, H.
Akiyama, T. Yamazaki & H. Mizukami : , 61, 1264（2013）.
12） 平成23年厚生労働省告示第307号 13） 平成25年厚生労働省告示第45号 14） 平成25年厚生労働省告示第268号
15） T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto, H. Akiyama & Y.
Kawamura : , 734, 54（2012）.
16） 厚生労働省医薬食品局食品安全部基準審査課長通知 「食 品中の食品添加物分析法」の改正について 平成22年5 月28日，食安基発0528第4号．
17） F. Malz & H. Jancke : , 38, 813
（2005）.
18） T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto, H. Akiyama & Y.
Kawamura : , 99, 342（2012）.
19） T. Ohtsuki, K. Sato, N. Sugimoto & H. Akiyama : , 141, 1322（2013）.
20） 山﨑太一，齋藤 剛，三浦 亨，井原俊英：分析化学，
61, 963（2012）.
（大槻 崇，国立医薬品食品衛生研究所）
プロフィル
大 槻 崇（Takashi OHTSUKI）
＜略歴＞2000年日本大学生物資源科学部食 品科学工学科卒業／2005年千葉大学大学院 医学薬学府博士課程修了／同年同大学大学 院薬学研究院助手／2007年同大学大学院薬 学研究院助教／2009年国立医薬品食品衛生 研究所食品添加物部研究員／2010年同研 究所食品添加物部主任研究官，現在に至る
＜研究テーマと抱負＞食品中の食品添加物 分析法の開発，改良に関する研究＜趣味＞
水泳，映画鑑賞，ウォーキング
