モノクローナル抗体の生薬研究への応用

(1)

【解説】

重要生薬の活性成分に対するモノクローナル抗体を作成し，

簡便かつ精確な分析法の開発，新抗体染色法であるイースタンブロットやノックアウトエキスの作成に成功．また，小型化抗体遺伝子による新育種法を確立した．

タンパク質などの高分子化合物に関わる研究を遂行するにあたり，モノクローナル抗体（MAb）なしでは研究の展開は不可能といっても過言ではなく，したがって数限りないMAbが市販されているのが現状である．しかし生薬成分のうち，低分子活性成分に対するMAbの作製例は20年近く前には皆無であったのでMAbの作製研究をスタートさせた．低分子化合物（ハプテン）自体は免疫されないためキャリアータンパク質と結合させる必要があった．しかしハプテン‒キャリアータンパク質の合成が必ずしも容易ではないケースも少なくない．また，ハプテン分子の結合数は動物へ免疫する場合たいへん重要なファクターとなるが，抗原であるハプテン‒

キャリアータンパク質コンジュゲート中のハプテン分子の結合モル数の確定法が確立されていなかった．このため免疫化の再現性が悪く，再現性の良好な方法が望まれ

ていた．そこでわれわれは matrix-assisted laser de- sorption-ionization TOF mass spectrometry （MALDI- TOF MS）を導入し，ハプテン‒キャリアータンパク質コンジュゲートの検出とそれによるハプテン数の確定方法を確立し，免疫化を確実なものとした．たとえば

の強心成分であるforskolin^（1）やアヘンアルカロイドであるコデインなど^（2）

，大麻の最も強い幻覚

成分である tetrahydrocannabinolic acid^（3）

，で成功し，

MAb作成の足がかりを作った．特に通常分析に手間がかかる薬理活性配糖体に的を絞り開発を進めてきた．現在までにステロイダルアルカロイド配糖体であるsola- margine^（4）

，

薬用人参のginsenoside Rb1^（5）, Rg1^（6）, Re^（7）, 甘草のglycyrrhizin^（8, 9）

，

サフランのcrocin^（10）

，

大黄・

センナの sennoside A^（11）, B^（12）

，

柴胡の saikosaponin a^（13）

，

芍薬のpaeoniﬂorin^（14）黄芩のbaicalin^（15）等配糖体，

また，黄連・黄檗のberberine^（16）

，

附子のaconitine^（17）

，

クソニンジン（）のartemisinin^（18）などに対するMAbを作製し，高感度のenzyme-linked im- munosorbent assay （ELISA）を確立した．また，そのほかの応用として「イースタンブロティング」と命名した抗体染色法（当初はウエスタンブロティングと仮称）

正山征洋

Application of Monoclonal Antibody in Pharmacognosical Field Yukihiro SHOYAMA, 長崎国際大学薬学部

(2)

を開発した^{（9, 19〜24）}

．さらに配糖体のワンステップ単離

が可能なイムノアフィニティーカラムを開発し，それにより抗原成分のみを除去した「ノックアウトエキス」の作製法を開発した^{（24〜28）}

．作製したMAbが蓄積される

につれて，小型化抗体（scFV）遺伝子をクローニングする例も増え，そのうちの一つの遺伝子をホスト植物へ導入し有効成分の高含有種の作出にも成功した^（29）

．こ

れらについて概説する．

MALDI-TOF MS によるハプテン数の確定

従来は紫外吸収による差スペクトル法によりハプテン数を測定していたが，判然としないのが実情であった．

そこで MALD-TOF MS を導入した．Forskolinの脱アセチル体と無水酒石酸を反応すると7-hemisuccinyl for- skolinを形成する．このものを -hydroxysuccinimide と1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimideで反応し活性化する．本化合物と牛血清アルブミン（BSA）

を反応してforskolin‒BSAコンジュゲートを合成した．

本コンジュゲートを分析したものが図

1

_である^（1）

_．分子

量の小さいピークは内部標準として加えたBSAである．

分子量の大きいピーク［M

＋H］

^＋がforskolin‒BSAコンジュゲートのピークである．両者の差が結合している forskolinの数に相当する．この結果，forskolinの結合数は11.5個と確定し，免疫化に十分なハプテン数であることを確認し，MAbを作製した．

高感度で再現性良好な競合的

ELISA

の開発甘草は70%以上の漢方処方に配合される最重要生薬の一つである．甘草には470種以上の化合物が確認されているが，それらの中で最も重要な成分はglycyrrhizin で抗炎症作用，抗腫瘍活性，抗エイズ活性など多様な薬理作用が報告されている．現状ではglycyrrhizinを抽出単離し肝炎や抗アレルギーの医薬品として薬用に供されている．このため日本薬局方でglycyrrhizin含量は2.5%

以上と規定されている．このように重要な甘草であるが，残念ながら100%輸入に依存している．総輸入量 2,000トン以上の大部分は中国からの輸入である．ところが近年中国の受給バランスが崩れつつあり，コンスタントな輸入が危ぶまれている．このため日本国内においても栽培を行う必要性が求められている．われわれは佐賀県玄海町でモンゴル産種子を用いたパイロット栽培をスタートしているが，最初にglycyrrhizin含量を測定しなくてはならず，抗 glycyrrhizin MAb によるELISA やELISAキット^（30）を用いて，1,200個体のglycyrrhizin 含量を測定した．この結果，5.5%を含有する株が1個体，4%台が5個体で，順次低含量株が増加しながら，

なだらかなカーブを描くことが明らかとなった．ちなみに最低含量株は0.2%であった．以上の結果を踏まえ，

5.5%含有株をクローン増殖し優良品種を作出することになる^（31）

．以上のような選抜育種研究や臨床研究にお

ける血清等多量のサンプルを分析するには前処理が不要で，迅速な分析が可能なELISAやELISAキットの使用が望まれる．

人参には特殊なダンマラン型トリテルペン骨格をアグリコンとする配糖体ginsenoside類が含まれており，多用な活性が見いだされている．2つの代表的な配糖体であるginsenoside Rb1（中枢抑制）とRg1（中枢興奮）

を選びMAbを作製しそれぞれの競合的ELISAを確立した．Ginsenoside Rb1 は20 〜 400 ng/mLの検量域で良好な直線性を示している^（5）

．Ginsenoside Rg1につても

ほぼ同様な結果が得られた^（6）

．いずれもginsenoside Rc,

Rdにわずかな交差反応性が見られるものの他の化合物には認められなかった．このことから2つのMAbは極めて特異性の高いMAbである．本法は従来のHPLCと良い相関をもつとともに何ら前処理を必要とせず，再現性良好で感度の面でもHPLCに比べ数百倍高いことが明らかとなった．なお，前述の各種配糖体類に対する MAbを用いてそれぞれの配糖体に対するELISAを確立し高感度分析を行っている．

図1^■MALDI-TOF MS によるforskolin‒キャリアータンパク質コンジュゲートの分析

親ピーク［M＋H］^＋がコンジュゲートである．親ピークと内部標準BSAの分子量の差からコンジュゲートに結合したハプテン数が算出できる．

(3)

ノーザン

-，サザン -，ウエスタンブロティングに次

ぐイースタンブロティングの開発と応用

高分子化合物に対するウエスタンブロティングは必須のツールであるが，低分子化合物に対しては不可能と考えられてきた．われわれはsolasodine配糖体に対してウエスタンブロティングに準じた染色に初めて成功し，当時はウエスタンブロティングと称していた．しかし glycyrrhizinに対する抗体染色をイースタンブロティングと命名し^（9）

，以後イースタンブロットが定着した．本

稿ではglycyrrhizinについて概説する．

2枚のTLCを用いて甘草粗エキスを -BuOH‒EtOAc‒

H2O系展開溶媒で展開する．1枚のTLCに吸着膜

（PVDF膜）を被い，ブロティング液を噴霧後120℃で1 分程度加熱することにより全成分が膜へと移行する．しかしこのままの状態だと洗浄操作中にサポニンは流失して発色するには至らない．そこで膜をNaIO4液と処理することによりglycyrrhizinの糖鎖を酸化的に開環する．

そこへタンパク質を加えシッフベースを形成し膜への吸着能を付与する．次に抗glycyrrhizin MAbで処理し，

標識2次抗体，基質を順次添加して反応することにより glycyrrhizinが発色することを見いだした^（8）

．図 2

_に本法の原理を模式化した．図

3

は各種甘草のイースタンブロティングと血清中のglycyrrhizinである．TLC上硫酸と加熱することによりすべての化合物が発色するが，

イースタンブロティングによるとglycyrrhizinのみが発色する．実は glycyrrhizin MAb は極めて特異性が高い．ところが本イースタンブロティングによるとglyc- yrrhizin （GC）のみでなく，glycyrrhizinからグルクロン酸が一つ脱離したモノグルクロニド（GG）も発色している．これはMAbが糖鎖の一部を認識していたにもかかわらずglycyrrhizinの糖鎖を開環したために，特異性がルーズになり交差性が広がったものと認識してい

る．

次に人参サポニンのイースタンブロットによる2重染色法を紹介する．人参サポニンにはプロトパナクサジオール系とプロトパナクサトリオール系があり，それぞれ特徴のある薬理活性を有しているので，各種人参の薬効を予測するためにもどちらの系のサポニンが多く含有するのかを調査する必要がある．また，資源探索を人参以外の植物に求める場合もある．このような場合，ジオール系とトリオール系サポニンそれぞれに対する MAbを作製しているので，標識2次抗体の標識酵素と基質を変えて染色することにより，異なる色彩のバンドが得られる．抗 ginsenoside Rb1 MAb と ginsenoside Rg1 MAb により基質を2種類用いて二重染色を行ったところ，ジオール系が青紫色でトリオール系が赤色に染色された^（21）（図

4

_）

．なお，左はシリカゲルTLCを硫酸

で発色したもので各ginsenosideによる発色の違いは認められない．右図の二重染色のプロファイルから次のような情報が得られる．①青紫色スポットはジオール系の ginsenoside類を示す．②赤色スポットはトリオール系のginsenoside類である．③ 値から結合している糖の数を類推することが可能．④人参の種類によってgin- senoside類の含量が異なっており，IV（田七人参）は ginsenoside Rg1 含量が高く，V（アメリカ人参）は ginsenoside Re が多い特異な人参で，VI（竹節人参）

はginsenoside類含量の低い人参である．以上の情報をもとに矢印を付けた3種のマイナーなginsenoside類についてその構造を推定した．赤色からいずれもアグリコンはプロトパナクサトリオールである．値が一番高いginsenosideは2糖であるginsenoside Rg1よりも糖の数が少ないことから，1糖のginsenoside Rh1と推定できる．真ん中のginsenosideは2つの糖をもっていることが容易に推察される．一番下の矢印は3糖をもつgin-

図2■イースタンブロティングの模式図

膜上でglycyrrhizinのグルクロン酸部分を過ヨウド酸酸化し開環する．

生じたアルデヒドとタンパク質が結合してシッフベースを形成し，膜への結合能を付与する．アグリコン部に抗 glycyrrhizin MAB が結合し，

このものにperoxidase標識2次抗体，

基質の順に添加して発色する．

(4)

senosideと言える．これらのデータと文献との比較検討から，上から ginsenoside Rh1, ginsenoside および 20-gluco-ginsenoside であると推察した．以上のように色彩と値を比較検討することによりいずれの系に属し，糖鎖がどれだけのサポニンであるかということが簡単に予測され，構造決定に費やすエネルギーが格段に少なくなるであろう．

もう一つの応用例は次のとおりである．新鮮な人参切片にPVDF膜を覆って溶出成分を吸着する．この膜を前記のとおり抗 ginsenoside Rb1 MAb を用いてイースタンブロティングした．Ginsenoside類は皮層部に多く，

中心の柔組織には少ないことがわかり，ginsenoside類の分布が如実に示されることが明らかとなった（図

5

_）

_．

人参のほかに大黄のsennoside類，属植物のso- lasodine配糖体，甘草のglycyrrhizin，柴胡のsaikosapo- nin類についても同様に配糖体の分布状況を知ることができる方法を開発した．

図3■Glycyrrhizinのイースタンブロティング

1は各種甘草のフィンガープリントである．左がTLCで右がイースタンブロティング．2はglycyrrhizinをラッテに投与後血清サンプルを時間の経過ともにチェックしたものである．

各種甘草および血清サンプルを TLC・硫酸により分析すると多くのスポットが発色してglycyrrhizinを確認することは困難である．一方，

イースタンブロティングではglycyr- rhizinのみが発色する．

図4■イースタンブロティングによる各種人参に含まれるgin- senoside類の二重染色

抗ginsenoside Rb1, Rg1を用いて二重染色したもので，プロトパナクストリオール系は紅紫色，プロトパナクサジオール系は青色に呈色する．I 〜 VIはそれぞれ，白参，紅参，毛人参，田七人参，アメリカ人参，竹節人参エキスを示す．

(5)

ノックアウトエキスの作製と応用

イムノアフィニティーカラムはリガンドと対象となる高分子化合物との親和性によってワンステップの分離が可能なことが特徴である．現在はいろいろな工夫がなされたイムノアフィニティーカラムが市販されている．後で触れるが，組換えタンパク質ではいろいろな標識

（タッグ）を施すので，それらのタッグに対する抗体を装着したカラムが作られている．一般に抗体の精製には Proteine G などのアフィニティーカラムが，酵素には補酵素や基質，阻害剤などのリガンドを装着したアフィニティーカラムが機能する．同様に抗原の精製には抗体が用いられるのは周知の事実である．とくにタンパク質の場合アミノ酸配列の一部に相当するペプチドを合成し，このものに対するMAbを作製して，このものをリガンドとし，目的とするタンパク質の精製に応用可能である．本稿では上記のように分子量の大きな化合物ではなく1,000以下の化合物について取り上げてみることにする．天然物一般にそうであるように多数の類似化合物が混在するため，精製には通常のカラムクロマトを繰り返すか，HPLC等で繰り返し精製・分取するほかに手だてがない．このような天然物の一例として甘草の有効成分glycyrrhizinについて触れる．

上記の抗 glycyrrhizin MAb をアガロースゲルに結合し，イムノアフィニティーゲルを作製，カラムに充填しイムノアフィニティーカラムを作製した．

甘草の粗エキスを上記のイムノアフィニティーカラム

に付しバッファー中で抗原抗体反応を行う．この間に glycyrrhizinはカラムの抗体部分へ結合する．一方glyc- yrrhizin以外の成分はカラムへ結合することはない．洗浄溶媒として調製した食塩含有リン酸バッファーで洗浄するとglycyrrhizin以外の成分が溶出する．次いでイソチオシアン酸カリとメタノールを含有する酢酸バッファーを溶出溶媒として溶出するとglycyrrhizinが溶出する．図

6

は甘草の粗エキスと洗浄溶媒で溶出したノックアウトエキスの比較である．甘草粗エキスには明らかにglycyrrhizinが存在するが，ノックアウトエキスには glycyrrhizinのみが除去されているのがわかる．一方，

溶出フラクションには，データは示していないが，

glycyrrhizinのみが溶出している．よってワンステップで純粋なglycyrrhizinが得られたことになる．Glycyr- rhizin投与後の血清中の含量は微量である．かかる場合もアフィニティーカラムによりglycyrrhizinを濃縮後 ELISAによる分析が可能である．なお，本カラムは10 回程度の使用による活性の低下は見られず連続使用を可能とする．

470種以上存在する甘草の成分の中から特定の成分を除去することは不可能であるが，本法ではglycyrrhizin のみをノックアウトすることが可能となった^{（28, 32）}

．本

ノックアウトエキスの応用について触れてみよう．LPS により活性化したRAW264細胞をツールとして，ノックアウトエキスを用いてNO産生に関わる成分探索を行った．Glycyrrhizin自体にはノックアウトエキスの産図5■人参スライスの抗 ginsenoside MAb によるイースタン

ブロティング

Ginsenoside類は皮層部に多く，中心部分の含量は少ない．

図6^■抗glycyrrhizinMAb結合immunoaﬃnityカラムによる glycyrrhizinノックアウトエキスの作製

Aは通常のTLCで1がglycyrrhizinのスタンダード，2が甘草粗エキス，3が洗浄フラクションでノックアウトエキス．3は甘草粗エキスからglycyrrhizinのみが除かれている．Bはイースタンブロティングで2の粗エキスにはglycyrrhizinが認められるが，3の洗浄フラクションにはglycyrrhizinは含まれていない．

(6)

生を抑制する働きはないが，glycyrrhizinにノックアウトエキスを添加することによりNO産生抑制が惹起された．この結果からglycyrrhizinと他の成分が相加作用を示していると解析した^（32）

．

一方，クロスリアクションの広いMAbを用いて関連化合物を濃縮することもある．たとえばインドネシア等でステロイドホルモンの原料として用いられているso- lasodine配糖体の場合，糖鎖には関係なくアグリコンである全solasodine配糖体を得ることが必要となる．このような場合は交差性の広いMAbを用いることにより全 solasodine配糖体を分離することが可能である^（33）

．

以上のとおり特異的な成分をターゲットとする場合は交差性の狭い特異的なMAbをデザインしなくてはならない．一方アグリコンを必要とする場合はアグリコン部のみを認識し糖鎖は認識しないMAbのデザインが要求される．本稿では紹介しないがMAb装着イムノアフィニティーカラムは光学分割にも威力を発揮する．また，

立体特異的な不斉合成等に抗体触媒が用いられているが^（34）

，

このような抗体を装着したイムノアフィニティーカラムは触媒反応と同時に分離カラムとしても応用可能であろう．われわれは立体異性体の例として大黄のsennoside A, B に対するそれぞれのMAbを作製し，

相互に立体特異性が極めて高いことを明らかにしている^{（11, 12）}

．

小型化抗体 single chain fragment-variable

（scFv）

の薬用植物育種への応用

先に交差性の広い代表として抗 solamargine MAb について述べたが，このもののscFvが先行しているので解説する．

抗 solamargine MAb 産生ハイブリドーマからRNA を抽出し，cDNAへ変換する．MAbの可変領域である vH, vL鎖をプライマーを用いてPCRで増幅する．両者を

リンカーペプチドにより結合し，大腸菌へ組換えscFv をクローニングする（図

7

_）

．scFv遺伝子の配列を確か

め，発現ベクターへ組み込みタンパク質の発現を行う．

封入体（インクルージョンボディー）として発現されるので，可溶化後アフィニティーカラムで精製しながら巻き戻し，活性のあるタンパク質とする．精製タンパク質はウエスタンブロティング，MALDI-TOF MS などで純度を確かめて，scFv遺伝子が確かなものであることを検証する．本scFvタンパクは抗 solamargine MAb と比較してほとんど同様な親和性をもっていることが明らかとなり，ELISAそのほかに威力を発揮する．

ホスト植物であるへ大腸菌に組

み込んだscFv遺伝子を直接導入することは不可能なため，大腸菌のscFv遺伝子をいったん

へ移し，をへ

感染することにより形質転換を行った．毛状根を生じたクローンを選抜し，scFv産生クローンを得る．それらのクローンを培養し，生産したscFvタンパク質を精製し，ウエスタンブロティングとMALDI-TOF MS により精製度と分子量を確認した．

一方，solasodine配糖体をELISAにより分析した結果，ワイルドタイプのにより感染して生じた毛状根に比べ，scFv遺伝子を導入した毛状根は2.5

〜 3倍のsolasodine配糖体を含有することが明らかとなった．また，scFvタンパク質の発現量とsolasodine 配糖体含量とを比較した結果両者は比例関係にあることが判明した^（33）

．このことから植物細胞内でscFvタンパ

ク質はハプテン分子と抗原抗体反応を行い，コンプレックスを形成する．このためハプテン分子が不活化され系外（おそらく液胞）へと移動し蓄積するものと考えられる．この結果solasodine配糖体の生合成経路が正の方向へ進むものと考えている．なお，毛状根から再分化した植物固体のsolasodine配糖体を分析した結果，やはりコ

図7■小型化抗体遺伝子の作製可変部分の VH, VL をそれぞれクローニングし，リンカーペプチド遺伝子で結合し，小型化抗体（scFv）遺伝子を作製する．

(7)

ントロールに比べ2.5倍以上の含量であった．

以上の結果は中和抗体治療に似ている．Her2抗原陽性乳がんに対する抗Her2抗体などが既に臨床応用されおり，また，抗インターロイキン-6 （IL-6）受容体モノクローナル抗体（トシリズマブ）を投与した関節リウマチ患者で治療効果ありとの臨床試験結果が出ており，今後種々の中和抗体治療薬が上市されるものと期待されている．以上のように中和抗体の臨床面での応用例が増加している現状にあって，薬用植物の育種研究に中和抗体の手法を取り入れるべく研究を進めている．

おわりに

MAbは前述のとおりハプテン‒キャリアータンパク質の合成方法により，交差性の広いMAbや極めて特異性の高いMAbを目的に応じてデザインすることが可能で，幅広い応用面をもつ興味深い分子と受け止めている．MAbの応用例として特異性が高く，再現性が良好で，前処理が不要な手法としてMAbを用いるELISAについて紹介した．つづいてサザン，ノーザン，ウエスタンに次ぐ4番目の染色法としてイースタンブロット法を開発した．この中で，2種のMAbを用いることにより，

二重染色が可能となり，発色と値により配糖体の構造を類推可能なことを示した．また，粗エキスから抗原分子のみを除去したノックアウトエキスの作製とその応用について概説した．今後漢方薬等の真の活性成分探索に本法が機能するものと考えている．scFv遺伝子をホスト植物へ導入することによりハプテン分子

（solasodine配糖体）の含量を増やすことが可能で，新しい育種方法として応用可能と考えている．多数の天然由来活性成分の生合成酵素遺伝子がクローニングされ，

有用な最終産物の含量を上げる努力がなされているが，

たとえば配糖体の場合，その生合成酵素自体が定かでないものがほとんどといっても過言ではない．今回開発した手法は酵素遺伝子の操作等は不要で，ターゲット分子のMAbのみが必要な至って簡便な育種方法と言える．

今後種々のMAbを用いて検証する予定である．また，

scFV遺伝子とハプテン遺伝子の両者を回収できる点にも魅力を感じている．

謝辞：本研究は九州大学薬学部の田中宏幸准教授を中心に大学院生，また現長崎国際大学薬学部の森永紀講師，宇都拓洋助教らにより推進されたものである．この場をお借りして深謝いたします．

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