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化学と生物 Vol. 54, No. 11, 2016
デジタル RNA シークエンシング
ゲノムワイドな 1 分子定量法
次世代シークエンサの登場により，それを用いた RNAシークエンシングが報告された(1)．その後，分子 バーコーディング法を用いたデジタルRNAシークエン シング（dRNA-Seq）が開発されている(2, 3)．本稿では，
世界的にも広がりつつあるdRNA-Seqの原理と応用・発 展について紹介する．
シークエンサは，従来，定性的な解析装置であった．
しかし，次世代シークエンサの開発により一度にたくさ んのDNAの配列を読むことが可能になり，どの配列を もつDNAが何分子あるのかを計数することで，定量装 置へと変革を遂げた．この定量性を利用している代表的 な手法の一つがRNAシークエンシングである(1)．一般 的なRNAシークエンシングでは，逆転写酵素を用いて RNAをcDNAにし，cDNAを増幅してその増幅産物を シークエンシングする．その後，各遺伝子（など）の配 列をもつcDNAの分子数を計数し，増幅前のRNAの分 子数を推定している．このような新しい方法が開発され ると，さまざまな用途に使われると同時にその問題点も 指摘され始めるが，RNAシークエンシングも同様であ る．増幅産物の量が増幅前のRNAの数に比例するとの 想定が，場合によっては成り立ちにくいことが指摘され てきた．これらは，配列に依存した増幅バイアスや，特 に少数コピーのRNAを定量する場合に注意が必要な増 幅ノイズの影響だと考えられている．
増幅ノイズやバイアスの影響を受けにくい方法，
dRNA-Seq（図1） が，Taipale博 士 とLinnarsson博 士 の共同研究グループと筆者らにより独立に報告され
た(2, 3)．この方法では，それぞれ異なる分子バーコード
（DNA配列）を各RNA（またはcDNA）分子に付加す る．この際，高い確率で互いに異なる配列を各RNA/
cDNA分子に付加させるため，十分にたくさんの種類
（配列）の分子バーコードを用いる．その後，分子バー コードが付加したRNA/cDNAを増幅し，増幅産物の RNA/cDNAの配列と分子バーコードをシークエンシン グする．従来法では，RNA/cDNAの配列から増幅産物 の数を計数するが，dRNA-Seqでは，分子バーコードの 種類の数を計数する．同じ分子バーコードをもつ増幅産 物は同じ分子から増幅されているため，分子バーコード 1種類の検出は，ノイズやバイアスの影響を受ける増幅 量にかかわらず，そのバーコードが付加された分子が増 幅前に1分子存在したことを意味する．したがって dRNA-Seqは，増幅前の絶対分子数を1分子の分解能で 測定するデジタル計測である．
正確な計測に必要な分子バーコードの種類数は，サン プル中に存在する同じ種類のRNAのコピー数や解析法 などに依存するが，バーコードとして10塩基程度のラ ンダム配列が用いられていることが多く，このとき（10 塩基の場合），バーコードは約10（〜46 10）種類である．
バーコード配列は，polyA付きRNAを逆転写する際に 用いられるpolyTプライマーの外側に挿入されている例
図1■Digital RNA Sequencing (dRNA-Seq)
（文献8を基に一部改変）
日本農芸化学会
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が多い．この場合，RNAの配列に依存するバーコード 付加のバイアスは小さいと思われる．polyAが付いてい ない種類のRNAにおいても，分子バーコードを付加す ることができれば，デジタル計測は可能である．なお，
バーコードを付加する際に配列などに依存したバイアス が生じる場合でも，試料間の比較は可能だと考えられ る．
このように，増幅産物をシークエンスしながらも，増 幅時のノイズやバイアスに依存せずに増幅前のRNA/
cDNAをゲノムワイドに定量することができるdRNA- Seqは，1999年に報告された，核酸を計数するデジタル PCR(4)をシステムワイドな計測へ発展させたものとも捉 えることができる．dRNA-Seqは既存のシークエンサを 用いることができるので，現在，世界でも広く使われ始 めている．しかしながら，高精度であるがゆえに実際の 測定においては注意も必要である．たとえば，用いる分 子バーコードの種類や数，シークエンシングのエラーな どが結果に影響する．筆者らは，より多数の分子を一度 に測定できる分子バーコードをデザインし，実験と解析 を重ねて測定系を評価して，高精度で安定したdRNA- Seqを実現している．
dRNA-Seqは，特にノイズが大きいとされる低コピー RNAの測定に有効である．そのため，1細胞解析におい てその威力を発揮している(5)．筆者らも，1〜100細胞の 測定を行うdRNA-Seqパイプラインを立ち上げ，免疫関 連の細胞などの遺伝子発現解析を多くの共同研究者の 方々と行っている．たとえば，さまざまな細胞種がそれ ぞれの役割を果たしている免疫システムの研究では，研 究の進展により細胞種をより細かく分けることができる ようになってきているが，これは同時に，得られる細胞 数やRNAの量が少なくなることも意味している．した がって，高精度のdRNA-Seqが有効となる．
核酸のデジタル計測について紹介してきたが，タンパ ク質を対象にした場合はどうであろうか．細胞内におい ては，大腸菌内に発現させた蛍光タンパク質一つひとつ が光学顕微鏡で検出されており，これはデジタル計測で ある(6)．さらに近年，タンパク質を検出するELISA
（Enzyme-linked immunosorbent assay）をデジタル化 した方法が野地博行博士の研究グループ（東京大学）に
より開発されている(7)．彼らは，デジタル化によるノイ ズの低減により，従来法より極めて優れた検出限界値を 得ている．このように，新しい技術の開発により，生体 分子のデジタル計測化が進められている．
生命をたくさんの要素から成り立つシステムと捉える 考え方が生まれ，たくさんの要素（遺伝子発現など）を 一度に網羅的に測定するハイスループットな計測法が開 発されてきている．網羅的に計測する場合，まずは全体 像を捉えることが優先されることも多く，個々の要素を より正確に計測することは次の課題とされてきた感も否 めない．しかし，少数の分子や細胞が全体の振る舞いに 影響を与える生命現象もあり，一つひとつの要素をより 正確に測定することが必要とされてきている．今後もこ れらを実現する測定技術の開発とともに，生命システム の理解が深まっていくであろう．
1) A. Mortazavi, B. A. Williams, K. McCue, L. Schaeffer &
B. Wold: , 5, 621 (2008).
2) T. Kivioja, A. Vähärautio, K. Karlsson, M. Bonke, M.
Enge, S. Linnarsson & J. Taipale: , 9, 72 (2012).
3) K. Shiroguchi, T. Z. Jia, P. A. Sims & X. S. Xie:
, 109, 1347 (2012).
4) B. Vogelstein & K. W. Kinzler:
, 96, 9236 (1999).
5) S. Islam, A. Zeisel, S. Joost, G. La Manno, P. Zajac, M.
Kasper, P. Lönnerberg & S. Linnarsson: , 11, 163 (2014).
6) J. Yu, J. Xiao, X. Ren, K. Lao & X. S. Xie: , 311, 1600 (2006).
7) S. H. Kim, S. Iwai, S. Araki, S. Sakakihara, R. Iino & H.
Noji: , 12, 4986 (2012).
8) 城口克之： , 24 (2), 21 (2016).
（城口克之，理化学研究所生命システム研究センター）
プロフィール
城口 克之（Katsuyuki SHIROGUCHI）
＜略歴＞日本学術振興会特別研究員／海外 特別研究員，Harvard University Postdoc などを経て現在に至る＜研究テーマと抱 負＞たくさんの細胞を正確に計測して，集 団・組織・個体の状態を同定する＜趣味＞
サッカー（選手&コーチ）＜研究室ホーム ページ＞http://guppy.riken.jp/index.html
Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.787
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